丙型肝炎病毒Core与NS3基因的不同融合方式及其表达
作者：李暐东 梁布锋 祁自柏
单位：李暐东 梁布锋(中国科学院武汉病毒研究所，武汉 430071)；祁自柏(中国药品生物制品检定所，北京 100050)
关键词：丙型肝炎病毒；Core基因；NS3基因；基因融合；表达
中国病毒学000218 中图分类号：R512.63 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)02-0204-04
Fusion Expression of Hepatitis C Virus Core Region and NS3 Region in E.coli
LI Wei-dong,LIANG Bu-feng
, http://www.100md.com
(Wuhan Institute of Virology,Academia Sinica,Wuhan 430071,China)
QI Zi-bai
(National Institute of the Control of Pharmacentical and Biological Products,Beijing 100050,China)
Abstract:The gene encoding the core and NS3 proteins of hepatitis C virus was amplified by PCR,respectirely.Two genes were fused and formed the recombinant plamid pHCVCN (Core+NS3) and pHCVNC (NS3+Core).The fused plasmid were expressed in E.coli 06.The pHCCN plasmid expressed fussion protein was shown by a major band with a expected molecular weight about 68 kD on SDS-PAGE.However,the pHCVNC plasmid expressed fussion protein was 66 kD in molecular weight.The results indicate that the pHCVNC fussion protein differs from the pHCVCN fussion protein in mulecular weight.It suggests that the fusion way is important for the structure of recombinant proteins.
, 百拇医药
Key words:HCV;NS3 gene;Core gene;Fussion protein;Expression
丙型肝炎病毒(简称HCV)是危害人类健康的传染性疾病，预防该病的传播主要借助于HCV血清学诊断来筛选献血员和检测临床标本。从国内外已分离到的HCV株得知，HCV核心蛋白(Core)和非结构蛋白NS3含有较强的优势抗原表位，其相应的抗体出现早，阳性率高，已成为目前第二、第三代HCV免疫诊断试剂的重要成份[1，2]。通常Core蛋白和NS3蛋白分别用基因工程方法表达，然后作为固定化抗原，检测人体内HCV的抗体。我们对Core和NS3的两种不同组合方式及其表达的研究，对于发展新的HCV诊断试剂很有帮助，现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 质粒与菌种
含HCV的Core基因表达质粒pHCVc，cDNA长为392bp，含NS3基因表达质粒pHCVN，cDNA长为690bp，均为武汉病毒研究所构建[3]。大肠杆菌DH5α、E.coli 06、表达载体pGEX由武汉病毒研究所保存。
, http://www.100md.com
1.2 融合基因表达载体的构建
人工接头合成的核苷酸为：GGATCAGGATCAGGATCA，用BamHI和EcoRI双酶分别切下pHCVc的Core基因和pHCVN的NS3基因，回收后，两基因通过接头序列进行连接反应，插入载体pGEX中，反应过程按文献进行[4]。
1.3 重组质粒的筛选和酶切鉴定
1.3.1 用PCR方法筛选质粒，合成pHCVc的Core基因cDNA上游引物P1和下游引物P2，合成pHCVN的NS3基因cDNA上游引物P3和下游引物P4。用引物P1和P4扩增，得到重组质粒pHCVCN；用引物P3和P2扩增，得到重组质粒pHCVNC。
, 百拇医药
1.3.2 两株表达菌株经小量提取质粒后，用BamHI、EcoRI和SacI酶切分析。
1.4 表达产物的SDS-PAGE纯化及抗原活性分析
表达质粒在E.coli 06中按常规方法诱导表达，菌体蛋白裂解后，作SDS-PAGE制备电泳，将制备胶中重组蛋白条带切下，置小离心管中用PBS浸泡过夜，第二天12000r/min离心15min，所得上清即为含表达产物的粗提液。以此粗提液包被于96孔板上，取自备质控阳性血清和阴性血清进行间接ELISA检测。
2 结果与讨论
2.1 重组质粒的酶切鉴定
