定量PCR检测缺失型DMD／BMD携带者的研究
作者：汪江 沈定国 蔡竖平 笪宇威
单位：汪江(电子部402医院内科，北京 100039)；沈定国 蔡竖平 笪宇威(解放军总医院神经内科肌病研究室，北京 100853)
关键词：聚合酶链反应；基因缺失；肌营养不良
军医进修学院学报000202 【摘要】目的：研究DMD/BMD携带者临床诊断的有效手段。方法：运用双重定量PCR及剂量系数分析，检测26例正常对照，7例肯定携带者和21例可疑携带者，部分结果与短片段重复顺序多态性方法及CK值作了比较。结果：确定了判定参考标准，可疑携带者中，患儿母亲检测阳性率为57.9%，8例经短串联重复顺序多态性分析，得到了完全验证。结论：定量PCR检测DMD/BMD携带者快速、敏感、准确，可在临床诊断中应用。
中图号：R746 文献标识码：A
, http://www.100md.com
文章编号：1005-1139(2000)02-0085-03
Carrier detection of Duchenne and Becker muscular dystrophy by quantitative multiplex PCR
SHENG Ding-guo,WANG Jiang,CAI Shu-ping
(Division of Neuromuscular Disorders Research,PLA General Hospital,Beijing 100853,China)
【Abstract】Objective:To study the efficient、fast and simple method to be used in the carrier detections of DMD/BMD.Methods:We developed the method of duplex quantitative PCR approach and DQ value to detecte deletion carriers of DMD/BMD.Parts of the results were compared with Short Tandem Repeat sequence PCR (STRs-PCR) method and CK value.Results:We determined the normal and abnormal reference value with analyses of 7 obligated deletion carriers,21 possible carriers and 26 normal female controls,and found entire coordinate in 8 female relatives whose status had been determined by STRs analysis.It has been shown that quantitative PCR is more sensitive than that of CK value.Conclusion:The quantitative duplex PCR assay is suitable for routine application.
, 百拇医药
Key words:polymerase chain reaction;gene deletion;muscular dystrophy
DMD/BMD为X连锁隐性遗传性致死性疾病，目前无有效治疗手段，阻止患儿出生为唯一有效方法，因此，女性携带者基因缺陷的筛选，成为DMD/BMD基因诊断研究中的重要一环，并在遗传咨询及产前诊断中具有重要意义。 90 年代定量PCR技术开始用于诊断DMD/BMD携带者[1,2],为深入研究该技术在缺失型DMD/BMD家族中的临床诊断价值，本研究运用定量PCR结合剂量系数(dosage quotient,DQ)[3]分析方法，对此方法的应用可行性进行了探讨。
1 对象和方法
1.1 研究对象
1.1.1 对照组 26 名女性，年龄 25～66 岁，平均年龄 41 岁，无DMD/BMD家族史，生育一个以上健康子女，血清CK正常。
, 百拇医药
1.1.2 携带者组 根据Bayesian系谱分析作为分组标准，即：生有一个患儿且母系家族中有另一个患病亲属者为肯定携带者；生有两名以上患儿，但家族中无其他患病亲属者为拟诊携带者；生有一个患儿但家族中无其它患病亲属，或未生育患儿但家族中有另一男性患者的均为可疑携带者。先用多重PCR筛选患儿是否存在基因缺失，将缺失型患儿母亲及女性亲属列入本实验组，分为肯定携带者及可疑携带者两组(由于拟诊携带者只有1例，本文将之并入可疑携带者组)，受检者年龄 29～48 岁，平均年龄 33 岁。肯定携带者 7 例， 5 例CK升高， 1 例正常，一例CK不详，可疑携带者 21 例，其中 10 例CK正常， 2 例CK升高， 9 例CK不详。
1.2 实验方法
抽取受检者外周血 5 ml，常规方法提取DNA。定量PCR所用 9 对引物根据Chamberlain文献合成[4]，短片段重复顺序多态性PCR，选择杂合率高的内含子 44， 45， 49， 50 四个位点，引物根据Clemens文献合成[5]。
, 百拇医药
1.2.1 定量PCR 50 μl 反应体系中，依次加入 10×反应缓冲液 5 μl，dNTP各 0.5 mmol/L，MgCl2 2.0 mmol/L，引物各 50 pmol，模板DNA 360～500 ng。预变性 97 ℃ 7 min，加入 3 U Taq酶，循环按 94 ℃ 45 s,55 ℃ 50 s，70 ℃ 2 min， 21 个循环，末次延伸为 70 ℃ 5 min。
