水稻草矮病毒核衣壳蛋白基因克隆及在大肠杆菌中的表达
作者：张春嵋 吴祖建 林奇英 谢联辉
单位：福建农业大学植物病毒研究所，福州 350002
关键词：水稻草矮病毒；核衣壳蛋白基因；表达；融合蛋白
中国病毒学000217 中图分类号：S432.41 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)02-0200-04
Cloning and Expression in E.coli of Nucleocapsid Protein Gene of Rice Grassy Stunt Virus
ZHANG Chun-mei,WU Zu-jian,LIN Qi-ying,XIE Lian-hui
, 百拇医药
(Institute of Plant Virology,Fujian Agricultural University,Fuzhou 350002,China)
Abstract:Based on the known RNA sequence of rice grassy stunt virus,IRRI isolate (RGSV-IR),the cDNA of nucleocapsid protein (NCP) gene was obtained by RT-PCR,with genomic RNAs of Shaxian isolate (RGSV-SX) as template.The cDNA was then cloned into pGEM-T vector and sequenced.The results showed that the nucleotide sequence between the two isolates was 99.4% identical.A bacterial expression plasmid pGTNCP which produced a fusion protein with molecular weight of about 62kD was constructed using the cDNA clone and vector pGEX-2T.Western blot analysis showed that the fusion protein reacted strongly with antibodies raised against RGSV particles.
, 百拇医药
Key words:Rice grassy stunt virus; Nucleocapsid protein gene; Expression;Fusion protein
水稻草状矮化病于70年代曾在南亚、东南亚大面积发生，给当地的水稻生产造成严重损失，在我国也有分布[1]。其病原是水稻草矮病毒(Rice grassy stunt virus,RGSV)，为纤细病毒属(Tenuivirus)的一个成员，病毒粒体丝状，由核衣壳蛋白和基因组RNA组成[2]。基因组含六个ssRNA片段，均为双义编码[3，4]，其中RNA5的毒义互补链编码核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,NCP)[3]。本文报道应用RT-PCR技术获得RGSV沙县分离株(RGSV-SX)NCP基因的cDNA克隆，并得到其在大肠杆菌中的表达产物。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 病毒分离株 为本所采自福建沙县，经室内分离纯化，保存在台中本地1号(TN1)上的水稻草矮病毒沙县分离株(RGSV-SX)。
1.2 质粒与试剂 质粒pGEX-2T为Pharmacia产品，pGEM-T easy vector system、AMV反转录酶及T4 DNA聚合酶购自Promega公司，Taq酶及限制性内切酶为MBI产品，回收试剂盒QIAEX Ⅱ Gen Extraction Kit为QIAGEN产品，PVDF膜为DuPont公司产品。
1.3 引物 根据RGSV IRRI分离株(RGSV-IR)的RNA5序列[3]设计：P1(3′端) 5′AGTGT-CATATGGGTAAAGTGCAATTTGG 3′(划线处为Nde Ⅰ酶切位点)，P2(5′端)5′TCACAGGATCCACTACGCTAAAGGC3′(划线处为BamHI酶切位点)。
, 百拇医药 1.4 病毒提纯及RNA提取 病毒提纯参照文献[5]和[6]的方法，略作修改。提纯病毒经SDS和蛋白酶K处理，酚/酚-氯仿抽提，乙醇沉淀得到病毒RNA。
1.5 NCP基因的cDNA克隆及序列测定 反转录按AMV反转录酶使用说明进行，PCR扩增条件为：94℃变性1min,52℃退火2min，72℃延伸2min，共30个循环。PCR产物回收、连接、转化及筛选均按常规方法进行，得到重组克隆pTNCP。序列测定在ABI 377型DNA测序仪上进行。
