登革病毒NS3全基因的扩增与克隆
作者：江丽芳 晏辉钧 潘文彤 方丹云 郭辉玉
单位：中山医科大学微生物学教研室，广州 510089
关键词：登革病毒NS3基因；逆转录-PCR；分子克隆
中国病毒学000215 中图分类号：R373.33 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)02-0193-04
Amplification and Cloning of NS3 Gene of Dengue Virus
JIANG Li-fang,YAN Hui-jun,PAN Wen-tong,et al.
(Department of Microbiology,Sun Yet-sen University of Medical Siences,Guangzhou 510089,China)
, 百拇医药
Abstract:The RNA of dengue-2 virus (New Guinea C strain,NGC) was extracted from small amount of dengue-2 virus culture supernatant.The large NS3 gene fragment was amplified from RNA of dengue-2 virus with RT-PCR method.The amplified NS3 gene fragment was cloned directly into the pUC18 plasmid vector.The recombinant plasmid was identified by agarose gel electrophoresis analysis after digestion with restriction endonuclease and nested PCR method.The results showed that the amplified NS3 gene fragment was about 1978 bp in length; the recombinant plasmid contained NS3 gene of dengue-2 virus.The method of amplified large fragment of dengue virus from small amount of dengue virus culture supernatant was established.
, 百拇医药
Key words:Dengue virus NS3 gene; RT-PCR; Molecular cloning
登革热(DF)、登革出血热及登革休克综合征(DHF/DSS)是由登革病毒所致的两种不同临床类型的急性传染病，广泛流行于全球热带及亚热带地区。DHF/DSS以高热、出血、休克、高病死率为主要特征，近年来其发病率有迅速增加的趋势，已成为严重影响人类健康的公共卫生问题。迄今，DHF/DSS的发病机制仍不清楚，亦无有效的特异性预防方法[1]。登革病毒属于黄病毒科的黄病毒属，有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个血清型，基因组为单股正链RNA，全长约11kb，编码三种结构蛋白和七种非结构蛋白。基因组顺序为5′-C-PrM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3′。其中NS3基因在黄病毒中具有高度的保守性，基因全长1854bp，编码618个氨基酸、Mr为69kD的NS3蛋白[2]。近年来的研究表明，NS3蛋白是一种多功能蛋白，其N末端具有蛋白酶活性，C末端具有RNA螺旋酶和NTP酶等活性，参与病毒前体蛋白的加工及病毒的复制[3]。该蛋白还具有很好的免疫原性，并存在特异性CD4+和CD8+细胞识别表位，可诱导机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫反应[4]。因此，NS3蛋白对登革病毒的致病与免疫及疫苗的研究具有重要意义。本研究用RT-PCR技术成功地扩增并克隆了登革病毒2型(DV-2) NS3全基因，旨在为进一步研究登革病毒的致病与免疫及发展登革病毒疫苗打下基础。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 病毒与细胞 登革病毒Ⅱ型New Guinea C株(DV-2 NGC株)1978年由法国巴斯德研究所引进，中国药品生物制品检定所赠送。白蚊伊蚊C6/36细胞由本室传代和保存。
1.2 菌种与质粒 pUC18、E.coli JM109为本室保存。
1.3 工具酶和试剂 RNasin、AMV逆转录酶、T4DNA连接酶、IPTG、X-gal、KpnI、XbaI、XhoI、低溶点琼脂糖均为Promega公司产品。Taq DNA聚合酶为加拿大Biostar International Co.产品。
1.4 引物 P1、P2、P3根据DV-2 NGC株核苷酸序列设计，由中国科学院上海细胞生物学研究所合成。P1和P2用于扩增NS3基因，P3为内引物，用于克隆的鉴定。P1：5′-gcctgcagAGCATGGTACCTGTGGGA-3′与病毒RNA的第4488～4504碱基序列的反义股互补。P2：5′-gctctagaGTCCAGTGCGTCTCTTGC-3′与病毒RNA的6453～6435碱基序列的意义股互补(小写斜体字母为所加的酶切位点)，两引物扩增片段的长度为1978bp。P3：5′-GCAGCAAGTATAGCGGCTAG-3′与病毒RNA的5391～5411碱基序列的反义股互补。
