肺癌抑癌基因P16，P53的表达及DNA倍体研究
作者：王立新 胡萍 吴秋云 牛兆山
单位：王立新(江苏淮阴市第一人民医院、呼吸科 淮阴 223300)；胡萍(江苏淮阴市第一人民医院、呼吸科 淮阴 223300)；吴秋云(江苏淮阴市第一人民医院、呼吸科 淮阴 223300)；牛兆山(青岛大学医学院病理教研室)
关键词：肺癌；基因P16，P53；免疫组织化学；DNA含量
肺癌抑癌基因P16 〔摘要〕 目的 研究P16，P53基因在人肺癌中的表达和DNA倍体的关系及意义。方法 以SP免疫组化法检测肺癌组织中P16，P53表达，图像分析仪测定DNA倍体。结果 P16在肺癌表达阳性率为51.2%，低于癌旁组织(P<0.05)，腺癌P16阳性率最高为68.8%，高于鳞癌及未分化癌(P<0.05)，P53在肺癌表达阳性率为80.5%，明显高于癌旁组织(P<0.01)其中鳞癌阳性率高于其他组织类型(P<0.05)，在有淋巴结转移和无淋巴结转移组间及Ⅰ、Ⅱ期与Ⅲ、Ⅳ期两组间，P16和P53表达阳性率均有显著差异(P<0.01)。同时发现二倍体P16阳性率，P53阴性率均显著高于异倍体(P<0.05)。结论 P16和P53基因异常与肺癌发生有关，且在不同类型肺癌发生中的作用不同，可作为判断肺癌生物学行为和预后的参考指标。
, 百拇医药
〔中图分类号〕 R734.2 〔文献标识码〕A
Study on P16 and P53 expressions and cellular DNA content in lung cancer
WANG Li-xin, Hu-ping, WU Qiu-yun et al.
(The First Municipal Hospital of Huai yin, Huaiyin 223300)
〔Abstract〕 Objective To study the relation and significance of tumor suppresor gene P16 and P53 expression and cellular DNA content in lung cancer.Methods The expresion of P16 and P53 protein was determined by immunohistochemical method.The cellular DNA content was assessed by image analysis system.Results Of 82 patients examined,51.2% showed P16 positive staining.Adenocarcinomas exhibited the highest P16 expression levels compared with squamous cell carcinomas and small cell carcinomas (P<0.05).In lung cancer tissues,P53 positive staining rate was 80.5%,It was higher than that of tissues adjacent to carcinoma (P<0.01),and the rate of P53 positive staining in squamous cell carcinomas was the hightest(P<0.05).The levels of P16 and P53 were significantly both in group of hilar or mediastinal lymph node metastases and in group of different clinical stages (P<0.01) respectively.P16 positive staining rate in diploidy was higher than that in aneuploidy,meanwhile the rate of P53 was low (P<0.05).Conclusions Gene P16 and P53 play important roles in carcinogenesis and progression of lung cancer and correlated with the biological behavior and prognosis of lung cancer.