1.6 表达载体的构建 质粒pGEM-T的克隆位点两侧各有一EcoR I位点。以Nde I酶切重组质粒pTNCP，T4 DNA聚合酶补平，再用EcoR I酶切，回收1.0kb片段，与Sma I和EcoR I双酶切的质粒pGEX-2T连接，转化E.coli DH5α，筛选得到重组质粒pGTNCP。
1.7 NCP基因在大肠杆菌中的表达 含质粒pGTNCP的菌株诱导表达按pGEX-2T的说明书进行，设置未转化、转化质粒pGEX-2T的DH5α为对照。分别对诱导前后的培养液取样，于15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳。
, 百拇医药
1.8 融合蛋白的免疫学鉴定 采用Western印迹法，按文献[7]的方法及PVDF膜的说明书进行，第一抗体RGSV抗血清由Hibino博士赠送，第二抗体为Sigma公司的羊抗兔IgG-AP。
2 结果与讨论
2.1 PGSV-SX NCP基因的克隆、序列测定及同源性分析
以RGSV-SX的基因组RNA为模板，RT-PCR得到长为1027bp的包含NCP基因的cDNA片段。将其与载体pGEM-T连接，得到重组质粒pTNCP(图1a)。
图1 RGSV-SX NCP基因的RT-PCR产物及重组质粒的酶切鉴定
Fig.1 RT-PCR of RGSV-SX NCP and analysis of recombinant plasmids
, 百拇医药
(a):A:pTNCP digested with EcoR I; B:RT-PCR product; C:λ DNA/Hind Ⅲ+EcoRI marker
(b):A:pGTNCP digested with EcoR I; B:pGTNCP digested with BamH I; C:λDNA/HindⅢ+EcoRI marker
序列测定结果表明，RGSV-SX NCP基因编码区由978个核苷酸组成，与RGSV-IR NCP基因相比存在6个核苷酸的差异，序列同源性为99.4%，其中仅有1处变异引起了氨基酸序列的变化，氨基酸序列同源性为99.7%(图2)，表明两个分离物具有很高的亲缘关系。
2.2 融合蛋白的表达
因载体pGEX-2T上的SmaI位点前有一BamHI位点，故重组质粒pGTNCP经EcoRI酶切将得到约6kb的条带，而经BamHI消化则应得到5kb和1kb两个片段，电泳结果与预期一致(图1b)。得到的融合蛋白分子量为62kD，为质粒本身的谷胱甘肽转移酶(GST)分子量(26kD)和RGSV-NCP分子量(36kD)之和，也与预期结果一致(图3)，说明表达载体的构建正确，NCP基因得到完整表达。
, 百拇医药
2.3 融合蛋白的免疫学鉴定
Western印迹分析结果显示，融合蛋白和提纯病毒的核衣壳蛋白一样，均与RGSV-IR病毒粒体的抗血清有很好的免疫结合，而作为对照的不含质粒、含pGEX-2T的DH5α蛋白均无显色反应(图4)。可见，所表达的融合蛋白具有病毒核衣壳蛋白的抗原性。
图2 RGSV-SX NCP-cDNA的核苷酸及编码蛋白的氨基酸序列
Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of NCP-cDNA of RGSV-SX
# indicates the difference with the NCP gene of RGSV-IR
, 百拇医药
图3 RGSV-SX NCP基因在大肠杆菌DH5α中表达产物的SDS-PAGE分析
Fig.3 SDS-PAGE analysis of expression of RGSV-SX NCP gene in Ecoli DH5α A&B.Ecoli DH5α before & after induction; C.Protein marker;D&E Ecoli DH5α with pGEX-2T before & after induction; F&G.Ecoli DH5α with pGTNCP before and after induction; H.Purified RGSV-NCP.←indicates the expressed fusion protein
图4 表达产物的Western印迹分析
, 百拇医药
Fig.4 Western blot analysis of expressed products
A.DH5α; B.Purified RGSV-NCP; C.DH5α with pGTNCP; D.DH5α with pGEX-2T
水稻草矮病毒是由介体褐飞虱(Nilaparvata lugens)以持久性方式传播的。褐飞虱是一种广泛分布于我国、日本和东南亚各国的远距离迁飞性害虫，在我国稻区常成群严重发生。虽然近年来我国水稻草矮病很少发生，但在东南亚一带仍有分布，因此有可能随传毒介体的北迁而传播蔓延到我国，对我国水稻生产构成潜在威胁，所以建立对水稻草矮病的常规血清学检测技术是十分必要的。但由于RGSV的提纯比较困难，得率很低，因而制约抗原来源。为此我们构建大肠杆菌表达载体，以期获得良好抗原来制备抗血清。目前蛋白纯化和抗血清的制备工作正在进行。
基金项目：福建省科委重点项目(95-Z-4)
, http://www.100md.com