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1.5 病毒RNA的提取 用DV-2 NGC株感染C6/36细胞，待细胞病变达2+～3+时，取200μL病毒培养上清液，根据Chomczynskin的异硫氰酸胍氯仿快速一步法[5]略加改良后，提取病毒核酸RNA。简言之，在200μL的病毒培养上清液中加入3倍体积的变性液(含4mol/L异硫氰酸胍，25mmol/L柠檬酸钠，0.5%十二烷基肌氨酸钠)，1/10体积的2mol/L NaAc及等体积水平衡酚和120μL氯仿：异戊醇(49∶1)，轻轻颠倒混匀2～3min，冰浴15min，4℃ 15000r/min，将水相加等体积的异丙醇沉淀30min，沉淀物用70%的乙醇及无水乙醇各洗一次后，真空抽干，溶于去RNA酶的水中。
1.6 RT-PCR 在模板核酸RNA(200μL病毒培养上清液提取的量)中加入P2 1μL(25pmol/L)、10×RT bufffer 2μL、RNasin 0.5μL (20u)、AMV逆转录酶1.8μL(16u)、各为10mmol/L的dNTP 2μL，加入ddH2O使总反应体积为20μL，混匀后，室温放置10min，42℃ 1h，最后用95℃作用5min。PCR总体积为50μL，内含10×PCR buffer 5μL、各为10mmol/L的dNTP 4μL、P1和P2各1μL(15pmol/L)、模板cDNA 5μL、Taq DNA聚合酶2u，在94℃ 50s，55℃ 40s，72℃ 110s循环30次，最后在72℃下延伸反应10min。
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1.7 NS3基因的克隆 重组质粒pUC18-NS3的构建见图1。经纯化的PCR产物和pUC18用KpnI/XbaI分别消化后，经低熔点琼脂糖凝胶回收。连接反应总体积10μL，内含T4DNA连接酶、PCR产物及pUC18，在16℃下连接过夜。连接物转化E.coli JM109受体菌，然后均匀涂布于含IPTG及X-gal的LBA平板上，37℃培养过夜，蓝/白斑筛选阳性克隆。
1.8 NS3基因重组质粒的鉴定 挑取白色菌落接种LBA培养基，碱裂解法提取质粒。所含质粒用kpnI/XbaI、XhoI/XbaI作酶切鉴定，并用P2和P3进行巢式PCR鉴定。
图1 PUC18-NS3重组体的构建
Fig.1 Construction of recombinant plasmid (PUC18-NS3)
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2 结果与讨论
2.1 RT-PCR产物的鉴定 DV-2 RNA经逆转录及用P1、P2为引物作PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳结果表明，扩增的基因片段全长约为1978bp，与预期的结果一致(图2)。
2.2 重组质粒的鉴定 利用PCR及限制性酶切位点，对重组质粒进行鉴定。结果显示，用P1及P2可自重组质粒中扩增出约1978bp的片段。用P2和P3作巢式PCR扩增，获得1065bp的条带(图3)。利用KpnI/XbaI及XhoI/XbaI作双酶切，可分别被切出1964bp和2678bp以及1029bp和3613bp的两种片段(图4)。上述结果均与预期的结果一致。因此，所获得的重组质粒为携带DV-2 NS3全基因的重组质粒。
图2 逆转录PCR产物
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Fig.2 RT-PCR product
图3 巢式PCR产物
Fig.3 Nested PCR product
图4 重组质粒pUC18-NS3限制性酶切图
Fig.4 Restriction enzyme map of the recombinant plasmid pUC18-NS3
Lane 1.Marker
Lane 2.XbaI/XhoI digest
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Lane 3.XbaI/KpnI digest
2.3 登革病毒为RNA病毒，扩增登革病毒的基因片段必须先提取病毒的核酸RNA，用逆转录获取cDNA第一链，再用PCR方法扩增出目的基因片段。关于登革病毒大片段基因的扩增，国内外虽有过一些报道，但大多采用从感染上清液或感染细胞中大量浓缩或纯化病毒后再作病毒RNA提取及RT-PCR的方法[6～8]。我们研究了直接从少量病毒感染上清液用快速一步法提取RNA及RT-PCR扩增登革病毒大片段基因的方法，并成功地克隆了DV-2 NS3全基因。控制变性液的用量，使其多于病毒液的量(3倍)，让病毒充分裂解，避免剧烈震荡，使病毒核酸RNA保持充分的长度，是从少量的核酸RNA中扩增出长片段基因的关键。这种少量快速一步法不仅使冗长而繁琐的病毒大量培养和纯化过程得到简化，而且使在体外培养困难的某些RNA黄病毒的基因克隆成为可能。
由于登革病毒的致病机制尚不清楚，又无有效的疫苗，因此，研究登革病毒基因结构与功能的关系具有重要意义。迄今，国外在这方面做了不少的研究，并取得了较大的进展。我国南方是登革热的高发地区，但我国对登革病毒的研究，特别是对登革病毒分子生物学的研究进展缓慢，虽曾有过研究登革病毒NS1基因和E基因的报道，但未见NS3基因扩增与克隆的报道。本研究利用少量病毒一步法提取病毒核酸RNA及用RT-PCR方法成功地扩增了DV-2的NS3全基因，扩增片段的核苷酸位置为4488～6453nt全长1978bp，并构建了DV-2 NS3全基因的分子克隆，为进一步研究登革病毒NS3结构与功能的关系和开发登革疫苗奠定了基础。
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广东省自然科学基金重点资助项目(5221100203017)
江丽芳(1953年-),女,教授,硕士研究生导师,主要从事病毒致病及免疫分子生物学研究.
