庚型肝炎病毒转基因小鼠的建立
作者：胡卫江 戚中田 胡以平 朱分禄 李建秀 陈景山
单位：第二军医大学微生物学教研室，上海 200433
关键词：庚型肝炎病毒；转基因小鼠；致病性
中国病毒学000205 摘要：利用受精卵原核显微注射的方法，产生了含有HGV结构蛋白C、E1、E2及部分非结构蛋白NS2、NS3的转基因小鼠。得到10只founder小鼠，其中有3只founder小鼠与正常小鼠交配后得到了整合有外源基因的F1代阳性小鼠。RT-PCR的结果显示，外源基因可在founder小鼠及F1代小鼠的血液有核细胞及肝细胞内转录；组织病理学检查显示，某些转基因小鼠的肝细胞出现了水样变、脂肪变性及轻微炎性反应等病理学改变，但与同一品系的正常小鼠相比，转基因小鼠血清转氨酶无明显升高。
中图分类号：R332，R512.6 文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1003-5125(2000)02-0122-05
Establishment of Transgenic Mouse Model Carrying HGV Genes
HU Wei-jiang,QI Zhong-tian,ZHU Fen-lu,CHEN Jing-shan
(Department of Microbiology,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)
HU Yi-ping,LI Jian-xiu
(Department of Cell Biology,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)
, 百拇医药
Abstract:The target fragment of HGV genes including C,E1,E2,NS2 and partial NS3 regions was microinjected into the pronuclei of mouse fertilized eggs according to the standard methods.Ten mice containing the HGV genes were identified by the screening of polymerase chain reaction with the primers in NS3 region.The integrated HGV genes were vertically transmitted to the offspring,and the F1 heterozygous mice from three founders were detected positive.The results of RT-PCR indicated that the HGV genes can be transcripted in blood monocytes and hepatocytes.The conventional pathological observation suggested that the transgenic mice had the cloudy swelling,steatosis,hydropic change and inflammatory cellular infiltration.However,serum ATL level showed no significant difference between transgenic and normal mice.
, 百拇医药
Key words:Hepatitis G virus; Transgenic mouse; Pathogenicity
1995～1996年，美国科学家采用分子病毒学技术，先后分离到两株肝炎相关病毒，分别称为GB病毒C型(GBV-C)和庚型肝炎病毒(HGV)[1～3]，两者的同源性很高，被认为是黄病毒科的一个新种，GBV-C/HGV是该病毒的两个不同分离株。HGV是单股正链RNA病毒，病毒基因全长约9.4kb，含有单个开放读码框架。编码约2900个氨基酸的病毒多蛋白前体，该前体经加工后形成E1、E2、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B等病毒蛋白。1996年《Science》杂志上发表的论文认为这种病毒可能与输血后肝炎及其他急慢性肝炎有关[3]。然而随后的研究报道就对HGV的致病性产生了疑问，并提出了HGV是否是肝炎病毒的问题[4～6]。为进一步研究HGV的致病性，我们构建了含有HGV基因的全部结构蛋白和部分非结构蛋白的转基因小鼠，现报道如下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
实验用小鼠购自上海市计划生育研究所，供体小鼠品系为C57，受体小鼠品系为Balb/c；限制性内切酶购自GIBCO BRL公司，实验用质粒p3.1 HGV-NS3由本实验室构建；PCR及RT-PCR试剂购自SANGO公司；DNA抽提试剂为常规试剂；RNA抽提试剂TRIzol购自GIBCO公司；凝胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司；引物根据PC-GENE软件自行设计，上游引物位于NS3区3660～3678位，下游引物位于NS3区4400～4422位，由中国科学院上海植物生理所合成。病理学制片所用试剂为常规试剂。
1.2 方法