重组质粒pHCVCN和pHCVNC构建后的结构如图1所示。在NS3抗原基因3′端200bp处有一个SacI位点，将pHCVCN用BamHI、EcoRI和SacI酶切时，预计得到4950、900和200bp三片段。而pHCVNC用BamHI、EcoRI和SacI酶切时，预计得到4950、490和610bp三片段。pHCVCN和pHCVNC用BamHI和EcoRI双酶切，预计得到4950和1100bp两片段。实际电泳结果与预测完全一致(图2)，说明两个重组质粒构建正确。
, http://www.100md.com
图1 质粒pHCVCN和pHCVNC的结构
Fig.1 The structure of plasmid pHCVCN and pHCVNC
2.2 重组蛋白的诱导表达
两株表达菌株在LB培养液中，培养至OD600为0.6。每管加IPTG至终浓度为1mmol/L，再培养5h后，收集菌体蛋白，作SDS-PAGE电泳分析。以Core基因+NS3基因方式获得的融合蛋白大小为68kD，与预测结果一致，且蛋白稳定，抗原活性较高。而以NS3基因+Core基因方式获得的融合蛋白大小为66kD，比预测的结果小(图3)，且蛋白不稳定，易降解，无法检测抗原活性。这两种基因的不同组合对其编码的融合蛋白空间结构有影响，因而影响了表达产物的理化性质和抗原活性。
, http://www.100md.com
图2 pHCVCN和pHCVNC的酶切鉴定
Fig.2 Digested products of pHCVCN and
pHCVNC by restriction enzyme
1,2.pHCVNC,B+E+S 3.pHCVCN,B+E+S
4.pHCNNC,B+E 5.pHCVCN,B+E
6.λDNA/HindⅢ
B:BamHI;E:EcoRI;S:SacI
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图3 表达产物SDS-PAGE分析
Fig.3 SDS-PAGE analysis of pHCVCN and
pHCVNC expression products
M:Marker of protein molecular weight (kD)
1,2.Expression products of pHCVNC
3,4.Expression products of pHCVCN
表1 HCV阳性血清和阴性血清ELISA检测结果
, 百拇医药
Table 1 ELISA detection of HCV positive serum and negatire serum 阳性血清号
Number of positive serum
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
, http://www.100md.com
科华产品
Product of KeHua
2.270
2.574
2.784
2.233
2.203
2.570
2.573
1.856
2.144
1.131
, 百拇医药 pHCVCN
1.252
1.975
2.037
1.434
1.417
1.859
1.785
1.112
0.686
0.545
阴性血清号
Number of negative serum
, http://www.100md.com
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
科华产品
Product of KeHua
0.053
, 百拇医药 0.068
0.054
0.095
0.086
0.044
0.088
0.013
0.041
0.191
pHCVCN
0.501
0.487
0.410
, 百拇医药
0.448
0.508
0.557
0.502
0.519
0.471
0.391
2.3 抗原活性分析
将pHCVCN表达物以1∶50稀释后包被96孔板，用ELISA方法检测自备质控血清中的10份阳性血清、10份阴性血清。同时用上海实业科华公司的抗-HCV抗体ELISA检测试剂盒作参照，检测结果见表1(质粒pHCVNC表达抗原有降解，未检测活性)。pHCVCN表达抗原的粗提物，已能明显地检测出阳性血清和阴性血清。用科华抗HCV第三代试剂平行检测，检出情况一致。但效果比科华产品差，同一阳性血清，科华测出数值较高；而同一阴性血清，科华测出的数值较低。考虑到科华试剂盒中包被抗原有Core、NS3、NS4、NS5等区域，而本表达抗原仅有Core和NS3融合蛋白，且未经高度纯化。在检测后能有这样的结果，显示融合抗原具有良好的应用前景。作为一种单一的抗原，其表达产物的纯化和后续的包被，较多抗原组分的分散表达，包被和纯化要方便和简单得多。以Core+NS3为基础，继续融合其它抗原基因片段有可能进一步提高抗-HCV的诊断水平。
, 百拇医药
李暐东(1969年-),男,湖北省人,助研,从事病毒分子生物学研究.
参考文献
[1]毕胜利，白宪鹤，丛勉尔，等.中国人丙型肝炎病毒基因组的一级结构及其变异[J].病毒学报，1993，9(2)：114～127
[2]Trowbridge R,Gowans E J.Molecular cloning of an Australian isolate of hepatitis C virus [J].Arch Virol,1998,143:501～511
[3]李暐东，梁布锋，祁自柏.丙型肝炎病毒北京株NS3基因的克隆及测序[J].生命科学研究，1999，3(1)：53～57
[4]萨姆布鲁克，弗里奇，曼尼阿蒂斯著.金冬雁等译.分子克隆实验指南[M].第二版.北京：科学出版社，1992.