, 百拇医药
〔Key words〕 lung cancer;gene P16;gene P53;immunohistochemistry; DNA content
现代遗传学研究显示肺癌的发生发展是个逐渐演化的过程，该过程涉及到众多原癌基因的激活和抑癌基因的失活。其中抑癌基因P16，P53更受重视。为观察二者在肺癌中表达的意义，我们应用免疫组化法及图像分析仪对82例人肺癌石蜡切片进行检测。
材料和方法
一、标本：将1996年4月—1999年3月经手术的82例肺癌标本作为研究对象，取材后，经10%福尔马林固定，石蜡包埋，每例均制成5um连续切片4张，一张HE染色复查诊断，两张分别行P16，P53免疫组化染色，另一张经图像分析仪测DNA含量，按WHO(1981)组织学分类标准，计鳞癌39例，腺癌32例，小细胞未分化癌7例，大细胞癌4例，按国际PTNM分期，Ⅰ期7例，Ⅱ期38例，Ⅲ期33例，Ⅳ期4例。
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二、免疫组织化学染色：用链菌素亲生物素-过氧化物酶法(SP法)。试剂盒及兔抗人P16多克隆抗体及鼠抗人P53单克隆抗体均为美国Maxim公司产品(购于福州迈新生物技术公司)，染色具体步骤按说明书进行。实验中以乳癌阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照，以细胞呈清晰棕色为阳性表现，以阳性细胞数>5%定为“+”。
三、图像分析处理：石蜡切片经Feulgen染色，以OPTON显微镜，VIDAS21分析系统行DNA倍体分析，在固定光路及光强度下，随机测100个完整而不重叠细胞，计算细胞核积分光密度值(OPTDI)，同时每张切片测定同片淋巴细胞作为二倍体细胞DNA含量对照值。DNA含量分析以OPTDI为基准，DNA倍体均值(U值)为肿瘤细胞的OPTDI与淋巴细胞OPTDI平均值的比值。
结果
一、P16，P53蛋白在肺癌细胞中定位：P16蛋白染色绝大部分为胞浆呈清晰棕色弥漫分布表达，少见有胞核染色。P53表达多为胞核染色，少见有胞浆染色。
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二、肺癌组织P16，P53的表达：P16蛋白在肺癌组织中表达的阳性率为51.2%，其中腺癌P16蛋白阳性率为68.8%，明显高于鳞癌和未分化癌，(P<0.05)，鳞癌P16蛋白阳性率高于未分化细胞癌，但无显著差异。癌旁组织P16蛋白阳性率为80.0%，显著高于在肺癌组织中的阳性率(P<0.05)。P53蛋白在肺癌组织中表达总阳性率为80.5%，在癌旁组织中为30.0%，前者明显高于后者。而鳞癌P53阳性率高于其他组织类型，差异显著(P<0.05)。见表1。
表1 肺癌组织P16，P53蛋白的表达
组织类型
例数
P16阳性(%)
P53阳性(%)
鳞癌
, http://www.100md.com
39
17(43.6)
33(84.6)
腺癌
32
22(68.8)
32(81.3)
小细胞未分化癌
7
2(28.5)
4(57.1)
大细胞未分化癌
4
, http://www.100md.com
1(25.0)
3(75.0)
癌旁组织
10
8(80.0)
3(30.0)
三、P16，P53表达与肺癌淋巴结转移和PTNM分期的关系：本组研究中，无淋巴结转移者有35例，其中，P16阳性26例(74.3%)，P53阳性25例(71.4%)，同时表达为P16阴性P53阳性有5例(14.3%)。有淋巴结转移者有47例，其中P16阳性16例(34.0%)，P53阳性41例(87.2%)，同时表达为P16阴性P53阳性有28例(59.6%)。两组间对比，P16阳性率差异显著(P<0.05)，同时表达P16阴性P53阳性率差异极显著(P<0.01)，提示P16蛋白表达与淋巴结转移有关。不同分期的肺癌组织间P16和P53阳性率差异显著(P<0.05)。见表2 表2 P16，P53表达与肺癌淋巴结转移和PTNM分期的关系
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例数
P16阳性(%)
P53阳性(%)
P16阴性
P53阳性(%)
淋巴结转移
NO
35
26(74.3%)
25(71.4%)
2(5.7%)
N1～N3
, http://www.100md.com 47
16(34.0%)
41(87.2%)
31(66.0%)
分期
Ⅰ～Ⅱ
45
32(71.5%)
29(64.4%)