作者简介：张春嵋(1970年-)，女，福建省晋江市人，助理研究员，博士。研究方向为植物病毒学。
参考文献
[1]林奇英，谢联辉，谢莉妍，等.中菲两种水稻病毒病的比较研究 Ⅱ.水稻草状矮化病的病原学[J].农业科学集刊，1993，1(1)：203～206
[2]Ramirez B-C,Haenni A-L.Molecular biology of tenuiviruses,a remarkable group of plant viruses [J].J Gen Virol.1994,75:467～475
[3]Toriyama S,Kimishima T,Takahashi M.The proteins encoded by rice grassy stunt virus RNA5 and RNA6 are only distantly related to the corresponding proteins of other members of the genus Tenuivirus [J].J Gen Virol.1997,78:2355～2363
, 百拇医药
[4]Toriyama S,Kimishima T,Takahashi M,et al.The complete nucleotide sequence of the rice grassy stunt virus genome and genomic comparisons with viruses of the genus Tenuivirus [J].J Gen Virol,1998,79:2051～2058
[5]Hibino H,Usugi T,Omura T,et al.Rice grassy stunt virus:a planthopper-borne circular filament [J].Phytopathol.1985,75:894～899
[6]Toriyama S.Ribonucleic acid polymerase activity in filamentous nucleoproteins of rice grassy stunt virus [J].J Gen Virol,1987,68:925～929
[7]Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular Cloning:A Laboratory Mannual [M].2nd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.
收稿日期：1999-02-04
修回日期：1999-05-17, 百拇医药
单位：福建农业大学植物病毒研究所，福州 350002
关键词：水稻草矮病毒；核衣壳蛋白基因；表达；融合蛋白
中国病毒学000217 中图分类号：S432.41 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)02-0200-04
Cloning and Expression in E.coli of Nucleocapsid Protein Gene of Rice Grassy Stunt Virus
ZHANG Chun-mei,WU Zu-jian,LIN Qi-ying,XIE Lian-hui
, 百拇医药
(Institute of Plant Virology,Fujian Agricultural University,Fuzhou 350002,China)
Abstract:Based on the known RNA sequence of rice grassy stunt virus,IRRI isolate (RGSV-IR),the cDNA of nucleocapsid protein (NCP) gene was obtained by RT-PCR,with genomic RNAs of Shaxian isolate (RGSV-SX) as template.The cDNA was then cloned into pGEM-T vector and sequenced.The results showed that the nucleotide sequence between the two isolates was 99.4% identical.A bacterial expression plasmid pGTNCP which produced a fusion protein with molecular weight of about 62kD was constructed using the cDNA clone and vector pGEX-2T.Western blot analysis showed that the fusion protein reacted strongly with antibodies raised against RGSV particles.