1.2.2 短片段重复顺序多态性PCR 50 μl 反应体系含 10×反应缓冲液 5 μl，dNTP各 0.2 mmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，引物各 30 pmol，模板DNA 0.2～0.6 μg。Taq酶 2 U，循环按 94 ℃ 3 min，予变性，94 ℃ 45 s,53 ℃ 50 s，65 ℃ 3 min， 35 个循环，末次延伸为 65 ℃ 5 min。
1.2.3 结果测定 用 8% 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染鉴定定量PCR产物，用 6% 的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染鉴定 STR-PCR产物。将凝胶放在DENSITRON 20M 型光密度扫描仪上，以波长 570 nm，对每个样品每对外显子扫描，记录两扩增片段电泳带密度峰面积比值，按Yau公式计算剂量系数，DQ＝(样品缺失外显子峰面积/样品非缺失外显子峰面积)/(对照组相就两外显子峰面积比值)
, 百拇医药
受检位点如为双拷贝，DQ值理论上应为 1.0，缺失型携带者DQ值应为 0.5，样品依其DQ值在双拷贝范围还是在单拷贝范围而区分正常者或携带者。
1.2.4 CK值 血清CK值由解放军总医院生化科测定。
2 结 果
2.1 26 例正常对照组及 7 例肯定携带定量分析结果 见附表。
附表 26例正常者及7例肯定携带者定量PCR结果 分组
最大值
最小值
s±3s
, 百拇医药
正 常 者
1.260
0.731
1.019
0.134
0.674～1.364
肯定携带者
0.551
0.445
0.505
0.037
0.409～0.600
, 百拇医药 女性外显子 12 与 45 经双重定量PCR后，扫描峰面积比值的均值为 1.019，标准差为 0.134，说明dystrophin基因上这两个位点扩增产物的量相近，与理论值相符。为筛选携带者，确定较宽的正常人及携带者范围作为诊断参考值：即DQ在 0.674～1.364 为正常者，在 0.409～06600 者为携带者，DQ值在 0.601～0.673，不能确定诊断(附表)。
2.2 21 例可疑携带定量PCR检测结果 21 例可疑携带者中， 12 例剂量系数较正常者减半(DQ值 0.409～0.589)，确诊为基因缺失携带者， 9 例DQ值在 0.804～1.004，被诊断为正常者。其中 19 例为患儿的母亲，诊断阳性率 57.9%(11/19)。携带者及非携带者DQ值均落在 x±3s内，无一例在中界范围。
2.3 定量PCR与其它技术的比较
2.3.1 8 例短片段重复顺序多态性检测结果(STRs-PCR) 8 例受检女性经短片段重复顺序多态性方法检测，3 例确定为正常者， 5 例女性确定为基因缺失携带者，上述STRs-PCR结果与定量PCR检测结果完全相符。
, 百拇医药
2.3.2 CK与定量PCR方法的比较 在CK值明确的 18 例受检者中， 7 例CK升高者经定量分析确诊为携带者。 11 例CK值正常，其中 5 例经定量PCR确定为基因失携带者， 6 例未发现剂量系数变化，被诊断为正常者。诊断阳性率为 45% (5/11)。
3 讨 论
应用于DMD/BMD携带者基因检测多种技术中，各有优势但均存在一定局限。 90 年代定量PCR(quantitative PCR)开始用于诊断DMD/BMD携带者，有DMD基因缺失的女性携带者，缺失仅发生在一条X染色体上，因此，在携带者基因组DNA中，缺失外显子与非缺失外显子拷贝数量的比例为 1∶2，而正常女性为 1∶1[1～3]，因而可以终产物的比例关系推测dystrophin基因初始模板量的差别。迄今国外仅作了 200 余例研究工作[6～8]，国内在这方面尚未开展系统研究。
, http://www.100md.com
定量PCR诊断携带者的研究，早期用光密度扫描仪将缺失位点与正常位点扩增产物强度信号数值化，根据两者扫描峰面积比值判断结果。随着研究的深入，发现多种因素影响定量分析的准确性：①模板DNA初始浓度对于产物数量有一定影响；②扩增反应的循环数要保持在指数倍增期，以使产物数量直接反映靶序列的原始拷贝数；③不同外显子由于碱基序列及长度等原因，在同一扩增条件下得到的产物量极为不同。为解决这个问题， 1996 年Yau通过规范模板浓度，限定PCR反应的循环数，在一次实验中扩增样品组及对照组多个外显子，设置组内及组间对照，运用剂量系数(dosage quotient,DQ)处理方式等，最大限度地养活条件误差，从而准确反映初始模板比例关系，达到检测携带者的目的[3]。
国外部分报道用多对引物同时进行定量PCR分析，这不仅增加了实验难度，也提高了检测费用。本实验在定量PCR中引入DQ值的分析方法，在先证者缺失部位已明确的前提下，取先证者缺失部位外显子与非缺失部位外显子进行双重定量PCR，再和对照组比较。这一改进不但使该方法更为简单实用，也可达到诊断目的。在对 26 例正常女性及 7 例肯定携带者， 21 例可疑携带者进行分析后，确定了正常人及携带者的判定参考值，即：DQ值(剂量系数)在 0.674～1.364 为正常者，DQ值在 0.409～0.600 者为携带者，得出散发型DMD/BMD的母亲携带致病基因的风险率为 57.9%，与Ioannon等报道类似[1]。
, 百拇医药