7(15.6%)
Ⅲ～Ⅳ
37
10(27.0%)
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37(100%)
26(70.3%)
四、P16，P53表达与其DNA倍体类型的关系：经图像分析仪检测共有二倍体21例，异倍体61例，两组间P16阳性率分别为85.7%和39.3%(P<0.01)。两组间P53阳性率分别为47.6%和91.8%(P<0.5)其中表达为P16阴性和P53阳性共33例，二倍体4例(12.1%)，异倍体29例(87.9%)(P<0.01)。见表3。 表3 P16，P53表达与其DNA倍体的关系
DNA倍体型
例数
P16阳性(%)
P53阳性(%)
P16阴性
, http://www.100md.com
P53阳性(%)
二倍体
21
18(85.7%)
10(47.6%)
3(14.3%)
异倍体
61
24(39.3%)
56(91.8%)
30(49.2%)
讨论
, http://www.100md.com
肿瘤的发生是一个复杂的生物学过程，有很多癌基因和抑癌基因的变异参与这个过程的不同阶段。DNA是细胞的遗传物质，是维持细胞生长和分化的重要因素。抑癌基因则为DNA大分子上的某一片断，对人肺癌细胞同时进行抑癌基因表达蛋白和DNA含量的检测并作综合分析，可对肺癌发生发展过程有更深入的认识。
抑癌基因P53的蛋白产物主要生化功能是控制转录因子，其突变后成为肿瘤形成和发展重要因子，免疫组化法可检测到这种突变型P53蛋白，以往研究发现P53突变与肺癌关系密切[1]。P16蛋白是多肿瘤抑制基因(MTS1)产物，抑制细胞G1→S期，参与多细胞周期因子的调节，故具抑制肿瘤生长的作用，其失活将会促进肿瘤生长[2]。已有研究发现P16失活的肿瘤细胞生存时间延长，恶性程度增高，转移能力增强[3]。本组结果显示P53蛋白在肺癌组织表达阳性率为80.5%，明显高于癌旁组织，鳞癌表达高于其他组织类型，(P<0.05)。P16蛋白在肺癌组织表达阳性率为51.2%低于癌旁组织，而又以腺癌P16表达阳性率高于其他组织类型，同田辉等的研究相符，说明P53，P16异常在不同类型肺癌发生过程中作用不同[4]。
, 百拇医药
无淋巴结转移肺癌组织P53阳性率为71.4%，P16阳性率为74.3%；有淋巴结转移肺癌组织P53阳性率87.2%，P16阳性率为34.0%，两组之间P53阳性率后者为高，但无显著差异。而无淋巴结转移组P16阳性率明显高于有淋巴结转移组，其中，无淋巴结转移组中，同时表达为P16阴性和P53阳性的比例为5.7%，有淋巴结转移组中同时表达为P16阴性和P53阳性率为66.0%，差异极显著。证实P16失活之肺癌组织恶性程度增高，转移能力增强。本研究同时发现Ⅰ和Ⅱ期肺癌组织中P53阳性率明显低于Ⅲ和Ⅳ期肺癌，而P16阳性率明显高于Ⅲ和Ⅳ期肺癌，提示P53与P16失活与肿瘤进展有关[5]。
82例肺癌组织切片经图像分析仪处理，有二倍体21例，异倍体61例。P16阳性率在二倍体组阳性率为85.7%，显著高于异倍体组(P<0.01)，而P53阳性率在二倍体组显著低于异倍体组，从另一角度证实P16与P53表达与肺癌恶性程度有关。
基金项目：淮阴市科委资助项目(S9635)
, http://www.100md.com
作者简介：王立新(1966-)，男，淮阴人，硕士，主治医师。从事呼吸内科专业。
参考文献
1，姜奕，何安光.肺癌抑癌基因P53产物的免疫组织化学研究.中华结核和呼吸杂志，1994；2：45
2，Nishikawa R,Frank BF,Hong Lin et al.Loss of P16 IND4A expression is frequent in high grade gliomas.Cancer Res.1995;55:1941
3，Shapir GI,Rollins BJ.P16 ink4a as a human tumor suppressor.Bioch Biophys Acta.1996;1242:165
4，田辉，王善镇，张廷国等.抑癌基因P16在肺癌组织中的表达及意义.中国肿瘤临床，1999;1：30
5，Gruis NA,Jane WF,Lin QY et al.Genetic evidence in melanoma and bladder cancers that P16 and P53 function in separate pathways of tumor suppression .Am J Pathol,1995;146:1199
