鸡传染性支气管炎病毒H株纤突蛋白基因的RT-PCR/RFLP分型
作者：赵振芬 黄亚东 王林川 刘公平 辛朝安
单位：赵振芬(郑州牧业工程高等专科学校，郑州 450008)；黄亚东 王林川 刘公平 辛朝安(华南农业大学动医系，广州 510642)
关键词：鸡传染性支气管炎病毒；纤突蛋白S1基因；反转录和聚合酶链式反应
中国病毒学000216 中图分类号：S852.65 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)02-0197-03
Study on RT-PCR/RFLP of Spike Protein S1 Gene of Avian Infectious Brochitis Virus H Strain
, http://www.100md.com
ZHAO Zhen-fen
(College of Zhengzhou Animal Husbandry,Zhengzhou 450008,China)
HUANG Ya-dong,WANG Lin-chuan LIU Gong-ping,XI Chao-an
(Department of Animal Medicine,South-China Agriculture University,Guangzhou 510642,China)
Abstract:A 1.66 kb expected S1 gene fragment of avian infectious brochitis virus (IBV) H strain was amplified by RT-PCR.Its PCR/RFLP pattern was similar to IBV D41 strain and M41 strain when digested using BstYI,HaeⅢ and EcoRI respectively.IBV H strain was thought as Massachusetts serotype.
, 百拇医药
Key words:Avian infectious bronchitis virus; S1 gene; RT-PCR/RFLP
鸡传染性支气管炎病毒(IBV)属于冠状病毒科冠状病毒属，可引起鸡呼吸道、输卵管、肾脏、肠道及腺胃等多部位病变。近年来，由于新的IBV变异毒株不断出现，从而导致鸡传染性支气管炎病的不断爆发，造成严重的经济损失[1]。IBV的基因组为单股RNA，约27.6kb，该基因主要编码3种主要结构蛋白：纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)，其中S蛋白成熟裂解为S1和S2两个蛋白亚基。S1蛋白是IBV的主要免疫原基因，可刺激机体产生中和抗体，决定病毒的组织亲嗜性，在病毒血清学分类中起主要作用[1，2]。H株是1993年在河南省分离的典型肾病变IBV毒株，我们对IBV的H株S1基因进行了RT-PCR及酶切分析，并将其PCR产物克隆入质粒载体，为进一步研究IBV的H株分子生物学特性和研制IBV基因工程疫苗打下基础。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 病毒 H株，广东肾病变IBV致弱株D41和IBV呼吸道型强毒株M41，均为鸡胚适应毒，由华南农业大学禽病室提供。
1.2 寡核苷酸引物 根据已发表的IBV Beaudette株S1基因序列(Binns et al,1986)设计PCR引物，两引物间为包含有整个S1基因的1.66kb片段[2]，由上海生物工程公司合成。引物P1含有S1基因5′端自第53位碱基的序列，其5′端有EcoRI酶切位点，P1：5′TCGAATTCTGGTAAGAGATGTTGGTAA(27bp)；引物P2为与S1基因3′端至第1717位碱基互补的序列，且其5′端有BamH I酶切点，P2：5′TTGGATCCATAACTAACATAAGGGCAA(27bp)。
, 百拇医药
1.3 病毒增殖及RNA提取 将各病毒经尿囊腔途径分别接种9日龄SPF鸡胚(由广东生物药厂提供)，37℃培养30h收取尿囊液，差速离心后用经DEPC处理过的水悬浮病毒。抽提RNA所有用水及水溶液均经DEPC做去RNase处理。加SDS(终浓度2%)和蛋白酶K(终浓度250μg/mL)，55℃作用45min，等量水饱和酚、氯仿/异戊醇(24∶1)各抽提一次，加入2倍体积无水乙醇和1/10体积2mol/L醋酸钠(pH4.0)，-20℃过夜。12000r/min 10min后70%冷乙醇洗涤两次，真空抽干后用水悬浮RNA，95℃变性5min后进入反转录体系。
