多视场多参数形态定量分析模块在神经研究领域中的应用
作者：郑树森 李峰 姚志彬 谢瑶 陈以慈
单位：郑树森(中山医科大学图像分析室, 广东 广州 510089)；李峰 姚志彬 谢瑶 陈以慈(中山医科大学解剖学教研室脑研究室)
关键词：神经元；缺血；TUNEL；图像分析
中国医学物理学杂志000217 摘要： 缺血性神经元损伤的性质(凋亡或坏死)是神经研究领域关注的热点。但目前用于区 分凋亡与坏死细胞的TUNEL技术，较易受主观因素的影响。本实验用图像分析技术对缺血动 物脑的TUNEL染色切片进行多视场多参数形态定量分析，即细胞形态定量参数(核面积、周 长、直径、形状因子)和含量光密度(平均光密度、积分光密度)。本实验结果显示图像分 析技术能提高TUNEL鉴别凋亡与坏死细胞的灵敏度和精确性，并提供一种简便快捷的形态定 量方法，值得在神经研究领域中推广应用。
中图分类号：R741.02 文献标识码：A 文章编号：1005-202X( 2000)02-0106-02
, http://www.100md.com
Performance of image analysis system as a morphological quantitative method
LI Feng,YAO Zhi-bin， ZHEN Shu-Sen
(Department of Anatomy, Sun Yat-sen University of Medical Scienc es, Guangzhou 510089,China)
Abstract:It pays close attention to the mechanis ms of the ischemic neuronal dama ge in the field of neuroscience. TUNEL method which is used to discriminate apop totic cell death from necrotic one is easily influenced by many factors else. Th e present study measured neuronal damage on TUNEL slices by image cytometry afte r suffered with focal cerebral ischemia in vivo. It included morphological quant itative parameters (nucleus area, perimeter, diameter and form factor) and gray level. The data indicated that image analysis system may raise the sensitivity a nd precision of TUNEL method. As a good morphological quantitative method it sho uld be used to do some researches on neuroscience.
, http://www.100md.com
Key words: neuron；ischemia；TUNEL；image analys is
细胞凋亡和细胞坏死是两种不同的细胞死 亡过程和生物学现象，具有不同的分子生化机 制。区分缺血引起神经元凋亡或坏死直接影响到缺血性脑血管疾病的治疗策略，因此它是近 年来神经研究领域极为关注的问题。TUNEL(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Med iated dUTP-Biotin Nick End Labeling )方法是目前认为灵敏度较高的区别凋亡与坏死 的 分子生化技术，但它易受主观因素的影响。利用图像分析仪的多视场多参数形态定量分析模 块可对TUNEL染色切片进行定量测定，明显提高该方法的精确性。
1 材料与方法
1.1 大脑中动脉(MCA)缺血再灌流模型制作方法
, http://www.100md.com 大鼠麻醉状态下，结扎并切断右侧颈外动脉(ECA)，从ECA残端插入尼龙线栓子至MC A起始端，阻断MCA血供。再灌流时，从ECA残端将存留的尼龙线栓尾端轻轻拔出恢复MCA血供 。假手术组除不插尼龙线栓外其余步骤同上。