收稿日期：1999-7-16, 百拇医药
单位：王立新(江苏淮阴市第一人民医院、呼吸科 淮阴 223300)；胡萍(江苏淮阴市第一人民医院、呼吸科 淮阴 223300)；吴秋云(江苏淮阴市第一人民医院、呼吸科 淮阴 223300)；牛兆山(青岛大学医学院病理教研室)
关键词：肺癌；基因P16，P53；免疫组织化学；DNA含量
肺癌抑癌基因P16 〔摘要〕 目的 研究P16，P53基因在人肺癌中的表达和DNA倍体的关系及意义。方法 以SP免疫组化法检测肺癌组织中P16，P53表达，图像分析仪测定DNA倍体。结果 P16在肺癌表达阳性率为51.2%，低于癌旁组织(P<0.05)，腺癌P16阳性率最高为68.8%，高于鳞癌及未分化癌(P<0.05)，P53在肺癌表达阳性率为80.5%，明显高于癌旁组织(P<0.01)其中鳞癌阳性率高于其他组织类型(P<0.05)，在有淋巴结转移和无淋巴结转移组间及Ⅰ、Ⅱ期与Ⅲ、Ⅳ期两组间，P16和P53表达阳性率均有显著差异(P<0.01)。同时发现二倍体P16阳性率，P53阴性率均显著高于异倍体(P<0.05)。结论 P16和P53基因异常与肺癌发生有关，且在不同类型肺癌发生中的作用不同，可作为判断肺癌生物学行为和预后的参考指标。
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〔中图分类号〕 R734.2 〔文献标识码〕A
Study on P16 and P53 expressions and cellular DNA content in lung cancer
WANG Li-xin, Hu-ping, WU Qiu-yun et al.
(The First Municipal Hospital of Huai yin, Huaiyin 223300)
〔Abstract〕 Objective To study the relation and significance of tumor suppresor gene P16 and P53 expression and cellular DNA content in lung cancer.Methods The expresion of P16 and P53 protein was determined by immunohistochemical method.The cellular DNA content was assessed by image analysis system.Results Of 82 patients examined,51.2% showed P16 positive staining.Adenocarcinomas exhibited the highest P16 expression levels compared with squamous cell carcinomas and small cell carcinomas (P<0.05).In lung cancer tissues,P53 positive staining rate was 80.5%,It was higher than that of tissues adjacent to carcinoma (P<0.01),and the rate of P53 positive staining in squamous cell carcinomas was the hightest(P<0.05).The levels of P16 and P53 were significantly both in group of hilar or mediastinal lymph node metastases and in group of different clinical stages (P<0.01) respectively.P16 positive staining rate in diploidy was higher than that in aneuploidy,meanwhile the rate of P53 was low (P<0.05).Conclusions Gene P16 and P53 play important roles in carcinogenesis and progression of lung cancer and correlated with the biological behavior and prognosis of lung cancer.
