心肌肽素对大鼠心脏缺血-再灌注损伤的预防作用
作者：杨联萍 万华印 孔祥平 吴艳 腾健 范礼理
单位：杨联萍(中国人民解放军第458医院 传染病中心分子生物学科，广东 广州510602)；万华印(中国人民解放军第458医院 传染病中心分子生物学科，广东 广州510602)；孔祥平(中国人民解放军第458医院 传染病中心分子生物学科，广东 广州510602)；吴艳(中国医学科学院 中国协和医科大学 药物研究所，北京 100050)；腾健(中国医学科学院 中国协和医科大学 药物研究所，北京 100050)；范礼理(中国医学科学院 中国协和医科大学 药物研究所，北京 100050)
关键词：多肽；心肌肽素；再灌注损伤；心肌酶
摘 要摘 要：目的：研究小分子多肽类物质心肌肽素对大鼠心脏缺血-再灌注损伤的预防作用。方法：在大鼠冠脉结扎致心肌缺血-再灌注损伤模型上，观察心肌肽素预防性给药对缺血大鼠血浆中肌酸磷酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)活性及脂质过氧化物终产物(MDA)含量的影响。结果：心肌肽素预防性给药能明显降低血浆CPK，LDH的活性与MDA含量，其作用具有明显的量效关系。结论：心肌肽素对心脏缺血-再灌注损伤有预防作用，这可能与其减少心肌酶的释放及抗心肌脂质过氧化有关。
, http://www.100md.com
Preventive Effect of Cardiomyopeptidin on
Rat Heart Injured by Ischemia-Reperfusion
YANG Lian-ping WAN Hua-yin KONG Xiang-ping
(1.Department of Molecular Biology,Infectious Diseases Center,458th Hospital of PLA,Guangdong Guangzhou 510602,China)
WU Yan TENG Jian FAN Li-li
(Institute of Materia Medica,Chinese Academy of
, 百拇医药
Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050,China)
Abstract：Objective:To investigate the preventive effect of cardiomyopeptidin of small molecular weight polypeptide on rat hearts injured by ischemia-reperfusion.Methods:In a rat model injured by ischemia-reperfusion in the heart,observation was made on the influence of cardiomyopeptidin on the activities of creatine kinase(CK)and lactate dehydrogenase(LDH),as well as on the content of MDA in plasma after the preventive drug was used.Results:Cardiomyopeptidin could obviously prevent the injury caused by ischemia-reperfusion,reduce the activities of CK and LDH and the content of MDA in a dose-dependentmanner.Conclusion:Cardiomyopeptidinhas a preventive effect on myocardium injured by ischemia-reperfusion and this may be related to its reducing the release of myocardial enzyme and anti-lipoperoxidation.
, http://www.100md.com
Key words：polypeptide;cardiomyopeptidin;rat heart injured by ischemia-reperfusion;myocardial enzyme.▲
动物脏器是中药的重要组成部分[1]。利用生化技术提取脏器中有效成分应用于临床已有报道[2]。心肌肽素系从乳猪心室肌中提取的小分子多肽类活性物质。本文研究了其对缺血心肌的预防性保护作用。
1 材料
1.1 药物 心肌肽素(cardiomyopeptidin,CMP)溶液，橙色透明，由中国人民解放军第四五八医院提供，多肽含量为10 mg.ml-1。盐酸维拉帕米(verapamil hydrochloride Ver)注射液，江苏连云港制药厂生产，含量为5 mg.ml-1。
, 百拇医药
1.2 试剂 肌酸激酶(creatine kinase,CK)及乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)试剂盒购自北京化工二厂。硫代巴比妥酸(TBA)及1，1，3，3-四乙氧基丙烷(TEP)均为Sigma产品。
1.3 动物Wistar大鼠，购自中国医学科学院实验动物中心，体重为(300±50) g，雌雄兼用。