1.2 实验动物分组：
健康成年雄性SD大鼠，体重250～400 g，随机分为4组：(1)缺血1.5 h 后，再灌流24 h(n＝15)；(2)缺血3 h后，再灌流24 h(n＝15)；(3)缺血6 h后，再灌流24 h(n＝15)；(4)假手术组(n＝5)。
1.3 TUNEL染色方法
全脑石蜡切片在含有TdT和dUTP的TUNEL反应混合液(标记Ⅰ抗，Boehringer公司)中孵育60 min，37℃。经Converter-AP(Anti-fluorescein Antibody Conjugated with Alkaline Phosphatase)(标记Ⅱ抗, Boehringer公司)孵育30 min， 37℃。在NBT/BCIP(Boehringer 公司) 溶液中浸泡显色5-15 min，室温。0.1%快绿复染，脱水透明封片。
, http://www.100md.com
1.4 自动图像分析技术(Aut omatic Image Analysis Technique, AIAT)定量检测方法
在Carl Zeiss(蔡司)Axiotron研究型显微镜下(20×),每例动物选择20张TUNEL染色 切片，在每张切片的尾壳核、额顶皮质区随机选择3个视野，用 VarioCam冷摄像机输入IBAS Rel 2.0全自动图像分析系统(德国)，并显示在荧光屏上。用光笔沿核膜绘出细胞核的轮 廓，经图像处理后，分别得到凋亡、坏死和正常神经元的细胞异型参数(核面积、周长、最 大直径、最小直径、平均直径和形状因子)以及数密度、面积密度、平均光密度、积分光密 度。
2 结果
TUNEL 染色切片显示凋亡神经元 (AN)出现核染色质凝集，在核膜下聚集成环形或新月形， 细胞核体积缩小变形，染色呈深棕色。坏死神经元(NN)形态与AN明显不同 ，前者胞核肿 胀肥大，为圆形或椭圆形，呈弥散的淡棕色。正常神经元胞核体积无改变，呈圆形或锥体形 ，可见浅棕色分散细颗粒。尾壳核、皮质内AN、NN和正常神经元的形状因子、面数密度以及 积分光密度见表1、2、3。
, 百拇医药
统计结果表明，无论在尾壳核或皮质，AN、NN和正常神经元间的形状因子(FF)存在差异( P<0.05),提示FF可作为区分凋亡、坏死和正常神经元的一个有效参数，而且缺血6 h组 ，AN与NN间存在显著性差异(P<0.01),说明随缺血时间延长，细胞核形态改变更明显 ，即AN胞核皱缩变小(FF减小)；NN则肿胀肥大(FF增大)。AN、NN面数密度变化显示缺血 3 h组与其它时间组存在显著性差异(P<0.01)，而缺血6 h组大于缺血1.5 h组(P <0.05)，但小于缺血3 h组(P<0.01)，提示缺血3 h时，AN、NN增加明显，但随着缺 血时间延长，细胞开始 丢失。AN的平均光密度大于NN(P<0.01)，而积分光密度则小于NN(P<0.01)，这 表明AN胞 核TUNEL染色强度和含量增加，但核面积变小。正常神经元平均光密度处于AN和NN之间(P <0 .01)，由于正常神经元胞核无肥大或皱缩，因而积分光密度也处于AN与NN之间(P<0.0 1)。
表1 尾壳核、皮质AN和NN形状因子
, 百拇医药
尾壳核
皮 质
NN
AN
NN
AN
缺血1.5h
0.78±0.03
0.61±0.14
0.76±0.06
0.65±0.06
缺血3.0h
0.74±0.12
, 百拇医药
0.62±0.11
0.71±0.09
0.58±0.08
缺血6.0h
0.76±0.05
0.51±0.16
0.73±0.13
0.54±0.09
对照组
0.68±9.38E-2
0.66±3.21E-2
注：①E-2表示10-2；②对照组形状因子参数为正常神经元所有
, 百拇医药
表2 尾壳核、皮质AN和NN面数密度
尾壳核
皮 质
NN
AN
NN
AN
缺血1.5h
0.76±0.19
2.35±0.29
0.89±0.11
1.64±0.19
, 百拇医药
缺血3.0h
3.45±0.11
5.79±0.29
1.78±0.26
3.22±0.45
缺血6.0h
2.17±0.25
4.62±0.43
0.50±0.45
2.26±0.24
对照组
1.90E-2
, 百拇医药
2.63E-2
1.03E-2
1.40E-2
±1.10E-2
±3.42E-2
±1.20E-2
±2.10E-2
注：E-2表示10-2.