短片段重复顺序多态性(STRs-PCR)方法为目前公认的检测DMD/BMD携带者的标准，因此，为证实定量PCR的可靠性，本实验将 8 例受检者定量PCR检测结果与短片段重复顺序多态性方法进行比较，得到了完全性验证，从而证明了定量PCR可靠性。
临床血清CK检查可筛选DMD基因携带者，然而因患者年龄，运动及不同生理时期等原因，CK值存在一定波动，有假阳性及假阴性结果。本组CK升高者均经定量PCR确诊为携带者， 45% (5/11)的CK正常者经定量分析明确为携带DMD基因。提示：定量PCR较血清CK检查敏感性高。
定量PCR简单、快速、敏感，覆盖了cDNA探针检测区域，可作为缺失型携带者基因检测的初筛实验在临床应用。由于不需精细的家系成员配合，更适合散发型家族。但定量PCR也存在不足，例如，由于存在生殖嵌合现象(germinal mosicism)和新突变情况，可能有 5.3%～9% 的误诊率[5，9]，应当在产前咨询中给予足够重视。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(3970258)
作者简介：沈定国，男，1939-08-06生，汉族，浙江萧山人，1962年北京医科大学毕业，解放军总医院神经内科肌病研究室主任医师、教授、博士生导师，中华神经肌病学组组长，撰写专著10部，发表学术论文80余篇。电话：(010)66937721
参考文献
1，Ioannous P,Christopoulos G,Panayides K.Detection of Duchenne and Becker muscular dystrophy carriers by quantitative multiplex polymerase chain reaction analysis[J].Neurology,1992,42:1783-1790.
2，Hiraishi Y,Kato S,Ishihara T.Quantitative Southern blot analysis in the dystrophin gene of Japanese patients with Duchenne or Becker muscular dystrophy: a high frequence of duplications [J].J Med Genet,1992,29:897-901.
, 百拇医药
3，Yau SC,Bobrow M,Mathew CG et al.Accurate diagnosis of carriers of deletions and duplications in Duchenne/Becker muscular dystrophy by flurocent dosage analysis[J].J Med Genet,1996,33:550-558.
4，Chamberlain JS,Gibbs RA,Ranier JE et al.Detection screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification[J].Nucleic Acids Res,1988,16:11141-11156.
5，Clemens PR,Fenwick RG,Chamberlain JS et al.Carrier detection and prenatal diagnosis in Duchenne and Becker dystrophin families using dinucleotide repeat polymorphisms[J].Am J Hum Genet,1991,49:951-960.
, http://www.100md.com
6，Prior TW,Papp AC,Snyder PJ et al.Determination of carrier status in Duchenne and Becker muscular dystrophies by quantitative polymerase chain reaction and allele-specific oligonucleotides[J].Clin Chem,1990,36:2113-2117.
7，Pastore L,Caporaso MG,Frisso G et al.A quantitative polymerase chain reaction (PCR) assay completely discriminations between Duchenne and Becker muscular dystrophy deleteion carriers and normal females [J].Molecular and Cellular Probes,1996,10:129-137.
, 百拇医药
8，Bronzova J,Todorova A,Kalaydjieva L.Detection of carriers of deletion in the dystrophin gene in Bulgarins DMD/BMD families[J].Hum Genet,1994,93:170-174.
9，Bakker E,Veenema H,Den Dunne JT et al.Germinal mosaicism increase the recurrence risk of ‘nwe’ Duchenne muscular dystrophy mutations [J].J Med Genet,1989,26:553-559.