2 方法
2.1 心肌缺血-再灌注损伤模型[3]及采样 大鼠以戊巴比妥钠麻醉，气管插管，人工呼吸。结扎冠脉左前降支(LAD)10 min，再灌流30 min，从左心室取血2 ml制备血浆供检测。
2.2 分组与给药 正常对照组行假手术，即冠脉LAD处穿一丝线，但不予结扎；给药组于结扎前5 min，分别静注心肌肽素0.5，2，10 mg.kg-1或维拉帕米1 mg.kg-1或生理盐水1 ml.kg-1。
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2.3 检测指标 按试剂盒说明书测定CPK及LDH活性；用硫代巴比妥酸法测丙二醛含量[4]。
2.4 统计处理 实验数据以均数±标准差表示，进行t检验。
3 结果
3.1 静注心肌肽素对缺血-再灌注大鼠血浆CPK活性的影响 结果见表1。缺血-再灌注组与假手术组比较，CPK活性升高非常显著(P<0.01)。3个心肌肽素给药组血浆的CPK活性均比缺血-再灌注组明显降低，有非常显著意义(P<0.01)，且呈剂量依赖性。维拉帕米(1 mg.kg-1)与心肌肽素的作用相似，CPK活性降低也有非常显著意义(P<0.01)，但仍明显高于假手术组。而中、高剂量心肌肽素组CPK值与假手术组接近。生理盐水组与缺血-再灌注组比较，CPK值变化无显著意义(P>0.05)。
, 百拇医药 表1 静注心肌肽素时缺血-再灌注大鼠血浆CPK活性的影响
组别
剂量/
mg.kg-1
动物/只
血浆CPK/
U.100mg-1
假手术
10
164±64
缺血-再灌注
, http://www.100md.com
10
374±541)
缺血-再灌注+生理盐水
8
337±482)
缺血-再灌注+心肌肽素
0.5
8
210±503)
2.0
8
157±313)
, http://www.100md.com
10.0
8
134±243)
缺血-再灌注+维拉帕米
1.0
8
192±603)
注：①
±s ②与假手术组比较 1)P<0.01 与缺血-再灌注组比较 2)P>0.05 3)P<0.01(下同)
, 百拇医药
3.2 静注心肌肽素对缺血-再灌注大鼠血浆LDH活性的影响 结果见表2。缺血-再灌注组与假手术组比较，LDH活性升高非常显著(P<0.01)。心肌肽素组血浆的LDH活性均比缺血-再灌注组明显降低，差异非常显著(P<0.01)，且呈明显的量效关系。心肌肽素中、高剂量组(2，10 mg.kg-1)与维拉帕米1 mg.kg-1的作用相似。生理盐水组与缺血-再灌注组比较无显著差异(P>0.05)。
表2 静注心肌肽素对缺血-再灌注大鼠血浆LDH活性的影响
组别
剂量/
mg.kg-1
动物/只
, http://www.100md.com
血浆/
U.ml-1
假手术
10
40.9±9.5
缺血-再灌注
10
120.0±291)
缺血-再灌注+生理盐水
8
96.2±122)
, 百拇医药 缺血-再灌注+心肌肽素
0.5
8
93.9±173)
2.0
8
59.7±123)
10.0
8
52.6±133)
缺血-再灌注+维拉帕米
1.0
, 百拇医药
8
46.7±8.83)
3.3 静注心肌肽素对缺血-再灌注大鼠血浆MDA的影响 结果见表3。缺血-再灌注组MDA血浆含量非常显著高于假手术组(P<0.01)。心肌肽素组血浆MDA含量均比缺血-再灌注组降低非常显著(P<0.01)，且具有明显的量效关系。心肌肽素中、高剂量组与维拉帕米1 mg.kg-1组的作用相似。生理盐水组与缺血-再灌注组比较无显著意义(P>0.05)。 表3 静注心肌肽素对缺血-再灌注大鼠血浆MDA含量的影响
组别
剂量/
mg.kg-1
动物/只
, 百拇医药
血浆CPK/
nmol.100mg-1
假手术
10
22.3±1.8
缺血-再灌注
10
63.6±111)
缺血-再灌注+生理盐水
8
58.4±112)
, 百拇医药
缺血-再灌注+心肌肽素
0.5
8
38.1±6.23)
2.0
8
27.7±5.53)
10.0
8
25.5±5.53)
缺血-再灌注+维拉帕米
1.0
, 百拇医药
8
24.9±6.63)
4 讨论
心肌缺血-再灌注损伤可导致血浆的CPK，LDH活性和脂质过氧化终产物MDA明显升高[5]。本试验以CPK，LDH活性及MDA变化来反映缺血心肌细胞受损情况，探讨它们与受损细胞的关系及药物的预防作用。结果发现，缺血-再灌注损伤组的上述指标均比假手术组明显升高；心肌酶活性发生显著改变。
心肌肽素对大鼠缺血心肌细胞有明显的保护作用。缺血-再灌注损伤使膜功能受损，心肌出现变性、坏死、细胞内CPK外逸。心肌肽素可剂量依赖性地显著降低血浆CPK活性，提示其可减轻心肌损伤。心肌缺血后，细胞内无氧代谢加强，诱导产生LDH增加[5]，加之细胞膜通透性增大，导致血浆中LDH明显升高。心肌肽素能剂量依赖性地降低血浆LDH活性，改善缺血-再灌注心肌能量代谢。心肌缺血-再灌注时，细胞脂质过氧化反应增强，加之细胞膜透性增大，导致血浆MDA含量增高。心肌肽素能降低血浆MDA含量，减轻心肌脂质过氧化反应。心肌肽素的以上作用均有明显的量效关系。维拉帕米预防性给药对缺血-再灌注心肌细胞也有明显保护作用。
, http://www.100md.com
上述结果提示，心肌肽素对大鼠缺血-再灌注细胞有明显的保护作用，这可能与提高心肌清除氧自由基的能力，减轻受损心肌的变性、坏死反应有关，至于其对正常心肌或缺血心肌病理等的影响，将另文报道。