表3 尾壳核、皮质AN和NN积分光密度
尾壳核
皮 质
NN
, http://www.100md.com
AN
NN
AN
缺血1.5h
97.01± 8.64
35.83±5.96
91.09±9.26
42.40±7.03
缺血3.0h
92.42± 7.51
34.40±6.39
90.61±8.31
, 百拇医药
32.95±5.91
缺血6.0h
89.86±11.76
28.77±4.62
87.72±6.45
32.85±3.22
对照组
69.99±6.77
69.22±6.83
注：对照组积分光密度值为正常神经元所有
3 讨论
凋亡与坏死是两种不同的细胞死亡方式，并被不同的死亡机制所操纵，因此如能证实缺血诱 导的神经元死亡是凋亡，则可通过干预细胞凋亡的进程，挽救垂死的神经元，达到治疗神经 系统疾病的目的。但由于凋亡细胞与坏死细胞无论在形态或生化改变等特性方面都有许多相 似之处[1]，因此单纯依靠形态学方法或生化方法都难以较好地鉴别两类细胞。TUN EL方法是 目前认为灵敏度较高的区别凋亡与坏死的分子生化技术，它是将凋亡细胞DNA片段化的生化 特征性改变用形态学指标反映出来。但众所周知，在分析细胞形态变化时，一般需要成百上 千个细胞的观察才能找出规律性的东西，而图像分析仪可简便快捷的自动采集多幅图像，进 行多视场分析，而且通过研究者自行建立的计算机自动分析模块能快速地获得多项重要参数 ，进行多参数分析[2]。细胞凋亡时，钙依赖性核酸内切酶被激活[3]，将 核内DNA降解为 180～200 bp单核小体或180～200 bp整数倍的寡聚核小体，产生与DNA断裂 点数目相同的许多3'-O H末端，通过末端脱氧核苷酸转移酶将带有荧光素标记的脱氧鸟苷三磷酸连接到断裂DNA片段 的3'-OH末端，再与抗荧光素抗体特异结合，抗体连接的碱性磷酸酶使底物NBT/BCIP显色 [4]。由于凋亡细胞DNA断裂点大量增加，标记部位增多，因此细胞核染色加深。但坏 死细胞由 于核膜完整性被破坏，随机降解为任意长度的DNA碎片也可被标记。正常神经元又由于胞核 内通常也存在极少量的DNA 3'- OH末端，因此也能部分被标记。那么，使用TUNEL技术时， 如何区分凋亡、坏死和正常三类细胞，以往的研究多是根据显微镜下肉眼观察的标记部位多 少(强度或含量)来判断，这往往易受主观因素的影响。图像分析仪则提供了多参数的综合 分析指标，并以数字化形式反映出来，避免了免疫组化、酶标或荧光染色使用的传统定性或 半定量方法[5]，如-、+、++、+++。如凋亡细胞由于核染色加深，积分光密度值 就减小，同 时由于凋亡细胞核皱缩变小，且严重变形，使形状因子减小。坏死细胞则不然，坏死细胞的 核膜破坏， DNA碎片可逸出细胞核，使细胞浆也呈阳性反应，因而核染色呈现大而弥散的浅 棕色，此时，积分光密度值增大，形状因子也变大。正常神经元由于无DNA扩散，核面积无 改变，因此积分光密度和形状因子均介于凋亡和坏死神经元之间。
, http://www.100md.com
图像分析仪还可自动减除切片背景的非特异性着色(灰度)[6]，这对TUNEL染色尤 为重要， 因为TUNEL本身就是根据凋亡与坏死细胞DNA片段标记点的数目(染色强度)来区分两类细胞 的，因此不同切片的背景灰度可对实验结果产生明显的影响，这是人工计数细胞最难以避免 的问题。
细胞核形状因子是根据核周长和面积求出的，因此能客观的反映核变化的不规则程度。当细 胞核为圆形时，形状因子最大，等于1；细胞核形状愈不规则，形状因子愈小。以往的研究 用核平均直径反映核面积的大小，由于凋亡细胞是以其核缩小、变形(新月形等)为主要特 征，因此核平均直径不能真实反映出这种变化，而形状因子则不然，本实验结果就证实随缺 血时间延长，核不规则程度越大，形状因子则越小。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39470266 )
作者简介：李峰(1955年生)，女， 河北省河间县人，博士，副教授，硕士生导师，从事分子神经病理学研究.
, http://www.100md.com
参考文献:
[1]Charriaut MC,et al.Apoptosis and necrosis after reversible focal ischemia:a role apoptosis[J] J Cereb Blood Flow Metab.1996,16:195.
[2]曹杰,等.自动化图像分析技术在胃肠肿瘤临床中的应用前景[J].实用癌 症杂志.1995,10(2)：143.
[3] Charriaut MC,et al. Early endonuclease activation following reve rsible focal ischemia[J]. J Cereb Blood Flow Metab.1996,15:385.
[4] Gavrieli Y, et al. Identification of programmed cell death in si tu via spacific labelling of nuclear DNA fragmentation[J]. J Cell Biol. 1992,11 9:493.
[5] Haroske G, et al. Prognostic significance of image cytometry DNA parameters in tissue sections from breast and gastric cancer[J]. Anal Cell Pathol. 1991 ,3:11.