1.2.1 目的基因片段的获得 将质粒p3.1 HGV-NS3鉴定后，用限制性内切酶Sal I和Xmn I酶切，得到了大小不同的五个片段，分别为34bp及0.3、1.5、1.9、5.6kb。其中5.6kb条带为目的基因片段，将酶切后的DNA进行电泳分析，待五条带完全分开后，用凝胶回收试剂盒回收5.6kb目的基因片段，溶于显微注射用TE buffer (pH 8.0)，备用(图1)。
, 百拇医药
1.2.2 显微注射产生转基因小鼠 依常规方法进行显微注射[8]。在供体鼠和受体假孕鼠准备好后，处死供体母鼠后取出受精卵，在显微注射仪下将目的基因片段注射至C57供体小鼠受精卵的雄原核中，随后将显微注射操作过的受精卵移至假孕的Balb/c母鼠输卵管内，待其产仔。
1.2.3 HGV转基因小鼠外源基因的复制和转录 小鼠出生二周后，抽取尾组织基因组DNA进行PCR鉴定，PCR反应条件为：94℃ 3min； 94℃ 1min，55℃ 1min; 72℃ 1min 10s；32个循环。将PCR鉴定为阳性的转基因小鼠与同一品系的正常小鼠交配，以产生子代小鼠。然后取PCR反应为阳性的部分F0及F1代转基因小鼠的肝、肾组织及血细胞，用TRIzol试剂抽提各个组织的RNA，进行反转录PCR反应。反转录反应的条件为：42℃ 30min；随后将反转录产物作为PCR反应的底物进行PCR反应。反应条件与上相同。
, 百拇医药 1.2.4 转基因小鼠的病理学研究 于鼠龄6个月时，将转基因小鼠各个组织取材，固定于15%的福尔马林固定液中，进行常规H.E染色的病理学切片分析。
2 结果
2.1 转基因小鼠的产生
共注射233只受精卵，注射后存活的受精卵150只，存活率为74.3%；对9只假孕母鼠进行单侧输卵管移植，其中6只怀孕，怀孕率为67.1%；共产生28只子鼠，存活25只，存活率为89.3%；对所得到的25只小鼠尾组织基因组DNA进行PCR扩增。其中有10只小鼠的PCR结果出现760bp左右的特异型条带，即得到了10只founder小鼠，外源基因整合率为40%。
2.2 外源基因的复制
将F0代的阳性小鼠与同一品系的正常小鼠交配后，其中3只F0代的阳性小鼠得到了F1代的阳性小鼠，F1代小鼠阳性率为45%，另有两只F0代的阳性小鼠不孕(图2)。
, 百拇医药
2.3 外源基因的转录
RT-PCR的结果显示(图3)，外源基因可以在肝细胞和单核细胞内转录，并在760bp处出现特异性条带。肾组织内则未见阳性条带。
2.4 病理学改变
所取6只转基因小鼠样本，包括肝、肾、心脏、皮肤、脾等多种组织，其中一只小鼠出现脂肪变性，二只小鼠出现较严重的水样变，其中一只有小灶性的淋巴细胞浸润等轻型炎症反应。其它转基因小鼠表现无特殊异常(图4)。
图1 显微注射用目的片段
Fig.1 The target fragment for microinjection
, 百拇医药 1,λDNA/EcoR I+Hind Ⅲ;
3,p3.1 HGV-NS3/Sal I+Xmn I
图2 琼脂糖电泳检测部分转基因小鼠尾组织DNA的PCR扩增产物
Fig.2 The electrophoresis of tail tissue DNA PCR product in agarose gel
1,λDNA/EcoR I+Hind Ⅲ; 2,positive control;
3,negative control; 4～8.HGV transgenic mice
, 百拇医药
图3 琼脂糖电泳检测部分转基因小鼠血液单核细胞RT-PCR扩增产物
Fig.3 The electrophoresis of blood cell RNA RT-PCR product in agarose gel
1,λDNA/EcoR I+Hind Ⅲ; 2,positive control; 3,negative control; 4～8,HGV transgenic mice
图4 转基因小鼠体内的病理学改变
a,正常小鼠肝细胞； b,转基因小鼠肝细胞的脂肪变性； c,转基因小鼠肝细胞的水样变；
d,转基因小鼠肝细胞的肝小叶区的小灶性淋巴细胞浸润
, 百拇医药
Fig.4 Histopathological findings in HGV transgenic mouse liver a,age-matched negative littermate; b,steatosis in hepatocytes in transgenic mouse;
c,hydrogenic change in hepatocytes; d,lymphocyte filteration in hepatocytes of transgenic mouse
3 讨论
3.1 庚型肝炎病毒的嗜肝性分析
目前，有的研究认为HGV可能不是嗜肝病毒，而仅仅是一种肝脏过客性病毒。本实验的RT-PCR及组织病理学研究的初步结果说明，HGV基因的转录可能存在着一定的组织特异性， 因为RT-PCR的阳性特异带主要出现在肝细胞和血液有核细胞中， 肾脏中未见明显的阳性条带。明显的病理学改变也仅发生在肝细胞，其他组织无特殊异常。目前我们正在利用HGV完整基因组克隆[7]，构建含有HGV全基因组的转基因小鼠，以进一步研究HGV的组织细胞亲嗜性及HGV的其他特性。
, http://www.100md.com
3.2 HGV基因的整合位点与病理改变的关系
一般情况下，外源基因在转基因小鼠体内的整合位点是随机的，在本实验中，病理改变较严重的2只转基因小鼠，来自同一个founder小鼠及其后代。因此HGV在转基因小鼠体内的致病性是否与HGV基因的插入位点有关值得进一步的研究。
HGV转基因小鼠的工作还是刚刚开始，此体系的建立对HGV的复制、转录、嗜肝性及致病性的研究将有重要的意义。
国家自然科学基金资助(39825116,39770393,39830330);上海市科技发展基金盗用项目(98JC14023).