1999-03-05
1999-08-17, 百拇医药
单位：李暐东 梁布锋(中国科学院武汉病毒研究所，武汉 430071)；祁自柏(中国药品生物制品检定所，北京 100050)
关键词：丙型肝炎病毒；Core基因；NS3基因；基因融合；表达
中国病毒学000218 中图分类号：R512.63 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)02-0204-04
Fusion Expression of Hepatitis C Virus Core Region and NS3 Region in E.coli
LI Wei-dong,LIANG Bu-feng
, http://www.100md.com
(Wuhan Institute of Virology,Academia Sinica,Wuhan 430071,China)
QI Zi-bai
(National Institute of the Control of Pharmacentical and Biological Products,Beijing 100050,China)
Abstract:The gene encoding the core and NS3 proteins of hepatitis C virus was amplified by PCR,respectirely.Two genes were fused and formed the recombinant plamid pHCVCN (Core+NS3) and pHCVNC (NS3+Core).The fused plasmid were expressed in E.coli 06.The pHCCN plasmid expressed fussion protein was shown by a major band with a expected molecular weight about 68 kD on SDS-PAGE.However,the pHCVNC plasmid expressed fussion protein was 66 kD in molecular weight.The results indicate that the pHCVNC fussion protein differs from the pHCVCN fussion protein in mulecular weight.It suggests that the fusion way is important for the structure of recombinant proteins.
, 百拇医药
Key words:HCV;NS3 gene;Core gene;Fussion protein;Expression
丙型肝炎病毒(简称HCV)是危害人类健康的传染性疾病，预防该病的传播主要借助于HCV血清学诊断来筛选献血员和检测临床标本。从国内外已分离到的HCV株得知，HCV核心蛋白(Core)和非结构蛋白NS3含有较强的优势抗原表位，其相应的抗体出现早，阳性率高，已成为目前第二、第三代HCV免疫诊断试剂的重要成份[1，2]。通常Core蛋白和NS3蛋白分别用基因工程方法表达，然后作为固定化抗原，检测人体内HCV的抗体。我们对Core和NS3的两种不同组合方式及其表达的研究，对于发展新的HCV诊断试剂很有帮助，现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 质粒与菌种
含HCV的Core基因表达质粒pHCVc，cDNA长为392bp，含NS3基因表达质粒pHCVN，cDNA长为690bp，均为武汉病毒研究所构建[3]。大肠杆菌DH5α、E.coli 06、表达载体pGEX由武汉病毒研究所保存。
, http://www.100md.com
1.2 融合基因表达载体的构建
人工接头合成的核苷酸为：GGATCAGGATCAGGATCA，用BamHI和EcoRI双酶分别切下pHCVc的Core基因和pHCVN的NS3基因，回收后，两基因通过接头序列进行连接反应，插入载体pGEX中，反应过程按文献进行[4]。
1.3 重组质粒的筛选和酶切鉴定
1.3.1 用PCR方法筛选质粒，合成pHCVc的Core基因cDNA上游引物P1和下游引物P2，合成pHCVN的NS3基因cDNA上游引物P3和下游引物P4。用引物P1和P4扩增，得到重组质粒pHCVCN；用引物P3和P2扩增，得到重组质粒pHCVNC。
, 百拇医药
1.3.2 两株表达菌株经小量提取质粒后，用BamHI、EcoRI和SacI酶切分析。
1.4 表达产物的SDS-PAGE纯化及抗原活性分析
表达质粒在E.coli 06中按常规方法诱导表达，菌体蛋白裂解后，作SDS-PAGE制备电泳，将制备胶中重组蛋白条带切下，置小离心管中用PBS浸泡过夜，第二天12000r/min离心15min，所得上清即为含表达产物的粗提液。以此粗提液包被于96孔板上，取自备质控阳性血清和阴性血清进行间接ELISA检测。
2 结果与讨论
2.1 重组质粒的酶切鉴定
重组质粒pHCVCN和pHCVNC构建后的结构如图1所示。在NS3抗原基因3′端200bp处有一个SacI位点，将pHCVCN用BamHI、EcoRI和SacI酶切时，预计得到4950、900和200bp三片段。而pHCVNC用BamHI、EcoRI和SacI酶切时，预计得到4950、490和610bp三片段。pHCVCN和pHCVNC用BamHI和EcoRI双酶切，预计得到4950和1100bp两片段。实际电泳结果与预测完全一致(图2)，说明两个重组质粒构建正确。