收稿日期：1999-12-20
修回日期：2000-02-09, http://www.100md.com
单位：汪江(电子部402医院内科，北京 100039)；沈定国 蔡竖平 笪宇威(解放军总医院神经内科肌病研究室，北京 100853)
关键词：聚合酶链反应；基因缺失；肌营养不良
军医进修学院学报000202 【摘要】目的：研究DMD/BMD携带者临床诊断的有效手段。方法：运用双重定量PCR及剂量系数分析，检测26例正常对照，7例肯定携带者和21例可疑携带者，部分结果与短片段重复顺序多态性方法及CK值作了比较。结果：确定了判定参考标准，可疑携带者中，患儿母亲检测阳性率为57.9%，8例经短串联重复顺序多态性分析，得到了完全验证。结论：定量PCR检测DMD/BMD携带者快速、敏感、准确，可在临床诊断中应用。
中图号：R746 文献标识码：A
, http://www.100md.com
文章编号：1005-1139(2000)02-0085-03
Carrier detection of Duchenne and Becker muscular dystrophy by quantitative multiplex PCR
SHENG Ding-guo,WANG Jiang,CAI Shu-ping
(Division of Neuromuscular Disorders Research,PLA General Hospital,Beijing 100853,China)
【Abstract】Objective:To study the efficient、fast and simple method to be used in the carrier detections of DMD/BMD.Methods:We developed the method of duplex quantitative PCR approach and DQ value to detecte deletion carriers of DMD/BMD.Parts of the results were compared with Short Tandem Repeat sequence PCR (STRs-PCR) method and CK value.Results:We determined the normal and abnormal reference value with analyses of 7 obligated deletion carriers,21 possible carriers and 26 normal female controls,and found entire coordinate in 8 female relatives whose status had been determined by STRs analysis.It has been shown that quantitative PCR is more sensitive than that of CK value.Conclusion:The quantitative duplex PCR assay is suitable for routine application.
, 百拇医药
Key words:polymerase chain reaction;gene deletion;muscular dystrophy
DMD/BMD为X连锁隐性遗传性致死性疾病，目前无有效治疗手段，阻止患儿出生为唯一有效方法，因此，女性携带者基因缺陷的筛选，成为DMD/BMD基因诊断研究中的重要一环，并在遗传咨询及产前诊断中具有重要意义。 90 年代定量PCR技术开始用于诊断DMD/BMD携带者[1,2],为深入研究该技术在缺失型DMD/BMD家族中的临床诊断价值，本研究运用定量PCR结合剂量系数(dosage quotient,DQ)[3]分析方法，对此方法的应用可行性进行了探讨。
1 对象和方法
1.1 研究对象
1.1.1 对照组 26 名女性，年龄 25～66 岁，平均年龄 41 岁，无DMD/BMD家族史，生育一个以上健康子女，血清CK正常。
, 百拇医药
1.1.2 携带者组 根据Bayesian系谱分析作为分组标准，即：生有一个患儿且母系家族中有另一个患病亲属者为肯定携带者；生有两名以上患儿，但家族中无其他患病亲属者为拟诊携带者；生有一个患儿但家族中无其它患病亲属，或未生育患儿但家族中有另一男性患者的均为可疑携带者。先用多重PCR筛选患儿是否存在基因缺失，将缺失型患儿母亲及女性亲属列入本实验组，分为肯定携带者及可疑携带者两组(由于拟诊携带者只有1例，本文将之并入可疑携带者组)，受检者年龄 29～48 岁，平均年龄 33 岁。肯定携带者 7 例， 5 例CK升高， 1 例正常，一例CK不详，可疑携带者 21 例，其中 10 例CK正常， 2 例CK升高， 9 例CK不详。
1.2 实验方法
抽取受检者外周血 5 ml，常规方法提取DNA。定量PCR所用 9 对引物根据Chamberlain文献合成[4]，短片段重复顺序多态性PCR，选择杂合率高的内含子 44， 45， 49， 50 四个位点，引物根据Clemens文献合成[5]。
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1.2.1 定量PCR 50 μl 反应体系中，依次加入 10×反应缓冲液 5 μl，dNTP各 0.5 mmol/L，MgCl2 2.0 mmol/L，引物各 50 pmol，模板DNA 360～500 ng。预变性 97 ℃ 7 min，加入 3 U Taq酶，循环按 94 ℃ 45 s,55 ℃ 50 s，70 ℃ 2 min， 21 个循环，末次延伸为 70 ℃ 5 min。