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〔Key words〕 lung cancer;gene P16;gene P53;immunohistochemistry; DNA content
现代遗传学研究显示肺癌的发生发展是个逐渐演化的过程，该过程涉及到众多原癌基因的激活和抑癌基因的失活。其中抑癌基因P16，P53更受重视。为观察二者在肺癌中表达的意义，我们应用免疫组化法及图像分析仪对82例人肺癌石蜡切片进行检测。
材料和方法
一、标本：将1996年4月—1999年3月经手术的82例肺癌标本作为研究对象，取材后，经10%福尔马林固定，石蜡包埋，每例均制成5um连续切片4张，一张HE染色复查诊断，两张分别行P16，P53免疫组化染色，另一张经图像分析仪测DNA含量，按WHO(1981)组织学分类标准，计鳞癌39例，腺癌32例，小细胞未分化癌7例，大细胞癌4例，按国际PTNM分期，Ⅰ期7例，Ⅱ期38例，Ⅲ期33例，Ⅳ期4例。
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二、免疫组织化学染色：用链菌素亲生物素-过氧化物酶法(SP法)。试剂盒及兔抗人P16多克隆抗体及鼠抗人P53单克隆抗体均为美国Maxim公司产品(购于福州迈新生物技术公司)，染色具体步骤按说明书进行。实验中以乳癌阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照，以细胞呈清晰棕色为阳性表现，以阳性细胞数>5%定为“+”。
三、图像分析处理：石蜡切片经Feulgen染色，以OPTON显微镜，VIDAS21分析系统行DNA倍体分析，在固定光路及光强度下，随机测100个完整而不重叠细胞，计算细胞核积分光密度值(OPTDI)，同时每张切片测定同片淋巴细胞作为二倍体细胞DNA含量对照值。DNA含量分析以OPTDI为基准，DNA倍体均值(U值)为肿瘤细胞的OPTDI与淋巴细胞OPTDI平均值的比值。
结果
一、P16，P53蛋白在肺癌细胞中定位：P16蛋白染色绝大部分为胞浆呈清晰棕色弥漫分布表达，少见有胞核染色。P53表达多为胞核染色，少见有胞浆染色。
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二、肺癌组织P16，P53的表达：P16蛋白在肺癌组织中表达的阳性率为51.2%，其中腺癌P16蛋白阳性率为68.8%，明显高于鳞癌和未分化癌，(P<0.05)，鳞癌P16蛋白阳性率高于未分化细胞癌，但无显著差异。癌旁组织P16蛋白阳性率为80.0%，显著高于在肺癌组织中的阳性率(P<0.05)。P53蛋白在肺癌组织中表达总阳性率为80.5%，在癌旁组织中为30.0%，前者明显高于后者。而鳞癌P53阳性率高于其他组织类型，差异显著(P<0.05)。见表1。
表1 肺癌组织P16，P53蛋白的表达
组织类型
例数
P16阳性(%)
P53阳性(%)
鳞癌
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39
17(43.6)
33(84.6)
腺癌
32
22(68.8)
32(81.3)
小细胞未分化癌
7
2(28.5)
4(57.1)
大细胞未分化癌
4
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1(25.0)
3(75.0)
癌旁组织
10
8(80.0)
3(30.0)
三、P16，P53表达与肺癌淋巴结转移和PTNM分期的关系：本组研究中，无淋巴结转移者有35例，其中，P16阳性26例(74.3%)，P53阳性25例(71.4%)，同时表达为P16阴性P53阳性有5例(14.3%)。有淋巴结转移者有47例，其中P16阳性16例(34.0%)，P53阳性41例(87.2%)，同时表达为P16阴性P53阳性有28例(59.6%)。两组间对比，P16阳性率差异显著(P<0.05)，同时表达P16阴性P53阳性率差异极显著(P<0.01)，提示P16蛋白表达与淋巴结转移有关。不同分期的肺癌组织间P16和P53阳性率差异显著(P<0.05)。见表2 表2 P16，P53表达与肺癌淋巴结转移和PTNM分期的关系
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例数
P16阳性(%)
P53阳性(%)
P16阴性
P53阳性(%)
淋巴结转移
NO
35
26(74.3%)
25(71.4%)
2(5.7%)
N1～N3
, http://www.100md.com 47
16(34.0%)
41(87.2%)
31(66.0%)
分期
Ⅰ～Ⅱ
45
32(71.5%)
29(64.4%)
7(15.6%)
Ⅲ～Ⅳ
37
10(27.0%)