胡卫江(1667年-),女,河北张家口人,博士,讲师.主要从事乙型肝炎、庚型肝炎病毒转基因动物实验体系的研究.
参考文献
, http://www.100md.com
[1]金冬雁.庚型肝炎病毒是肝炎病毒吗[J].中华实验和临床病毒学杂志，1997，11(4)：301～305
[2]Leary TP,Muerhoff AS,Simons JN.Sequence and genomic organization of GBV-C:a novel member of the flaviviridae associated with human non-A-E hepatitis [J].J Med Virol,1996,48(1):60～67
[3]Linnen J,Wages J Jr,Zhang-Keck ZY.Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus:a transfusion-transmissible agent [J].Science,1996,271(5248):505～508
, 百拇医药
[4]Miyakawa Y,Mayumi M.Hepatitis G virus-a true hepatitis virus or an accidental tourist [J].NEJM,1997,336(11):795～796
[5]Theodore D,Lemon S M.GB virus C,hepatitis G virus,or human orphan flavirirus [J].Hepatology,1997,25(5):1285～1286
[6]Haydon GH,Jarvis LM,Simpson KJ.The clinical significance of the detection of hepatitis GBV-C RNA in the serum of patients with fulminant,presumed viral,hepatitis [J].J Viral Hepat,1997,4(1):45～49
[7]朱分禄，戚中田，等.庚型肝炎病毒基因组全长DNA的拼接与克隆[J].第二军医大学学报，1998，19(4)：301～306
[8]胡以平，秦世真，等.嵌合基因8KpF在转基因小鼠内的组织特异性表达[J].遗传学报,1992，19(1)：27
1999-02-08
1999-05-24, http://www.100md.com
单位：第二军医大学微生物学教研室，上海 200433
关键词：庚型肝炎病毒；转基因小鼠；致病性
中国病毒学000205 摘要：利用受精卵原核显微注射的方法，产生了含有HGV结构蛋白C、E1、E2及部分非结构蛋白NS2、NS3的转基因小鼠。得到10只founder小鼠，其中有3只founder小鼠与正常小鼠交配后得到了整合有外源基因的F1代阳性小鼠。RT-PCR的结果显示，外源基因可在founder小鼠及F1代小鼠的血液有核细胞及肝细胞内转录；组织病理学检查显示，某些转基因小鼠的肝细胞出现了水样变、脂肪变性及轻微炎性反应等病理学改变，但与同一品系的正常小鼠相比，转基因小鼠血清转氨酶无明显升高。
中图分类号：R332，R512.6 文献标识码：A
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文章编号：1003-5125(2000)02-0122-05
Establishment of Transgenic Mouse Model Carrying HGV Genes
HU Wei-jiang,QI Zhong-tian,ZHU Fen-lu,CHEN Jing-shan
(Department of Microbiology,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)
HU Yi-ping,LI Jian-xiu
(Department of Cell Biology,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)
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Abstract:The target fragment of HGV genes including C,E1,E2,NS2 and partial NS3 regions was microinjected into the pronuclei of mouse fertilized eggs according to the standard methods.Ten mice containing the HGV genes were identified by the screening of polymerase chain reaction with the primers in NS3 region.The integrated HGV genes were vertically transmitted to the offspring,and the F1 heterozygous mice from three founders were detected positive.The results of RT-PCR indicated that the HGV genes can be transcripted in blood monocytes and hepatocytes.The conventional pathological observation suggested that the transgenic mice had the cloudy swelling,steatosis,hydropic change and inflammatory cellular infiltration.However,serum ATL level showed no significant difference between transgenic and normal mice.