基金项目：“九五”国家重点科技攻关项目(96，902-01-04)
参考文献：
[1]邓明鲁，常兆生.中国东北长白山区域动物药资源开发研究进展.长春中医学院学报，1995，11(1)：50.
[2]傅建明，陈 玲.注射用促肝素.中国新药杂志，1995，6(1)：40.
[3]Shekher A,Singh Ⅱ.Role of Eicosanoid Inhibition of Ischemia Repertfusion Injury:Intact and Isolated Rat Heart Studies.Methods Find Exp Clin Pharmacol,1997,19(4):223.
[4]向 荣,王鼎年.过氧化脂质硫代巴比妥酸分光光度法的改进.生物化学与生物物理进展，1990，17(3)：24.
[5]Ma X L,Lopez B L,Liu G L,et al.Peroxynitrite Aggravates Myocardial Reperfusion Injury in the Isolated Perfused rat Heart.Cardiovasc Res,1997,36(2):195.
收稿日期：1999-05-14, http://www.100md.com
单位：杨联萍(中国人民解放军第458医院 传染病中心分子生物学科，广东 广州510602)；万华印(中国人民解放军第458医院 传染病中心分子生物学科，广东 广州510602)；孔祥平(中国人民解放军第458医院 传染病中心分子生物学科，广东 广州510602)；吴艳(中国医学科学院 中国协和医科大学 药物研究所，北京 100050)；腾健(中国医学科学院 中国协和医科大学 药物研究所，北京 100050)；范礼理(中国医学科学院 中国协和医科大学 药物研究所，北京 100050)
关键词：多肽；心肌肽素；再灌注损伤；心肌酶
摘 要摘 要：目的：研究小分子多肽类物质心肌肽素对大鼠心脏缺血-再灌注损伤的预防作用。方法：在大鼠冠脉结扎致心肌缺血-再灌注损伤模型上，观察心肌肽素预防性给药对缺血大鼠血浆中肌酸磷酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)活性及脂质过氧化物终产物(MDA)含量的影响。结果：心肌肽素预防性给药能明显降低血浆CPK，LDH的活性与MDA含量，其作用具有明显的量效关系。结论：心肌肽素对心脏缺血-再灌注损伤有预防作用，这可能与其减少心肌酶的释放及抗心肌脂质过氧化有关。
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Preventive Effect of Cardiomyopeptidin on
Rat Heart Injured by Ischemia-Reperfusion
YANG Lian-ping WAN Hua-yin KONG Xiang-ping
(1.Department of Molecular Biology,Infectious Diseases Center,458th Hospital of PLA,Guangdong Guangzhou 510602,China)
WU Yan TENG Jian FAN Li-li
(Institute of Materia Medica,Chinese Academy of
, 百拇医药
Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050,China)
Abstract：Objective:To investigate the preventive effect of cardiomyopeptidin of small molecular weight polypeptide on rat hearts injured by ischemia-reperfusion.Methods:In a rat model injured by ischemia-reperfusion in the heart,observation was made on the influence of cardiomyopeptidin on the activities of creatine kinase(CK)and lactate dehydrogenase(LDH),as well as on the content of MDA in plasma after the preventive drug was used.Results:Cardiomyopeptidin could obviously prevent the injury caused by ischemia-reperfusion,reduce the activities of CK and LDH and the content of MDA in a dose-dependentmanner.Conclusion:Cardiomyopeptidinhas a preventive effect on myocardium injured by ischemia-reperfusion and this may be related to its reducing the release of myocardial enzyme and anti-lipoperoxidation.