参考文献
[1]Gubler DJ.Dengue and dengue hemorrhagic fever[J].Clin Microbiol Rev,1998,11(3):480～496
[2]Hanh YS,Galler R,Hunkapiller T,et al.Nucleotide sequence of dengue 2 RNA and comparison of the encoded proteins with those of other flaviviruses[J].Virology,1988,162:167～180
, 百拇医药
[3]Teo KF,Wright PJ.Internal proteolysis of the NS3 protein specified by dengue virus 2[J].J Gen Virol,1997,78(pt2):337～341
[4]Rothman AL,Kurane I,Ennis FA.Multiple specifications in the murine CD4+ and CD8+ T-cell response to dengue virus[J].J Virol,1996,70(10):6540～6546
[5]Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thocyanate-phenol-chloroform extraction[J].Anal Biochem,1987,162:156～159
, 百拇医药
[6]Garcia G,Vaughn DW,Del-Angel RM.Recognition of synthetic oligopeptides from nonstructural protein NS1 and NS3 of dengue-4 virus by sera from dengue virus-infected children[J].Am J Trop Med Hyp,1997,56(4):466～470
[7]Chen WB,Qu XY,Del-Terry M.A simple and rapid method of preparing large fragments of dengue virus cDNA from replicative-form RNA using reverse transcriptase and PCR[J].J Virol Methods,1992,39(1-2):197～206
[8]于曼，秦鄂德，韩照中,等.登革2型43株病毒包膜蛋白E基因的聚合酶链式反应扩增[J].中华实验与临床病毒学杂志，1995，9(2)：103～106
1998-12-09
1999-03-01, 百拇医药
单位：中山医科大学微生物学教研室，广州 510089
关键词：登革病毒NS3基因；逆转录-PCR；分子克隆
中国病毒学000215 中图分类号：R373.33 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)02-0193-04
Amplification and Cloning of NS3 Gene of Dengue Virus
JIANG Li-fang,YAN Hui-jun,PAN Wen-tong,et al.
(Department of Microbiology,Sun Yet-sen University of Medical Siences,Guangzhou 510089,China)
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Abstract:The RNA of dengue-2 virus (New Guinea C strain,NGC) was extracted from small amount of dengue-2 virus culture supernatant.The large NS3 gene fragment was amplified from RNA of dengue-2 virus with RT-PCR method.The amplified NS3 gene fragment was cloned directly into the pUC18 plasmid vector.The recombinant plasmid was identified by agarose gel electrophoresis analysis after digestion with restriction endonuclease and nested PCR method.The results showed that the amplified NS3 gene fragment was about 1978 bp in length; the recombinant plasmid contained NS3 gene of dengue-2 virus.The method of amplified large fragment of dengue virus from small amount of dengue virus culture supernatant was established.