[6] 申洪.免疫组织化学染色定量方法研究(Ⅲ)[J].中国组织化学与细胞 化学杂志.1995，4(1)：89.
收稿日期：1999-07-07, 百拇医药
单位：郑树森(中山医科大学图像分析室, 广东 广州 510089)；李峰 姚志彬 谢瑶 陈以慈(中山医科大学解剖学教研室脑研究室)
关键词：神经元；缺血；TUNEL；图像分析
中国医学物理学杂志000217 摘要： 缺血性神经元损伤的性质(凋亡或坏死)是神经研究领域关注的热点。但目前用于区 分凋亡与坏死细胞的TUNEL技术，较易受主观因素的影响。本实验用图像分析技术对缺血动 物脑的TUNEL染色切片进行多视场多参数形态定量分析，即细胞形态定量参数(核面积、周 长、直径、形状因子)和含量光密度(平均光密度、积分光密度)。本实验结果显示图像分 析技术能提高TUNEL鉴别凋亡与坏死细胞的灵敏度和精确性，并提供一种简便快捷的形态定 量方法，值得在神经研究领域中推广应用。
中图分类号：R741.02 文献标识码：A 文章编号：1005-202X( 2000)02-0106-02
, http://www.100md.com
Performance of image analysis system as a morphological quantitative method
LI Feng,YAO Zhi-bin， ZHEN Shu-Sen
(Department of Anatomy, Sun Yat-sen University of Medical Scienc es, Guangzhou 510089,China)
Abstract:It pays close attention to the mechanis ms of the ischemic neuronal dama ge in the field of neuroscience. TUNEL method which is used to discriminate apop totic cell death from necrotic one is easily influenced by many factors else. Th e present study measured neuronal damage on TUNEL slices by image cytometry afte r suffered with focal cerebral ischemia in vivo. It included morphological quant itative parameters (nucleus area, perimeter, diameter and form factor) and gray level. The data indicated that image analysis system may raise the sensitivity a nd precision of TUNEL method. As a good morphological quantitative method it sho uld be used to do some researches on neuroscience.
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Key words: neuron；ischemia；TUNEL；image analys is
细胞凋亡和细胞坏死是两种不同的细胞死 亡过程和生物学现象，具有不同的分子生化机 制。区分缺血引起神经元凋亡或坏死直接影响到缺血性脑血管疾病的治疗策略，因此它是近 年来神经研究领域极为关注的问题。TUNEL(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Med iated dUTP-Biotin Nick End Labeling )方法是目前认为灵敏度较高的区别凋亡与坏死 的 分子生化技术，但它易受主观因素的影响。利用图像分析仪的多视场多参数形态定量分析模 块可对TUNEL染色切片进行定量测定，明显提高该方法的精确性。
1 材料与方法
1.1 大脑中动脉(MCA)缺血再灌流模型制作方法
, http://www.100md.com 大鼠麻醉状态下，结扎并切断右侧颈外动脉(ECA)，从ECA残端插入尼龙线栓子至MC A起始端，阻断MCA血供。再灌流时，从ECA残端将存留的尼龙线栓尾端轻轻拔出恢复MCA血供 。假手术组除不插尼龙线栓外其余步骤同上。