1.4 RT-PCR 5×缓冲液4μL， RNA样品10μL， 10mmol/L dNTP 2μL，RNasin 1μL，引物P2(20mmol/L) 2μL，AMV RNase (1u/μL Promega) 1μL，共20μL，42℃温育1h后进行PCR。10×缓冲液5μL，RT产物10μL，引物P1(20pmol/L) 1μL，水33μL，95℃变性10min后加1μL Taq酶(1u/μL，BM公司)，石蜡油50μL，混匀后置水浴式PCR自动扩增仪(北京新技术应用研究所)上进行扩增。预先72℃ 2min后再进行93℃ 60s，50℃ 60s，72℃ 180s，共30个循环，72℃后延伸5min，产物于含溴化乙锭(EB)的1.2%琼脂糖凝胶上电泳后紫外检测。
, 百拇医药
1.5 酶切分析 将H、D41及M41毒株的PCR产物分别用BstYI，HaeⅢ和EcoRI(均为Promega产品)，按说明书进行酶切后，在2%琼脂糖凝胶(含EB)上电泳紫外检测。
2 结果与讨论
2.1 PCR产物 IBV的H株、D41株和M41株经RT-PCR扩增后电泳分析表明三者均得到了1.66kb的片段，与预期结果一致(图1)。
2.2 酶切分析 IBV的H株S1基因PCR产物经BstYI酶切得到1.0kb和0.66kb两个片段，经HaeⅢ酶切得到0.9kb、0.4kb和0.36kb三个片段，经EcoR I酶切后仅一条1.66kb片段，证明该PCR产物中无EcoR I酶切位点。IBV的H株与D41株和M41株S1基因PCR产物酶切结果完全一致，按Kwon等的PCR/RFLP分型方法[3]，可判定IBV的H株属于Mass血清型(图1)。
, 百拇医药
图1 IBV的H株S1与其它两株IBV的PCR/RFLP分型的比较
Fig.1 Comparison of pattern of IBV H strain S1 with the other two IBV strains by PCR/RFLP
2.3 由于国内IBV各血清型标准毒株不全，因此，很难用中和试验确定地方分离株的血清型。Kwon等[3]证明IBV S1基因PCR/RFLP分型结果与中和试验测定的血清型一致，PCR/RFLP分型与中和试验相比具有简便、快速的优点。本实验中将IBV的H株S1基因的PCR产物分别用BstYI、HaeⅢ和EcoRI酶切，其结果与D41株和M41株的PCR/RFLP带型完全一致。按Kwon等的判定方法，IBV的H株属于Mass血清型。IBV的H株是从典型肾病变鸡分离得来，D41株为肾变IBV致弱株，它有效防制了许多鸡场肾型IB的发生[2]，然而它们的PCR/RFLP分型却与呼吸道型毒株M41相同。这与Kwon等[3]报道的不同，Kwon证明美国IBV肾变株Gray、Holte与M41的S1基因PCR/RFLP不同，用HaeⅢ酶切可将它们区分开来。廖明等[4]对IBV的D41株S1基因序列分析认为S1基因变异程度与IBV的临诊表现和血清学反应不呈强相关关系，而江国托等[5]研究不同IBV毒株对不同靶器官的组织嗜性，组织培养中和试验和S1基因的PCR/RFLP的结果表明IBV组织嗜性与其血清型和S1基因变异紧密相关。三者确切的相关性还需进一步的试验证明。
, 百拇医药
赵振芬(1965年-),女,河南省新郑市人,硕士,副教授.研究方向为动物病毒学.
参考文献
[1]卡尔尼克 B W主编.高福，刘文军主译.禽病学[M].第9版.北京：北京农业大学出版社，1991.407～418
[2]王林川.禽传染性支气管炎病毒免疫原基因cDNA的构建与鉴定[D].[博士学位论文]，广州，华南农业大学.1994.
[3]Kwon H M,Jackwood M W,Gelb J.Differentiation of infectious bronchitis virus serotypes using polymase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis [J].Avian Disease,1993,37:194～202
[4]廖明.鸡传染性支气管炎病毒D41株S1基因序列测定及同源性分析[D].[博士学位论文].广州：华南农业大学.1997.
[5]江国托，刘思国，步志高，等.鸡传染性支气管炎病毒的组织嗜性与其血清型和S1基因变异的关系[C].中国畜牧兽医学会禽病学分会第九次学术研讨会论文集.广西，南宁.1998.