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Key words:Dengue virus NS3 gene; RT-PCR; Molecular cloning
登革热(DF)、登革出血热及登革休克综合征(DHF/DSS)是由登革病毒所致的两种不同临床类型的急性传染病，广泛流行于全球热带及亚热带地区。DHF/DSS以高热、出血、休克、高病死率为主要特征，近年来其发病率有迅速增加的趋势，已成为严重影响人类健康的公共卫生问题。迄今，DHF/DSS的发病机制仍不清楚，亦无有效的特异性预防方法[1]。登革病毒属于黄病毒科的黄病毒属，有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个血清型，基因组为单股正链RNA，全长约11kb，编码三种结构蛋白和七种非结构蛋白。基因组顺序为5′-C-PrM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3′。其中NS3基因在黄病毒中具有高度的保守性，基因全长1854bp，编码618个氨基酸、Mr为69kD的NS3蛋白[2]。近年来的研究表明，NS3蛋白是一种多功能蛋白，其N末端具有蛋白酶活性，C末端具有RNA螺旋酶和NTP酶等活性，参与病毒前体蛋白的加工及病毒的复制[3]。该蛋白还具有很好的免疫原性，并存在特异性CD4+和CD8+细胞识别表位，可诱导机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫反应[4]。因此，NS3蛋白对登革病毒的致病与免疫及疫苗的研究具有重要意义。本研究用RT-PCR技术成功地扩增并克隆了登革病毒2型(DV-2) NS3全基因，旨在为进一步研究登革病毒的致病与免疫及发展登革病毒疫苗打下基础。
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1 材料与方法
1.1 病毒与细胞 登革病毒Ⅱ型New Guinea C株(DV-2 NGC株)1978年由法国巴斯德研究所引进，中国药品生物制品检定所赠送。白蚊伊蚊C6/36细胞由本室传代和保存。
1.2 菌种与质粒 pUC18、E.coli JM109为本室保存。
1.3 工具酶和试剂 RNasin、AMV逆转录酶、T4DNA连接酶、IPTG、X-gal、KpnI、XbaI、XhoI、低溶点琼脂糖均为Promega公司产品。Taq DNA聚合酶为加拿大Biostar International Co.产品。
1.4 引物 P1、P2、P3根据DV-2 NGC株核苷酸序列设计，由中国科学院上海细胞生物学研究所合成。P1和P2用于扩增NS3基因，P3为内引物，用于克隆的鉴定。P1：5′-gcctgcagAGCATGGTACCTGTGGGA-3′与病毒RNA的第4488～4504碱基序列的反义股互补。P2：5′-gctctagaGTCCAGTGCGTCTCTTGC-3′与病毒RNA的6453～6435碱基序列的意义股互补(小写斜体字母为所加的酶切位点)，两引物扩增片段的长度为1978bp。P3：5′-GCAGCAAGTATAGCGGCTAG-3′与病毒RNA的5391～5411碱基序列的反义股互补。
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1.5 病毒RNA的提取 用DV-2 NGC株感染C6/36细胞，待细胞病变达2+～3+时，取200μL病毒培养上清液，根据Chomczynskin的异硫氰酸胍氯仿快速一步法[5]略加改良后，提取病毒核酸RNA。简言之，在200μL的病毒培养上清液中加入3倍体积的变性液(含4mol/L异硫氰酸胍，25mmol/L柠檬酸钠，0.5%十二烷基肌氨酸钠)，1/10体积的2mol/L NaAc及等体积水平衡酚和120μL氯仿：异戊醇(49∶1)，轻轻颠倒混匀2～3min，冰浴15min，4℃ 15000r/min，将水相加等体积的异丙醇沉淀30min，沉淀物用70%的乙醇及无水乙醇各洗一次后，真空抽干，溶于去RNA酶的水中。
1.6 RT-PCR 在模板核酸RNA(200μL病毒培养上清液提取的量)中加入P2 1μL(25pmol/L)、10×RT bufffer 2μL、RNasin 0.5μL (20u)、AMV逆转录酶1.8μL(16u)、各为10mmol/L的dNTP 2μL，加入ddH2O使总反应体积为20μL，混匀后，室温放置10min，42℃ 1h，最后用95℃作用5min。PCR总体积为50μL，内含10×PCR buffer 5μL、各为10mmol/L的dNTP 4μL、P1和P2各1μL(15pmol/L)、模板cDNA 5μL、Taq DNA聚合酶2u，在94℃ 50s，55℃ 40s，72℃ 110s循环30次，最后在72℃下延伸反应10min。
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1.7 NS3基因的克隆 重组质粒pUC18-NS3的构建见图1。经纯化的PCR产物和pUC18用KpnI/XbaI分别消化后，经低熔点琼脂糖凝胶回收。连接反应总体积10μL，内含T4DNA连接酶、PCR产物及pUC18，在16℃下连接过夜。连接物转化E.coli JM109受体菌，然后均匀涂布于含IPTG及X-gal的LBA平板上，37℃培养过夜，蓝/白斑筛选阳性克隆。
1.8 NS3基因重组质粒的鉴定 挑取白色菌落接种LBA培养基，碱裂解法提取质粒。所含质粒用kpnI/XbaI、XhoI/XbaI作酶切鉴定，并用P2和P3进行巢式PCR鉴定。
图1 PUC18-NS3重组体的构建
Fig.1 Construction of recombinant plasmid (PUC18-NS3)
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2 结果与讨论