1.2.2 短片段重复顺序多态性PCR 50 μl 反应体系含 10×反应缓冲液 5 μl，dNTP各 0.2 mmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，引物各 30 pmol，模板DNA 0.2～0.6 μg。Taq酶 2 U，循环按 94 ℃ 3 min，予变性，94 ℃ 45 s,53 ℃ 50 s，65 ℃ 3 min， 35 个循环，末次延伸为 65 ℃ 5 min。
1.2.3 结果测定 用 8% 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染鉴定定量PCR产物，用 6% 的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染鉴定 STR-PCR产物。将凝胶放在DENSITRON 20M 型光密度扫描仪上，以波长 570 nm，对每个样品每对外显子扫描，记录两扩增片段电泳带密度峰面积比值，按Yau公式计算剂量系数，DQ＝(样品缺失外显子峰面积/样品非缺失外显子峰面积)/(对照组相就两外显子峰面积比值)
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受检位点如为双拷贝，DQ值理论上应为 1.0，缺失型携带者DQ值应为 0.5，样品依其DQ值在双拷贝范围还是在单拷贝范围而区分正常者或携带者。
1.2.4 CK值 血清CK值由解放军总医院生化科测定。
2 结 果
2.1 26 例正常对照组及 7 例肯定携带定量分析结果 见附表。
附表 26例正常者及7例肯定携带者定量PCR结果 分组
最大值
最小值
s
±3s, 百拇医药
正 常 者
1.260
0.731
1.019
0.134
0.674～1.364
肯定携带者
0.551
0.445
0.505
0.037
0.409～0.600
, 百拇医药 女性外显子 12 与 45 经双重定量PCR后，扫描峰面积比值的均值为 1.019，标准差为 0.134，说明dystrophin基因上这两个位点扩增产物的量相近，与理论值相符。为筛选携带者，确定较宽的正常人及携带者范围作为诊断参考值：即DQ在 0.674～1.364 为正常者，在 0.409～06600 者为携带者，DQ值在 0.601～0.673，不能确定诊断(附表)。
2.2 21 例可疑携带定量PCR检测结果 21 例可疑携带者中， 12 例剂量系数较正常者减半(DQ值 0.409～0.589)，确诊为基因缺失携带者， 9 例DQ值在 0.804～1.004，被诊断为正常者。其中 19 例为患儿的母亲，诊断阳性率 57.9%(11/19)。携带者及非携带者DQ值均落在 x±3s内，无一例在中界范围。
2.3 定量PCR与其它技术的比较
2.3.1 8 例短片段重复顺序多态性检测结果(STRs-PCR) 8 例受检女性经短片段重复顺序多态性方法检测，3 例确定为正常者， 5 例女性确定为基因缺失携带者，上述STRs-PCR结果与定量PCR检测结果完全相符。
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2.3.2 CK与定量PCR方法的比较 在CK值明确的 18 例受检者中， 7 例CK升高者经定量分析确诊为携带者。 11 例CK值正常，其中 5 例经定量PCR确定为基因失携带者， 6 例未发现剂量系数变化，被诊断为正常者。诊断阳性率为 45% (5/11)。
3 讨 论
应用于DMD/BMD携带者基因检测多种技术中，各有优势但均存在一定局限。 90 年代定量PCR(quantitative PCR)开始用于诊断DMD/BMD携带者，有DMD基因缺失的女性携带者，缺失仅发生在一条X染色体上，因此，在携带者基因组DNA中，缺失外显子与非缺失外显子拷贝数量的比例为 1∶2，而正常女性为 1∶1[1～3]，因而可以终产物的比例关系推测dystrophin基因初始模板量的差别。迄今国外仅作了 200 余例研究工作[6～8]，国内在这方面尚未开展系统研究。
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定量PCR诊断携带者的研究，早期用光密度扫描仪将缺失位点与正常位点扩增产物强度信号数值化，根据两者扫描峰面积比值判断结果。随着研究的深入，发现多种因素影响定量分析的准确性：①模板DNA初始浓度对于产物数量有一定影响；②扩增反应的循环数要保持在指数倍增期，以使产物数量直接反映靶序列的原始拷贝数；③不同外显子由于碱基序列及长度等原因，在同一扩增条件下得到的产物量极为不同。为解决这个问题， 1996 年Yau通过规范模板浓度，限定PCR反应的循环数，在一次实验中扩增样品组及对照组多个外显子，设置组内及组间对照，运用剂量系数(dosage quotient,DQ)处理方式等，最大限度地养活条件误差，从而准确反映初始模板比例关系，达到检测携带者的目的[3]。
国外部分报道用多对引物同时进行定量PCR分析，这不仅增加了实验难度，也提高了检测费用。本实验在定量PCR中引入DQ值的分析方法，在先证者缺失部位已明确的前提下，取先证者缺失部位外显子与非缺失部位外显子进行双重定量PCR，再和对照组比较。这一改进不但使该方法更为简单实用，也可达到诊断目的。在对 26 例正常女性及 7 例肯定携带者， 21 例可疑携带者进行分析后，确定了正常人及携带者的判定参考值，即：DQ值(剂量系数)在 0.674～1.364 为正常者，DQ值在 0.409～0.600 者为携带者，得出散发型DMD/BMD的母亲携带致病基因的风险率为 57.9%，与Ioannon等报道类似[1]。