, 百拇医药
Key words:Rice grassy stunt virus; Nucleocapsid protein gene; Expression;Fusion protein
水稻草状矮化病于70年代曾在南亚、东南亚大面积发生，给当地的水稻生产造成严重损失，在我国也有分布[1]。其病原是水稻草矮病毒(Rice grassy stunt virus,RGSV)，为纤细病毒属(Tenuivirus)的一个成员，病毒粒体丝状，由核衣壳蛋白和基因组RNA组成[2]。基因组含六个ssRNA片段，均为双义编码[3，4]，其中RNA5的毒义互补链编码核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,NCP)[3]。本文报道应用RT-PCR技术获得RGSV沙县分离株(RGSV-SX)NCP基因的cDNA克隆，并得到其在大肠杆菌中的表达产物。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 病毒分离株 为本所采自福建沙县，经室内分离纯化，保存在台中本地1号(TN1)上的水稻草矮病毒沙县分离株(RGSV-SX)。
1.2 质粒与试剂 质粒pGEX-2T为Pharmacia产品，pGEM-T easy vector system、AMV反转录酶及T4 DNA聚合酶购自Promega公司，Taq酶及限制性内切酶为MBI产品，回收试剂盒QIAEX Ⅱ Gen Extraction Kit为QIAGEN产品，PVDF膜为DuPont公司产品。
1.3 引物 根据RGSV IRRI分离株(RGSV-IR)的RNA5序列[3]设计：P1(3′端) 5′AGTGT-CATATGGGTAAAGTGCAATTTGG 3′(划线处为Nde Ⅰ酶切位点)，P2(5′端)5′TCACAGGATCCACTACGCTAAAGGC3′(划线处为BamHI酶切位点)。
, 百拇医药 1.4 病毒提纯及RNA提取 病毒提纯参照文献[5]和[6]的方法，略作修改。提纯病毒经SDS和蛋白酶K处理，酚/酚-氯仿抽提，乙醇沉淀得到病毒RNA。
1.5 NCP基因的cDNA克隆及序列测定 反转录按AMV反转录酶使用说明进行，PCR扩增条件为：94℃变性1min,52℃退火2min，72℃延伸2min，共30个循环。PCR产物回收、连接、转化及筛选均按常规方法进行，得到重组克隆pTNCP。序列测定在ABI 377型DNA测序仪上进行。
1.6 表达载体的构建 质粒pGEM-T的克隆位点两侧各有一EcoR I位点。以Nde I酶切重组质粒pTNCP，T4 DNA聚合酶补平，再用EcoR I酶切，回收1.0kb片段，与Sma I和EcoR I双酶切的质粒pGEX-2T连接，转化E.coli DH5α，筛选得到重组质粒pGTNCP。
1.7 NCP基因在大肠杆菌中的表达 含质粒pGTNCP的菌株诱导表达按pGEX-2T的说明书进行，设置未转化、转化质粒pGEX-2T的DH5α为对照。分别对诱导前后的培养液取样，于15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳。
, 百拇医药
1.8 融合蛋白的免疫学鉴定 采用Western印迹法，按文献[7]的方法及PVDF膜的说明书进行，第一抗体RGSV抗血清由Hibino博士赠送，第二抗体为Sigma公司的羊抗兔IgG-AP。
2 结果与讨论
2.1 PGSV-SX NCP基因的克隆、序列测定及同源性分析
以RGSV-SX的基因组RNA为模板，RT-PCR得到长为1027bp的包含NCP基因的cDNA片段。将其与载体pGEM-T连接，得到重组质粒pTNCP(图1a)。
图1 RGSV-SX NCP基因的RT-PCR产物及重组质粒的酶切鉴定
Fig.1 RT-PCR of RGSV-SX NCP and analysis of recombinant plasmids
, 百拇医药
(a):A:pTNCP digested with EcoR I; B:RT-PCR product; C:λ DNA/Hind Ⅲ+EcoRI marker
(b):A:pGTNCP digested with EcoR I; B:pGTNCP digested with BamH I; C:λDNA/HindⅢ+EcoRI marker
序列测定结果表明，RGSV-SX NCP基因编码区由978个核苷酸组成，与RGSV-IR NCP基因相比存在6个核苷酸的差异，序列同源性为99.4%，其中仅有1处变异引起了氨基酸序列的变化，氨基酸序列同源性为99.7%(图2)，表明两个分离物具有很高的亲缘关系。
2.2 融合蛋白的表达
因载体pGEX-2T上的SmaI位点前有一BamHI位点，故重组质粒pGTNCP经EcoRI酶切将得到约6kb的条带，而经BamHI消化则应得到5kb和1kb两个片段，电泳结果与预期一致(图1b)。得到的融合蛋白分子量为62kD，为质粒本身的谷胱甘肽转移酶(GST)分子量(26kD)和RGSV-NCP分子量(36kD)之和，也与预期结果一致(图3)，说明表达载体的构建正确，NCP基因得到完整表达。
, 百拇医药
2.3 融合蛋白的免疫学鉴定