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Key words：polypeptide;cardiomyopeptidin;rat heart injured by ischemia-reperfusion;myocardial enzyme.▲
动物脏器是中药的重要组成部分[1]。利用生化技术提取脏器中有效成分应用于临床已有报道[2]。心肌肽素系从乳猪心室肌中提取的小分子多肽类活性物质。本文研究了其对缺血心肌的预防性保护作用。
1 材料
1.1 药物 心肌肽素(cardiomyopeptidin,CMP)溶液，橙色透明，由中国人民解放军第四五八医院提供，多肽含量为10 mg.ml-1。盐酸维拉帕米(verapamil hydrochloride Ver)注射液，江苏连云港制药厂生产，含量为5 mg.ml-1。
, 百拇医药
1.2 试剂 肌酸激酶(creatine kinase,CK)及乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)试剂盒购自北京化工二厂。硫代巴比妥酸(TBA)及1，1，3，3-四乙氧基丙烷(TEP)均为Sigma产品。
1.3 动物Wistar大鼠，购自中国医学科学院实验动物中心，体重为(300±50) g，雌雄兼用。
2 方法
2.1 心肌缺血-再灌注损伤模型[3]及采样 大鼠以戊巴比妥钠麻醉，气管插管，人工呼吸。结扎冠脉左前降支(LAD)10 min，再灌流30 min，从左心室取血2 ml制备血浆供检测。
2.2 分组与给药 正常对照组行假手术，即冠脉LAD处穿一丝线，但不予结扎；给药组于结扎前5 min，分别静注心肌肽素0.5，2，10 mg.kg-1或维拉帕米1 mg.kg-1或生理盐水1 ml.kg-1。
, http://www.100md.com
2.3 检测指标 按试剂盒说明书测定CPK及LDH活性；用硫代巴比妥酸法测丙二醛含量[4]。
2.4 统计处理 实验数据以均数±标准差表示，进行t检验。
3 结果
3.1 静注心肌肽素对缺血-再灌注大鼠血浆CPK活性的影响 结果见表1。缺血-再灌注组与假手术组比较，CPK活性升高非常显著(P<0.01)。3个心肌肽素给药组血浆的CPK活性均比缺血-再灌注组明显降低，有非常显著意义(P<0.01)，且呈剂量依赖性。维拉帕米(1 mg.kg-1)与心肌肽素的作用相似，CPK活性降低也有非常显著意义(P<0.01)，但仍明显高于假手术组。而中、高剂量心肌肽素组CPK值与假手术组接近。生理盐水组与缺血-再灌注组比较，CPK值变化无显著意义(P>0.05)。
, 百拇医药 表1 静注心肌肽素时缺血-再灌注大鼠血浆CPK活性的影响
组别
剂量/
mg.kg-1
动物/只
血浆CPK/
U.100mg-1
假手术
10
164±64
缺血-再灌注
, http://www.100md.com
10
374±541)
缺血-再灌注+生理盐水
8
337±482)
缺血-再灌注+心肌肽素
0.5
8
210±503)
2.0
8
157±313)
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10.0
8
134±243)
缺血-再灌注+维拉帕米
1.0
8
192±603)
注：①
±s ②与假手术组比较 1)P<0.01 与缺血-再灌注组比较 2)P>0.05 3)P<0.01(下同), 百拇医药
3.2 静注心肌肽素对缺血-再灌注大鼠血浆LDH活性的影响 结果见表2。缺血-再灌注组与假手术组比较，LDH活性升高非常显著(P<0.01)。心肌肽素组血浆的LDH活性均比缺血-再灌注组明显降低，差异非常显著(P<0.01)，且呈明显的量效关系。心肌肽素中、高剂量组(2，10 mg.kg-1)与维拉帕米1 mg.kg-1的作用相似。生理盐水组与缺血-再灌注组比较无显著差异(P>0.05)。
表2 静注心肌肽素对缺血-再灌注大鼠血浆LDH活性的影响
组别
剂量/
mg.kg-1
动物/只