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短片段重复顺序多态性(STRs-PCR)方法为目前公认的检测DMD/BMD携带者的标准，因此，为证实定量PCR的可靠性，本实验将 8 例受检者定量PCR检测结果与短片段重复顺序多态性方法进行比较，得到了完全性验证，从而证明了定量PCR可靠性。
临床血清CK检查可筛选DMD基因携带者，然而因患者年龄，运动及不同生理时期等原因，CK值存在一定波动，有假阳性及假阴性结果。本组CK升高者均经定量PCR确诊为携带者， 45% (5/11)的CK正常者经定量分析明确为携带DMD基因。提示：定量PCR较血清CK检查敏感性高。
定量PCR简单、快速、敏感，覆盖了cDNA探针检测区域，可作为缺失型携带者基因检测的初筛实验在临床应用。由于不需精细的家系成员配合，更适合散发型家族。但定量PCR也存在不足，例如，由于存在生殖嵌合现象(germinal mosicism)和新突变情况，可能有 5.3%～9% 的误诊率[5，9]，应当在产前咨询中给予足够重视。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(3970258)
作者简介：沈定国，男，1939-08-06生，汉族，浙江萧山人，1962年北京医科大学毕业，解放军总医院神经内科肌病研究室主任医师、教授、博士生导师，中华神经肌病学组组长，撰写专著10部，发表学术论文80余篇。电话：(010)66937721
参考文献
1，Ioannous P,Christopoulos G,Panayides K.Detection of Duchenne and Becker muscular dystrophy carriers by quantitative multiplex polymerase chain reaction analysis[J].Neurology,1992,42:1783-1790.
2，Hiraishi Y,Kato S,Ishihara T.Quantitative Southern blot analysis in the dystrophin gene of Japanese patients with Duchenne or Becker muscular dystrophy: a high frequence of duplications [J].J Med Genet,1992,29:897-901.
, 百拇医药
3，Yau SC,Bobrow M,Mathew CG et al.Accurate diagnosis of carriers of deletions and duplications in Duchenne/Becker muscular dystrophy by flurocent dosage analysis[J].J Med Genet,1996,33:550-558.
4，Chamberlain JS,Gibbs RA,Ranier JE et al.Detection screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification[J].Nucleic Acids Res,1988,16:11141-11156.
5，Clemens PR,Fenwick RG,Chamberlain JS et al.Carrier detection and prenatal diagnosis in Duchenne and Becker dystrophin families using dinucleotide repeat polymorphisms[J].Am J Hum Genet,1991,49:951-960.
, http://www.100md.com
6，Prior TW,Papp AC,Snyder PJ et al.Determination of carrier status in Duchenne and Becker muscular dystrophies by quantitative polymerase chain reaction and allele-specific oligonucleotides[J].Clin Chem,1990,36:2113-2117.
7，Pastore L,Caporaso MG,Frisso G et al.A quantitative polymerase chain reaction (PCR) assay completely discriminations between Duchenne and Becker muscular dystrophy deleteion carriers and normal females [J].Molecular and Cellular Probes,1996,10:129-137.
, 百拇医药
8，Bronzova J,Todorova A,Kalaydjieva L.Detection of carriers of deletion in the dystrophin gene in Bulgarins DMD/BMD families[J].Hum Genet,1994,93:170-174.
9，Bakker E,Veenema H,Den Dunne JT et al.Germinal mosaicism increase the recurrence risk of ‘nwe’ Duchenne muscular dystrophy mutations [J].J Med Genet,1989,26:553-559.
收稿日期：1999-12-20
修回日期：2000-02-09, http://www.100md.com