Western印迹分析结果显示，融合蛋白和提纯病毒的核衣壳蛋白一样，均与RGSV-IR病毒粒体的抗血清有很好的免疫结合，而作为对照的不含质粒、含pGEX-2T的DH5α蛋白均无显色反应(图4)。可见，所表达的融合蛋白具有病毒核衣壳蛋白的抗原性。
图2 RGSV-SX NCP-cDNA的核苷酸及编码蛋白的氨基酸序列
Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of NCP-cDNA of RGSV-SX
# indicates the difference with the NCP gene of RGSV-IR
, 百拇医药
图3 RGSV-SX NCP基因在大肠杆菌DH5α中表达产物的SDS-PAGE分析
Fig.3 SDS-PAGE analysis of expression of RGSV-SX NCP gene in Ecoli DH5α A&B.Ecoli DH5α before & after induction; C.Protein marker;D&E Ecoli DH5α with pGEX-2T before & after induction; F&G.Ecoli DH5α with pGTNCP before and after induction; H.Purified RGSV-NCP.←indicates the expressed fusion protein
图4 表达产物的Western印迹分析
, 百拇医药
Fig.4 Western blot analysis of expressed products
A.DH5α; B.Purified RGSV-NCP; C.DH5α with pGTNCP; D.DH5α with pGEX-2T
水稻草矮病毒是由介体褐飞虱(Nilaparvata lugens)以持久性方式传播的。褐飞虱是一种广泛分布于我国、日本和东南亚各国的远距离迁飞性害虫，在我国稻区常成群严重发生。虽然近年来我国水稻草矮病很少发生，但在东南亚一带仍有分布，因此有可能随传毒介体的北迁而传播蔓延到我国，对我国水稻生产构成潜在威胁，所以建立对水稻草矮病的常规血清学检测技术是十分必要的。但由于RGSV的提纯比较困难，得率很低，因而制约抗原来源。为此我们构建大肠杆菌表达载体，以期获得良好抗原来制备抗血清。目前蛋白纯化和抗血清的制备工作正在进行。
基金项目：福建省科委重点项目(95-Z-4)
, http://www.100md.com
作者简介：张春嵋(1970年-)，女，福建省晋江市人，助理研究员，博士。研究方向为植物病毒学。
参考文献
[1]林奇英，谢联辉，谢莉妍，等.中菲两种水稻病毒病的比较研究 Ⅱ.水稻草状矮化病的病原学[J].农业科学集刊，1993，1(1)：203～206
[2]Ramirez B-C,Haenni A-L.Molecular biology of tenuiviruses,a remarkable group of plant viruses [J].J Gen Virol.1994,75:467～475
[3]Toriyama S,Kimishima T,Takahashi M.The proteins encoded by rice grassy stunt virus RNA5 and RNA6 are only distantly related to the corresponding proteins of other members of the genus Tenuivirus [J].J Gen Virol.1997,78:2355～2363
, 百拇医药
[4]Toriyama S,Kimishima T,Takahashi M,et al.The complete nucleotide sequence of the rice grassy stunt virus genome and genomic comparisons with viruses of the genus Tenuivirus [J].J Gen Virol,1998,79:2051～2058
[5]Hibino H,Usugi T,Omura T,et al.Rice grassy stunt virus:a planthopper-borne circular filament [J].Phytopathol.1985,75:894～899
[6]Toriyama S.Ribonucleic acid polymerase activity in filamentous nucleoproteins of rice grassy stunt virus [J].J Gen Virol,1987,68:925～929
[7]Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular Cloning:A Laboratory Mannual [M].2nd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.
收稿日期：1999-02-04
修回日期：1999-05-17, 百拇医药