1.2 实验动物分组：
健康成年雄性SD大鼠，体重250～400 g，随机分为4组：(1)缺血1.5 h 后，再灌流24 h(n＝15)；(2)缺血3 h后，再灌流24 h(n＝15)；(3)缺血6 h后，再灌流24 h(n＝15)；(4)假手术组(n＝5)。
1.3 TUNEL染色方法
全脑石蜡切片在含有TdT和dUTP的TUNEL反应混合液(标记Ⅰ抗，Boehringer公司)中孵育60 min，37℃。经Converter-AP(Anti-fluorescein Antibody Conjugated with Alkaline Phosphatase)(标记Ⅱ抗, Boehringer公司)孵育30 min， 37℃。在NBT/BCIP(Boehringer 公司) 溶液中浸泡显色5-15 min，室温。0.1%快绿复染，脱水透明封片。
, http://www.100md.com
1.4 自动图像分析技术(Aut omatic Image Analysis Technique, AIAT)定量检测方法
在Carl Zeiss(蔡司)Axiotron研究型显微镜下(20×),每例动物选择20张TUNEL染色 切片，在每张切片的尾壳核、额顶皮质区随机选择3个视野，用 VarioCam冷摄像机输入IBAS Rel 2.0全自动图像分析系统(德国)，并显示在荧光屏上。用光笔沿核膜绘出细胞核的轮 廓，经图像处理后，分别得到凋亡、坏死和正常神经元的细胞异型参数(核面积、周长、最 大直径、最小直径、平均直径和形状因子)以及数密度、面积密度、平均光密度、积分光密 度。
2 结果
TUNEL 染色切片显示凋亡神经元 (AN)出现核染色质凝集，在核膜下聚集成环形或新月形， 细胞核体积缩小变形，染色呈深棕色。坏死神经元(NN)形态与AN明显不同 ，前者胞核肿 胀肥大，为圆形或椭圆形，呈弥散的淡棕色。正常神经元胞核体积无改变，呈圆形或锥体形 ，可见浅棕色分散细颗粒。尾壳核、皮质内AN、NN和正常神经元的形状因子、面数密度以及 积分光密度见表1、2、3。
, 百拇医药
统计结果表明，无论在尾壳核或皮质，AN、NN和正常神经元间的形状因子(FF)存在差异( P<0.05),提示FF可作为区分凋亡、坏死和正常神经元的一个有效参数，而且缺血6 h组 ，AN与NN间存在显著性差异(P<0.01),说明随缺血时间延长，细胞核形态改变更明显 ，即AN胞核皱缩变小(FF减小)；NN则肿胀肥大(FF增大)。AN、NN面数密度变化显示缺血 3 h组与其它时间组存在显著性差异(P<0.01)，而缺血6 h组大于缺血1.5 h组(P <0.05)，但小于缺血3 h组(P<0.01)，提示缺血3 h时，AN、NN增加明显，但随着缺 血时间延长，细胞开始 丢失。AN的平均光密度大于NN(P<0.01)，而积分光密度则小于NN(P<0.01)，这 表明AN胞 核TUNEL染色强度和含量增加，但核面积变小。正常神经元平均光密度处于AN和NN之间(P <0 .01)，由于正常神经元胞核无肥大或皱缩，因而积分光密度也处于AN与NN之间(P<0.0 1)。
表1 尾壳核、皮质AN和NN形状因子
, 百拇医药
尾壳核
皮 质
NN
AN
NN
AN
缺血1.5h
0.78±0.03
0.61±0.14
0.76±0.06
0.65±0.06
缺血3.0h
0.74±0.12
, 百拇医药
0.62±0.11
0.71±0.09
0.58±0.08
缺血6.0h
0.76±0.05
0.51±0.16
0.73±0.13
0.54±0.09
对照组
0.68±9.38E-2
0.66±3.21E-2
注：①E-2表示10-2；②对照组形状因子参数为正常神经元所有
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表2 尾壳核、皮质AN和NN面数密度
尾壳核
皮 质
NN
AN
NN
AN
缺血1.5h
0.76±0.19
2.35±0.29
0.89±0.11
1.64±0.19
, 百拇医药
缺血3.0h
3.45±0.11
5.79±0.29
1.78±0.26
3.22±0.45
缺血6.0h
2.17±0.25
4.62±0.43
0.50±0.45
2.26±0.24
对照组
1.90E-2
, 百拇医药
2.63E-2
1.03E-2
1.40E-2
±1.10E-2
±3.42E-2
±1.20E-2
±2.10E-2
注：E-2表示10-2.