, 百拇医药
Key words:Hepatitis G virus; Transgenic mouse; Pathogenicity
1995～1996年，美国科学家采用分子病毒学技术，先后分离到两株肝炎相关病毒，分别称为GB病毒C型(GBV-C)和庚型肝炎病毒(HGV)[1～3]，两者的同源性很高，被认为是黄病毒科的一个新种，GBV-C/HGV是该病毒的两个不同分离株。HGV是单股正链RNA病毒，病毒基因全长约9.4kb，含有单个开放读码框架。编码约2900个氨基酸的病毒多蛋白前体，该前体经加工后形成E1、E2、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B等病毒蛋白。1996年《Science》杂志上发表的论文认为这种病毒可能与输血后肝炎及其他急慢性肝炎有关[3]。然而随后的研究报道就对HGV的致病性产生了疑问，并提出了HGV是否是肝炎病毒的问题[4～6]。为进一步研究HGV的致病性，我们构建了含有HGV基因的全部结构蛋白和部分非结构蛋白的转基因小鼠，现报道如下。
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1 材料与方法
1.1 材料
实验用小鼠购自上海市计划生育研究所，供体小鼠品系为C57，受体小鼠品系为Balb/c；限制性内切酶购自GIBCO BRL公司，实验用质粒p3.1 HGV-NS3由本实验室构建；PCR及RT-PCR试剂购自SANGO公司；DNA抽提试剂为常规试剂；RNA抽提试剂TRIzol购自GIBCO公司；凝胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司；引物根据PC-GENE软件自行设计，上游引物位于NS3区3660～3678位，下游引物位于NS3区4400～4422位，由中国科学院上海植物生理所合成。病理学制片所用试剂为常规试剂。
1.2 方法
1.2.1 目的基因片段的获得 将质粒p3.1 HGV-NS3鉴定后，用限制性内切酶Sal I和Xmn I酶切，得到了大小不同的五个片段，分别为34bp及0.3、1.5、1.9、5.6kb。其中5.6kb条带为目的基因片段，将酶切后的DNA进行电泳分析，待五条带完全分开后，用凝胶回收试剂盒回收5.6kb目的基因片段，溶于显微注射用TE buffer (pH 8.0)，备用(图1)。
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1.2.2 显微注射产生转基因小鼠 依常规方法进行显微注射[8]。在供体鼠和受体假孕鼠准备好后，处死供体母鼠后取出受精卵，在显微注射仪下将目的基因片段注射至C57供体小鼠受精卵的雄原核中，随后将显微注射操作过的受精卵移至假孕的Balb/c母鼠输卵管内，待其产仔。
1.2.3 HGV转基因小鼠外源基因的复制和转录 小鼠出生二周后，抽取尾组织基因组DNA进行PCR鉴定，PCR反应条件为：94℃ 3min； 94℃ 1min，55℃ 1min; 72℃ 1min 10s；32个循环。将PCR鉴定为阳性的转基因小鼠与同一品系的正常小鼠交配，以产生子代小鼠。然后取PCR反应为阳性的部分F0及F1代转基因小鼠的肝、肾组织及血细胞，用TRIzol试剂抽提各个组织的RNA，进行反转录PCR反应。反转录反应的条件为：42℃ 30min；随后将反转录产物作为PCR反应的底物进行PCR反应。反应条件与上相同。
, 百拇医药 1.2.4 转基因小鼠的病理学研究 于鼠龄6个月时，将转基因小鼠各个组织取材，固定于15%的福尔马林固定液中，进行常规H.E染色的病理学切片分析。
2 结果
2.1 转基因小鼠的产生
共注射233只受精卵，注射后存活的受精卵150只，存活率为74.3%；对9只假孕母鼠进行单侧输卵管移植，其中6只怀孕，怀孕率为67.1%；共产生28只子鼠，存活25只，存活率为89.3%；对所得到的25只小鼠尾组织基因组DNA进行PCR扩增。其中有10只小鼠的PCR结果出现760bp左右的特异型条带，即得到了10只founder小鼠，外源基因整合率为40%。
2.2 外源基因的复制
将F0代的阳性小鼠与同一品系的正常小鼠交配后，其中3只F0代的阳性小鼠得到了F1代的阳性小鼠，F1代小鼠阳性率为45%，另有两只F0代的阳性小鼠不孕(图2)。
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2.3 外源基因的转录
RT-PCR的结果显示(图3)，外源基因可以在肝细胞和单核细胞内转录，并在760bp处出现特异性条带。肾组织内则未见阳性条带。
2.4 病理学改变
所取6只转基因小鼠样本，包括肝、肾、心脏、皮肤、脾等多种组织，其中一只小鼠出现脂肪变性，二只小鼠出现较严重的水样变，其中一只有小灶性的淋巴细胞浸润等轻型炎症反应。其它转基因小鼠表现无特殊异常(图4)。
图1 显微注射用目的片段
Fig.1 The target fragment for microinjection
, 百拇医药 1,λDNA/EcoR I+Hind Ⅲ;
3,p3.1 HGV-NS3/Sal I+Xmn I
图2 琼脂糖电泳检测部分转基因小鼠尾组织DNA的PCR扩增产物