2.1 RT-PCR产物的鉴定 DV-2 RNA经逆转录及用P1、P2为引物作PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳结果表明，扩增的基因片段全长约为1978bp，与预期的结果一致(图2)。
2.2 重组质粒的鉴定 利用PCR及限制性酶切位点，对重组质粒进行鉴定。结果显示，用P1及P2可自重组质粒中扩增出约1978bp的片段。用P2和P3作巢式PCR扩增，获得1065bp的条带(图3)。利用KpnI/XbaI及XhoI/XbaI作双酶切，可分别被切出1964bp和2678bp以及1029bp和3613bp的两种片段(图4)。上述结果均与预期的结果一致。因此，所获得的重组质粒为携带DV-2 NS3全基因的重组质粒。
图2 逆转录PCR产物
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Fig.2 RT-PCR product
图3 巢式PCR产物
Fig.3 Nested PCR product
图4 重组质粒pUC18-NS3限制性酶切图
Fig.4 Restriction enzyme map of the recombinant plasmid pUC18-NS3
Lane 1.Marker
Lane 2.XbaI/XhoI digest
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Lane 3.XbaI/KpnI digest
2.3 登革病毒为RNA病毒，扩增登革病毒的基因片段必须先提取病毒的核酸RNA，用逆转录获取cDNA第一链，再用PCR方法扩增出目的基因片段。关于登革病毒大片段基因的扩增，国内外虽有过一些报道，但大多采用从感染上清液或感染细胞中大量浓缩或纯化病毒后再作病毒RNA提取及RT-PCR的方法[6～8]。我们研究了直接从少量病毒感染上清液用快速一步法提取RNA及RT-PCR扩增登革病毒大片段基因的方法，并成功地克隆了DV-2 NS3全基因。控制变性液的用量，使其多于病毒液的量(3倍)，让病毒充分裂解，避免剧烈震荡，使病毒核酸RNA保持充分的长度，是从少量的核酸RNA中扩增出长片段基因的关键。这种少量快速一步法不仅使冗长而繁琐的病毒大量培养和纯化过程得到简化，而且使在体外培养困难的某些RNA黄病毒的基因克隆成为可能。
由于登革病毒的致病机制尚不清楚，又无有效的疫苗，因此，研究登革病毒基因结构与功能的关系具有重要意义。迄今，国外在这方面做了不少的研究，并取得了较大的进展。我国南方是登革热的高发地区，但我国对登革病毒的研究，特别是对登革病毒分子生物学的研究进展缓慢，虽曾有过研究登革病毒NS1基因和E基因的报道，但未见NS3基因扩增与克隆的报道。本研究利用少量病毒一步法提取病毒核酸RNA及用RT-PCR方法成功地扩增了DV-2的NS3全基因，扩增片段的核苷酸位置为4488～6453nt全长1978bp，并构建了DV-2 NS3全基因的分子克隆，为进一步研究登革病毒NS3结构与功能的关系和开发登革疫苗奠定了基础。
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江丽芳(1953年-),女,教授,硕士研究生导师,主要从事病毒致病及免疫分子生物学研究.
参考文献
[1]Gubler DJ.Dengue and dengue hemorrhagic fever[J].Clin Microbiol Rev,1998,11(3):480～496
[2]Hanh YS,Galler R,Hunkapiller T,et al.Nucleotide sequence of dengue 2 RNA and comparison of the encoded proteins with those of other flaviviruses[J].Virology,1988,162:167～180
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[3]Teo KF,Wright PJ.Internal proteolysis of the NS3 protein specified by dengue virus 2[J].J Gen Virol,1997,78(pt2):337～341
[4]Rothman AL,Kurane I,Ennis FA.Multiple specifications in the murine CD4+ and CD8+ T-cell response to dengue virus[J].J Virol,1996,70(10):6540～6546
[5]Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thocyanate-phenol-chloroform extraction[J].Anal Biochem,1987,162:156～159
, 百拇医药
[6]Garcia G,Vaughn DW,Del-Angel RM.Recognition of synthetic oligopeptides from nonstructural protein NS1 and NS3 of dengue-4 virus by sera from dengue virus-infected children[J].Am J Trop Med Hyp,1997,56(4):466～470
[7]Chen WB,Qu XY,Del-Terry M.A simple and rapid method of preparing large fragments of dengue virus cDNA from replicative-form RNA using reverse transcriptase and PCR[J].J Virol Methods,1992,39(1-2):197～206
[8]于曼，秦鄂德，韩照中,等.登革2型43株病毒包膜蛋白E基因的聚合酶链式反应扩增[J].中华实验与临床病毒学杂志，1995，9(2)：103～106
1998-12-09
1999-03-01, 百拇医药