, http://www.100md.com
血浆/
U.ml-1
假手术
10
40.9±9.5
缺血-再灌注
10
120.0±291)
缺血-再灌注+生理盐水
8
96.2±122)
, 百拇医药 缺血-再灌注+心肌肽素
0.5
8
93.9±173)
2.0
8
59.7±123)
10.0
8
52.6±133)
缺血-再灌注+维拉帕米
1.0
, 百拇医药
8
46.7±8.83)
3.3 静注心肌肽素对缺血-再灌注大鼠血浆MDA的影响 结果见表3。缺血-再灌注组MDA血浆含量非常显著高于假手术组(P<0.01)。心肌肽素组血浆MDA含量均比缺血-再灌注组降低非常显著(P<0.01)，且具有明显的量效关系。心肌肽素中、高剂量组与维拉帕米1 mg.kg-1组的作用相似。生理盐水组与缺血-再灌注组比较无显著意义(P>0.05)。 表3 静注心肌肽素对缺血-再灌注大鼠血浆MDA含量的影响
组别
剂量/
mg.kg-1
动物/只
, 百拇医药
血浆CPK/
nmol.100mg-1
假手术
10
22.3±1.8
缺血-再灌注
10
63.6±111)
缺血-再灌注+生理盐水
8
58.4±112)
, 百拇医药
缺血-再灌注+心肌肽素
0.5
8
38.1±6.23)
2.0
8
27.7±5.53)
10.0
8
25.5±5.53)
缺血-再灌注+维拉帕米
1.0
, 百拇医药
8
24.9±6.63)
4 讨论
心肌缺血-再灌注损伤可导致血浆的CPK，LDH活性和脂质过氧化终产物MDA明显升高[5]。本试验以CPK，LDH活性及MDA变化来反映缺血心肌细胞受损情况，探讨它们与受损细胞的关系及药物的预防作用。结果发现，缺血-再灌注损伤组的上述指标均比假手术组明显升高；心肌酶活性发生显著改变。
心肌肽素对大鼠缺血心肌细胞有明显的保护作用。缺血-再灌注损伤使膜功能受损，心肌出现变性、坏死、细胞内CPK外逸。心肌肽素可剂量依赖性地显著降低血浆CPK活性，提示其可减轻心肌损伤。心肌缺血后，细胞内无氧代谢加强，诱导产生LDH增加[5]，加之细胞膜通透性增大，导致血浆中LDH明显升高。心肌肽素能剂量依赖性地降低血浆LDH活性，改善缺血-再灌注心肌能量代谢。心肌缺血-再灌注时，细胞脂质过氧化反应增强，加之细胞膜透性增大，导致血浆MDA含量增高。心肌肽素能降低血浆MDA含量，减轻心肌脂质过氧化反应。心肌肽素的以上作用均有明显的量效关系。维拉帕米预防性给药对缺血-再灌注心肌细胞也有明显保护作用。
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上述结果提示，心肌肽素对大鼠缺血-再灌注细胞有明显的保护作用，这可能与提高心肌清除氧自由基的能力，减轻受损心肌的变性、坏死反应有关，至于其对正常心肌或缺血心肌病理等的影响，将另文报道。
基金项目：“九五”国家重点科技攻关项目(96，902-01-04)
参考文献：
[1]邓明鲁，常兆生.中国东北长白山区域动物药资源开发研究进展.长春中医学院学报，1995，11(1)：50.
[2]傅建明，陈 玲.注射用促肝素.中国新药杂志，1995，6(1)：40.
[3]Shekher A,Singh Ⅱ.Role of Eicosanoid Inhibition of Ischemia Repertfusion Injury:Intact and Isolated Rat Heart Studies.Methods Find Exp Clin Pharmacol,1997,19(4):223.
[4]向 荣,王鼎年.过氧化脂质硫代巴比妥酸分光光度法的改进.生物化学与生物物理进展，1990，17(3)：24.
[5]Ma X L,Lopez B L,Liu G L,et al.Peroxynitrite Aggravates Myocardial Reperfusion Injury in the Isolated Perfused rat Heart.Cardiovasc Res,1997,36(2):195.
收稿日期：1999-05-14, http://www.100md.com