Fig.2 The electrophoresis of tail tissue DNA PCR product in agarose gel
1,λDNA/EcoR I+Hind Ⅲ; 2,positive control;
3,negative control; 4～8.HGV transgenic mice
, 百拇医药
图3 琼脂糖电泳检测部分转基因小鼠血液单核细胞RT-PCR扩增产物
Fig.3 The electrophoresis of blood cell RNA RT-PCR product in agarose gel
1,λDNA/EcoR I+Hind Ⅲ; 2,positive control; 3,negative control; 4～8,HGV transgenic mice
图4 转基因小鼠体内的病理学改变
a,正常小鼠肝细胞； b,转基因小鼠肝细胞的脂肪变性； c,转基因小鼠肝细胞的水样变；
d,转基因小鼠肝细胞的肝小叶区的小灶性淋巴细胞浸润
, 百拇医药
Fig.4 Histopathological findings in HGV transgenic mouse liver a,age-matched negative littermate; b,steatosis in hepatocytes in transgenic mouse;
c,hydrogenic change in hepatocytes; d,lymphocyte filteration in hepatocytes of transgenic mouse
3 讨论
3.1 庚型肝炎病毒的嗜肝性分析
目前，有的研究认为HGV可能不是嗜肝病毒，而仅仅是一种肝脏过客性病毒。本实验的RT-PCR及组织病理学研究的初步结果说明，HGV基因的转录可能存在着一定的组织特异性， 因为RT-PCR的阳性特异带主要出现在肝细胞和血液有核细胞中， 肾脏中未见明显的阳性条带。明显的病理学改变也仅发生在肝细胞，其他组织无特殊异常。目前我们正在利用HGV完整基因组克隆[7]，构建含有HGV全基因组的转基因小鼠，以进一步研究HGV的组织细胞亲嗜性及HGV的其他特性。
, http://www.100md.com
3.2 HGV基因的整合位点与病理改变的关系
一般情况下，外源基因在转基因小鼠体内的整合位点是随机的，在本实验中，病理改变较严重的2只转基因小鼠，来自同一个founder小鼠及其后代。因此HGV在转基因小鼠体内的致病性是否与HGV基因的插入位点有关值得进一步的研究。
HGV转基因小鼠的工作还是刚刚开始，此体系的建立对HGV的复制、转录、嗜肝性及致病性的研究将有重要的意义。
国家自然科学基金资助(39825116,39770393,39830330);上海市科技发展基金盗用项目(98JC14023).
胡卫江(1667年-),女,河北张家口人,博士,讲师.主要从事乙型肝炎、庚型肝炎病毒转基因动物实验体系的研究.
参考文献
, http://www.100md.com
[1]金冬雁.庚型肝炎病毒是肝炎病毒吗[J].中华实验和临床病毒学杂志，1997，11(4)：301～305
[2]Leary TP,Muerhoff AS,Simons JN.Sequence and genomic organization of GBV-C:a novel member of the flaviviridae associated with human non-A-E hepatitis [J].J Med Virol,1996,48(1):60～67
[3]Linnen J,Wages J Jr,Zhang-Keck ZY.Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus:a transfusion-transmissible agent [J].Science,1996,271(5248):505～508
, 百拇医药
[4]Miyakawa Y,Mayumi M.Hepatitis G virus-a true hepatitis virus or an accidental tourist [J].NEJM,1997,336(11):795～796
[5]Theodore D,Lemon S M.GB virus C,hepatitis G virus,or human orphan flavirirus [J].Hepatology,1997,25(5):1285～1286
[6]Haydon GH,Jarvis LM,Simpson KJ.The clinical significance of the detection of hepatitis GBV-C RNA in the serum of patients with fulminant,presumed viral,hepatitis [J].J Viral Hepat,1997,4(1):45～49
[7]朱分禄，戚中田，等.庚型肝炎病毒基因组全长DNA的拼接与克隆[J].第二军医大学学报，1998，19(4)：301～306
[8]胡以平，秦世真，等.嵌合基因8KpF在转基因小鼠内的组织特异性表达[J].遗传学报,1992，19(1)：27
1999-02-08
1999-05-24, http://www.100md.com