, http://www.100md.com
图1 质粒pHCVCN和pHCVNC的结构
Fig.1 The structure of plasmid pHCVCN and pHCVNC
2.2 重组蛋白的诱导表达
两株表达菌株在LB培养液中，培养至OD600为0.6。每管加IPTG至终浓度为1mmol/L，再培养5h后，收集菌体蛋白，作SDS-PAGE电泳分析。以Core基因+NS3基因方式获得的融合蛋白大小为68kD，与预测结果一致，且蛋白稳定，抗原活性较高。而以NS3基因+Core基因方式获得的融合蛋白大小为66kD，比预测的结果小(图3)，且蛋白不稳定，易降解，无法检测抗原活性。这两种基因的不同组合对其编码的融合蛋白空间结构有影响，因而影响了表达产物的理化性质和抗原活性。
, http://www.100md.com
图2 pHCVCN和pHCVNC的酶切鉴定
Fig.2 Digested products of pHCVCN and
pHCVNC by restriction enzyme
1,2.pHCVNC,B+E+S 3.pHCVCN,B+E+S
4.pHCNNC,B+E 5.pHCVCN,B+E
6.λDNA/HindⅢ
B:BamHI;E:EcoRI;S:SacI
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图3 表达产物SDS-PAGE分析
Fig.3 SDS-PAGE analysis of pHCVCN and
pHCVNC expression products
M:Marker of protein molecular weight (kD)
1,2.Expression products of pHCVNC
3,4.Expression products of pHCVCN
表1 HCV阳性血清和阴性血清ELISA检测结果
, 百拇医药
Table 1 ELISA detection of HCV positive serum and negatire serum 阳性血清号
Number of positive serum
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
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科华产品
Product of KeHua
2.270
2.574
2.784
2.233
2.203
2.570
2.573
1.856
2.144
1.131
, 百拇医药 pHCVCN
1.252
1.975
2.037
1.434
1.417
1.859
1.785
1.112
0.686
0.545
阴性血清号
Number of negative serum
, http://www.100md.com
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
科华产品
Product of KeHua
0.053
, 百拇医药 0.068
0.054
0.095
0.086
0.044
0.088
0.013
0.041
0.191
pHCVCN
0.501
0.487
0.410
, 百拇医药
0.448
0.508
0.557
0.502
0.519
0.471
0.391
2.3 抗原活性分析
将pHCVCN表达物以1∶50稀释后包被96孔板，用ELISA方法检测自备质控血清中的10份阳性血清、10份阴性血清。同时用上海实业科华公司的抗-HCV抗体ELISA检测试剂盒作参照，检测结果见表1(质粒pHCVNC表达抗原有降解，未检测活性)。pHCVCN表达抗原的粗提物，已能明显地检测出阳性血清和阴性血清。用科华抗HCV第三代试剂平行检测，检出情况一致。但效果比科华产品差，同一阳性血清，科华测出数值较高；而同一阴性血清，科华测出的数值较低。考虑到科华试剂盒中包被抗原有Core、NS3、NS4、NS5等区域，而本表达抗原仅有Core和NS3融合蛋白，且未经高度纯化。在检测后能有这样的结果，显示融合抗原具有良好的应用前景。作为一种单一的抗原，其表达产物的纯化和后续的包被，较多抗原组分的分散表达，包被和纯化要方便和简单得多。以Core+NS3为基础，继续融合其它抗原基因片段有可能进一步提高抗-HCV的诊断水平。
, 百拇医药
李暐东(1969年-),男,湖北省人,助研,从事病毒分子生物学研究.
参考文献
[1]毕胜利，白宪鹤，丛勉尔，等.中国人丙型肝炎病毒基因组的一级结构及其变异[J].病毒学报，1993，9(2)：114～127
[2]Trowbridge R,Gowans E J.Molecular cloning of an Australian isolate of hepatitis C virus [J].Arch Virol,1998,143:501～511
[3]李暐东，梁布锋，祁自柏.丙型肝炎病毒北京株NS3基因的克隆及测序[J].生命科学研究，1999，3(1)：53～57
[4]萨姆布鲁克，弗里奇，曼尼阿蒂斯著.金冬雁等译.分子克隆实验指南[M].第二版.北京：科学出版社，1992.
1999-03-05
1999-08-17, 百拇医药