1998-12-08
1999-04-20, http://www.100md.com
单位：赵振芬(郑州牧业工程高等专科学校，郑州 450008)；黄亚东 王林川 刘公平 辛朝安(华南农业大学动医系，广州 510642)
关键词：鸡传染性支气管炎病毒；纤突蛋白S1基因；反转录和聚合酶链式反应
中国病毒学000216 中图分类号：S852.65 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)02-0197-03
Study on RT-PCR/RFLP of Spike Protein S1 Gene of Avian Infectious Brochitis Virus H Strain
, http://www.100md.com
ZHAO Zhen-fen
(College of Zhengzhou Animal Husbandry,Zhengzhou 450008,China)
HUANG Ya-dong,WANG Lin-chuan LIU Gong-ping,XI Chao-an
(Department of Animal Medicine,South-China Agriculture University,Guangzhou 510642,China)
Abstract:A 1.66 kb expected S1 gene fragment of avian infectious brochitis virus (IBV) H strain was amplified by RT-PCR.Its PCR/RFLP pattern was similar to IBV D41 strain and M41 strain when digested using BstYI,HaeⅢ and EcoRI respectively.IBV H strain was thought as Massachusetts serotype.
, 百拇医药
Key words:Avian infectious bronchitis virus; S1 gene; RT-PCR/RFLP
鸡传染性支气管炎病毒(IBV)属于冠状病毒科冠状病毒属，可引起鸡呼吸道、输卵管、肾脏、肠道及腺胃等多部位病变。近年来，由于新的IBV变异毒株不断出现，从而导致鸡传染性支气管炎病的不断爆发，造成严重的经济损失[1]。IBV的基因组为单股RNA，约27.6kb，该基因主要编码3种主要结构蛋白：纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)，其中S蛋白成熟裂解为S1和S2两个蛋白亚基。S1蛋白是IBV的主要免疫原基因，可刺激机体产生中和抗体，决定病毒的组织亲嗜性，在病毒血清学分类中起主要作用[1，2]。H株是1993年在河南省分离的典型肾病变IBV毒株，我们对IBV的H株S1基因进行了RT-PCR及酶切分析，并将其PCR产物克隆入质粒载体，为进一步研究IBV的H株分子生物学特性和研制IBV基因工程疫苗打下基础。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 病毒 H株，广东肾病变IBV致弱株D41和IBV呼吸道型强毒株M41，均为鸡胚适应毒，由华南农业大学禽病室提供。
1.2 寡核苷酸引物 根据已发表的IBV Beaudette株S1基因序列(Binns et al,1986)设计PCR引物，两引物间为包含有整个S1基因的1.66kb片段[2]，由上海生物工程公司合成。引物P1含有S1基因5′端自第53位碱基的序列，其5′端有EcoRI酶切位点，P1：5′TCGAATTCTGGTAAGAGATGTTGGTAA(27bp)；引物P2为与S1基因3′端至第1717位碱基互补的序列，且其5′端有BamH I酶切点，P2：5′TTGGATCCATAACTAACATAAGGGCAA(27bp)。
, 百拇医药
1.3 病毒增殖及RNA提取 将各病毒经尿囊腔途径分别接种9日龄SPF鸡胚(由广东生物药厂提供)，37℃培养30h收取尿囊液，差速离心后用经DEPC处理过的水悬浮病毒。抽提RNA所有用水及水溶液均经DEPC做去RNase处理。加SDS(终浓度2%)和蛋白酶K(终浓度250μg/mL)，55℃作用45min，等量水饱和酚、氯仿/异戊醇(24∶1)各抽提一次，加入2倍体积无水乙醇和1/10体积2mol/L醋酸钠(pH4.0)，-20℃过夜。12000r/min 10min后70%冷乙醇洗涤两次，真空抽干后用水悬浮RNA，95℃变性5min后进入反转录体系。