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37(100%)
26(70.3%)
四、P16，P53表达与其DNA倍体类型的关系：经图像分析仪检测共有二倍体21例，异倍体61例，两组间P16阳性率分别为85.7%和39.3%(P<0.01)。两组间P53阳性率分别为47.6%和91.8%(P<0.5)其中表达为P16阴性和P53阳性共33例，二倍体4例(12.1%)，异倍体29例(87.9%)(P<0.01)。见表3。 表3 P16，P53表达与其DNA倍体的关系
DNA倍体型
例数
P16阳性(%)
P53阳性(%)
P16阴性
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P53阳性(%)
二倍体
21
18(85.7%)
10(47.6%)
3(14.3%)
异倍体
61
24(39.3%)
56(91.8%)
30(49.2%)
讨论
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肿瘤的发生是一个复杂的生物学过程，有很多癌基因和抑癌基因的变异参与这个过程的不同阶段。DNA是细胞的遗传物质，是维持细胞生长和分化的重要因素。抑癌基因则为DNA大分子上的某一片断，对人肺癌细胞同时进行抑癌基因表达蛋白和DNA含量的检测并作综合分析，可对肺癌发生发展过程有更深入的认识。
抑癌基因P53的蛋白产物主要生化功能是控制转录因子，其突变后成为肿瘤形成和发展重要因子，免疫组化法可检测到这种突变型P53蛋白，以往研究发现P53突变与肺癌关系密切[1]。P16蛋白是多肿瘤抑制基因(MTS1)产物，抑制细胞G1→S期，参与多细胞周期因子的调节，故具抑制肿瘤生长的作用，其失活将会促进肿瘤生长[2]。已有研究发现P16失活的肿瘤细胞生存时间延长，恶性程度增高，转移能力增强[3]。本组结果显示P53蛋白在肺癌组织表达阳性率为80.5%，明显高于癌旁组织，鳞癌表达高于其他组织类型，(P<0.05)。P16蛋白在肺癌组织表达阳性率为51.2%低于癌旁组织，而又以腺癌P16表达阳性率高于其他组织类型，同田辉等的研究相符，说明P53，P16异常在不同类型肺癌发生过程中作用不同[4]。
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无淋巴结转移肺癌组织P53阳性率为71.4%，P16阳性率为74.3%；有淋巴结转移肺癌组织P53阳性率87.2%，P16阳性率为34.0%，两组之间P53阳性率后者为高，但无显著差异。而无淋巴结转移组P16阳性率明显高于有淋巴结转移组，其中，无淋巴结转移组中，同时表达为P16阴性和P53阳性的比例为5.7%，有淋巴结转移组中同时表达为P16阴性和P53阳性率为66.0%，差异极显著。证实P16失活之肺癌组织恶性程度增高，转移能力增强。本研究同时发现Ⅰ和Ⅱ期肺癌组织中P53阳性率明显低于Ⅲ和Ⅳ期肺癌，而P16阳性率明显高于Ⅲ和Ⅳ期肺癌，提示P53与P16失活与肿瘤进展有关[5]。
82例肺癌组织切片经图像分析仪处理，有二倍体21例，异倍体61例。P16阳性率在二倍体组阳性率为85.7%，显著高于异倍体组(P<0.01)，而P53阳性率在二倍体组显著低于异倍体组，从另一角度证实P16与P53表达与肺癌恶性程度有关。
基金项目：淮阴市科委资助项目(S9635)
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作者简介：王立新(1966-)，男，淮阴人，硕士，主治医师。从事呼吸内科专业。
参考文献
1，姜奕，何安光.肺癌抑癌基因P53产物的免疫组织化学研究.中华结核和呼吸杂志，1994；2：45
2，Nishikawa R,Frank BF,Hong Lin et al.Loss of P16 IND4A expression is frequent in high grade gliomas.Cancer Res.1995;55:1941
3，Shapir GI,Rollins BJ.P16 ink4a as a human tumor suppressor.Bioch Biophys Acta.1996;1242:165
4，田辉，王善镇，张廷国等.抑癌基因P16在肺癌组织中的表达及意义.中国肿瘤临床，1999;1：30
5，Gruis NA,Jane WF,Lin QY et al.Genetic evidence in melanoma and bladder cancers that P16 and P53 function in separate pathways of tumor suppression .Am J Pathol,1995;146:1199
收稿日期：1999-7-16, 百拇医药