表3 尾壳核、皮质AN和NN积分光密度
尾壳核
皮 质
NN
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AN
NN
AN
缺血1.5h
97.01± 8.64
35.83±5.96
91.09±9.26
42.40±7.03
缺血3.0h
92.42± 7.51
34.40±6.39
90.61±8.31
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32.95±5.91
缺血6.0h
89.86±11.76
28.77±4.62
87.72±6.45
32.85±3.22
对照组
69.99±6.77
69.22±6.83
注：对照组积分光密度值为正常神经元所有
3 讨论
凋亡与坏死是两种不同的细胞死亡方式，并被不同的死亡机制所操纵，因此如能证实缺血诱 导的神经元死亡是凋亡，则可通过干预细胞凋亡的进程，挽救垂死的神经元，达到治疗神经 系统疾病的目的。但由于凋亡细胞与坏死细胞无论在形态或生化改变等特性方面都有许多相 似之处[1]，因此单纯依靠形态学方法或生化方法都难以较好地鉴别两类细胞。TUN EL方法是 目前认为灵敏度较高的区别凋亡与坏死的分子生化技术，它是将凋亡细胞DNA片段化的生化 特征性改变用形态学指标反映出来。但众所周知，在分析细胞形态变化时，一般需要成百上 千个细胞的观察才能找出规律性的东西，而图像分析仪可简便快捷的自动采集多幅图像，进 行多视场分析，而且通过研究者自行建立的计算机自动分析模块能快速地获得多项重要参数 ，进行多参数分析[2]。细胞凋亡时，钙依赖性核酸内切酶被激活[3]，将 核内DNA降解为 180～200 bp单核小体或180～200 bp整数倍的寡聚核小体，产生与DNA断裂 点数目相同的许多3'-O H末端，通过末端脱氧核苷酸转移酶将带有荧光素标记的脱氧鸟苷三磷酸连接到断裂DNA片段 的3'-OH末端，再与抗荧光素抗体特异结合，抗体连接的碱性磷酸酶使底物NBT/BCIP显色 [4]。由于凋亡细胞DNA断裂点大量增加，标记部位增多，因此细胞核染色加深。但坏 死细胞由 于核膜完整性被破坏，随机降解为任意长度的DNA碎片也可被标记。正常神经元又由于胞核 内通常也存在极少量的DNA 3'- OH末端，因此也能部分被标记。那么，使用TUNEL技术时， 如何区分凋亡、坏死和正常三类细胞，以往的研究多是根据显微镜下肉眼观察的标记部位多 少(强度或含量)来判断，这往往易受主观因素的影响。图像分析仪则提供了多参数的综合 分析指标，并以数字化形式反映出来，避免了免疫组化、酶标或荧光染色使用的传统定性或 半定量方法[5]，如-、+、++、+++。如凋亡细胞由于核染色加深，积分光密度值 就减小，同 时由于凋亡细胞核皱缩变小，且严重变形，使形状因子减小。坏死细胞则不然，坏死细胞的 核膜破坏， DNA碎片可逸出细胞核，使细胞浆也呈阳性反应，因而核染色呈现大而弥散的浅 棕色，此时，积分光密度值增大，形状因子也变大。正常神经元由于无DNA扩散，核面积无 改变，因此积分光密度和形状因子均介于凋亡和坏死神经元之间。
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图像分析仪还可自动减除切片背景的非特异性着色(灰度)[6]，这对TUNEL染色尤 为重要， 因为TUNEL本身就是根据凋亡与坏死细胞DNA片段标记点的数目(染色强度)来区分两类细胞 的，因此不同切片的背景灰度可对实验结果产生明显的影响，这是人工计数细胞最难以避免 的问题。
细胞核形状因子是根据核周长和面积求出的，因此能客观的反映核变化的不规则程度。当细 胞核为圆形时，形状因子最大，等于1；细胞核形状愈不规则，形状因子愈小。以往的研究 用核平均直径反映核面积的大小，由于凋亡细胞是以其核缩小、变形(新月形等)为主要特 征，因此核平均直径不能真实反映出这种变化，而形状因子则不然，本实验结果就证实随缺 血时间延长，核不规则程度越大，形状因子则越小。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39470266 )
作者简介：李峰(1955年生)，女， 河北省河间县人，博士，副教授，硕士生导师，从事分子神经病理学研究.
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参考文献:
[1]Charriaut MC,et al.Apoptosis and necrosis after reversible focal ischemia:a role apoptosis[J] J Cereb Blood Flow Metab.1996,16:195.
[2]曹杰,等.自动化图像分析技术在胃肠肿瘤临床中的应用前景[J].实用癌 症杂志.1995,10(2)：143.
[3] Charriaut MC,et al. Early endonuclease activation following reve rsible focal ischemia[J]. J Cereb Blood Flow Metab.1996,15:385.
[4] Gavrieli Y, et al. Identification of programmed cell death in si tu via spacific labelling of nuclear DNA fragmentation[J]. J Cell Biol. 1992,11 9:493.
[5] Haroske G, et al. Prognostic significance of image cytometry DNA parameters in tissue sections from breast and gastric cancer[J]. Anal Cell Pathol. 1991 ,3:11.
[6] 申洪.免疫组织化学染色定量方法研究(Ⅲ)[J].中国组织化学与细胞 化学杂志.1995，4(1)：89.
收稿日期：1999-07-07, 百拇医药