1.4 RT-PCR 5×缓冲液4μL， RNA样品10μL， 10mmol/L dNTP 2μL，RNasin 1μL，引物P2(20mmol/L) 2μL，AMV RNase (1u/μL Promega) 1μL，共20μL，42℃温育1h后进行PCR。10×缓冲液5μL，RT产物10μL，引物P1(20pmol/L) 1μL，水33μL，95℃变性10min后加1μL Taq酶(1u/μL，BM公司)，石蜡油50μL，混匀后置水浴式PCR自动扩增仪(北京新技术应用研究所)上进行扩增。预先72℃ 2min后再进行93℃ 60s，50℃ 60s，72℃ 180s，共30个循环，72℃后延伸5min，产物于含溴化乙锭(EB)的1.2%琼脂糖凝胶上电泳后紫外检测。
, 百拇医药
1.5 酶切分析 将H、D41及M41毒株的PCR产物分别用BstYI，HaeⅢ和EcoRI(均为Promega产品)，按说明书进行酶切后，在2%琼脂糖凝胶(含EB)上电泳紫外检测。
2 结果与讨论
2.1 PCR产物 IBV的H株、D41株和M41株经RT-PCR扩增后电泳分析表明三者均得到了1.66kb的片段，与预期结果一致(图1)。
2.2 酶切分析 IBV的H株S1基因PCR产物经BstYI酶切得到1.0kb和0.66kb两个片段，经HaeⅢ酶切得到0.9kb、0.4kb和0.36kb三个片段，经EcoR I酶切后仅一条1.66kb片段，证明该PCR产物中无EcoR I酶切位点。IBV的H株与D41株和M41株S1基因PCR产物酶切结果完全一致，按Kwon等的PCR/RFLP分型方法[3]，可判定IBV的H株属于Mass血清型(图1)。
, 百拇医药
图1 IBV的H株S1与其它两株IBV的PCR/RFLP分型的比较
Fig.1 Comparison of pattern of IBV H strain S1 with the other two IBV strains by PCR/RFLP
2.3 由于国内IBV各血清型标准毒株不全，因此，很难用中和试验确定地方分离株的血清型。Kwon等[3]证明IBV S1基因PCR/RFLP分型结果与中和试验测定的血清型一致，PCR/RFLP分型与中和试验相比具有简便、快速的优点。本实验中将IBV的H株S1基因的PCR产物分别用BstYI、HaeⅢ和EcoRI酶切，其结果与D41株和M41株的PCR/RFLP带型完全一致。按Kwon等的判定方法，IBV的H株属于Mass血清型。IBV的H株是从典型肾病变鸡分离得来，D41株为肾变IBV致弱株，它有效防制了许多鸡场肾型IB的发生[2]，然而它们的PCR/RFLP分型却与呼吸道型毒株M41相同。这与Kwon等[3]报道的不同，Kwon证明美国IBV肾变株Gray、Holte与M41的S1基因PCR/RFLP不同，用HaeⅢ酶切可将它们区分开来。廖明等[4]对IBV的D41株S1基因序列分析认为S1基因变异程度与IBV的临诊表现和血清学反应不呈强相关关系，而江国托等[5]研究不同IBV毒株对不同靶器官的组织嗜性，组织培养中和试验和S1基因的PCR/RFLP的结果表明IBV组织嗜性与其血清型和S1基因变异紧密相关。三者确切的相关性还需进一步的试验证明。
, 百拇医药
赵振芬(1965年-),女,河南省新郑市人,硕士,副教授.研究方向为动物病毒学.
参考文献
[1]卡尔尼克 B W主编.高福，刘文军主译.禽病学[M].第9版.北京：北京农业大学出版社，1991.407～418
[2]王林川.禽传染性支气管炎病毒免疫原基因cDNA的构建与鉴定[D].[博士学位论文]，广州，华南农业大学.1994.
[3]Kwon H M,Jackwood M W,Gelb J.Differentiation of infectious bronchitis virus serotypes using polymase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis [J].Avian Disease,1993,37:194～202
[4]廖明.鸡传染性支气管炎病毒D41株S1基因序列测定及同源性分析[D].[博士学位论文].广州：华南农业大学.1997.
[5]江国托，刘思国，步志高，等.鸡传染性支气管炎病毒的组织嗜性与其血清型和S1基因变异的关系[C].中国畜牧兽医学会禽病学分会第九次学术研讨会论文集.广西，南宁.1998.
1998-12-08
1999-04-20, http://www.100md.com