清胰岛素样生长因子结合蛋白与肾病大鼠的生长障碍
作者：刘建华 易著文
单位：刘建华(湖南医科大学附属第二医院儿科 长沙，410011)
关键词：生长障碍；肾病综合征；胰岛素样生长因子结合蛋白
肾脏病与透折肾移植杂志000206 摘 要 目的：探讨营养不良、肾病本身和糖皮质激素作为各自独立因素对大鼠血清胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBPs)浓度的影响，阐明血清IGFBPs代谢紊乱与肾病综合征(NS)大鼠生长障碍的关系。 方法：24只周龄相同体重相近的雄性SD大鼠被随机分成正常、食物对照、阿霉素(5 mg/kg)肾病和地塞米松(1.8 mg/kg.d-1)治疗的阿霉素肾病四组。血清IGFBPs浓度和肝脏IGFBPs mRNA表达分别采用 Western ligand blot和RT-PCR法检测。 结果：①食物对照和肾病组大鼠血清IGFBP-3浓度均减低，且肾病组更明显；激素治疗组较肾病组则增高。食物对照组大鼠血清IGFBP-2浓度也减低，肾病和激素治疗组却显著增高，但后两组间差异不显著。②食物对照组大鼠肝脏IGFBP-2 mRNA表达下降，肾病组升高，激素治疗组较肾病组减低。食物对照组大鼠肝脏IGFBP-3 mRNA表达正常，肾病组减低，激素治疗组较肾病组进一步下降。③血清IGFBP-2浓度与大鼠鼻-尾长度和体重均呈负相关(P均<0.01)。 结论：肾病本身所致的血清IGFBP-2浓度增高是NS大鼠生长障碍发生的重要因素之一。
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SERUM INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR BINDING PROTEIN(IGFBP)AND LIVER IGFBP mRNA IN NEPHROTIC RATS WITH GROWTH FAILURE
LIU Jianhua，YI Zhuwen
(Department of Pediatrics，The Second Affiliated Hospital，Hunan Medical University，Changsha，410011)
OBJECTIVE To investigate the changes of insulin-like growth factor binding proteins(IGFBPs)in nephrotic rats and to exam its relationship with the nephrotic state，nutritional state，and steroid treatment. METHODOLOGY Twenty-four male Sprague-Dawley(SD)rats were randomly divided into control group，pair-fed group，doxorubincin-induced nephrotic group(nephrotic group)and dexamethasone-treated nephrotic group(des-treated group).Serum IGFBPs and liver IGFBPs mRNA were measured by Western blot and RT-PCR respectively. RESULTS Serum IGFBP-2 and IGFBP-3 were found significantly reduced in pair-fed rats(2.05±0.21，P<0.01；16.42±1.44，P<0.01)，nephrotic rats(6.75±0.57，P<0.01；8.13±0.99，P<0.01)and des-treated nephrotic rats (6.44±0.51，P<0.01；21.29±2.05，P<0.01)as compared to the control rats.No significant difference of both IGFBPs was found between the nephrotic and des-treated nephrotic rats.Liver IGFBP-2 mRNA was found decreased in pair-fed rats and increased in nephrotic rats as compared to the control rats.Significant increase of liver IGFBP-2 mRNA was found in nephrotic rats as compared to the des-treated rats.No significant difference of liver IGFBP-3 mRNA was found between the pair-fed rats and the control，while significant decrease of liver IGFBP-3 mRNA was found in nephrotic and des-treated nephrotic rats，with the later of more obviouse decrement.A significant negative correlation was found between the nose-tail length or body weight and serum IGFBP-2. CONCLUSION Increased serum IGFBP-2，induced by nephrosis itself，is one of the causes for growth failure in nephrotic syndrome.
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Key words growth failure nephrotic syndrome insulin-like growth factor binding protein
尽管许多研究已证实，反复发作的肾病综合征(NS)患儿生长障碍与血清胰岛素样生长因子I(IGF-I)浓度减低有关，然而，由于NS时常伴随的继发性营养不良及随后的糖皮质激素治疗，也对血清IGF-I代谢产生影响，因而使得人们难以准确地认清其发生机制。的确，Haffner[1]最近的研究就发现，营养状态良好的NS患儿其血清IGF-I浓度在年龄相关的正常范围之内。这就使人们联想到，NS患儿生长障碍可能还有其它发生机制。胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBPs)作为IGF-I在血清中储存、运输及至靶器官发挥生物效应的载体，除了通过调节IGF-I半衰期影响其在血清中浓度外，可能也通过抑制其生物活性[2]而参与NS生长障碍的发病过程。为验证这一假设，本研究采用动物实验，通过观察营养、肾病和糖皮质激素作为各自独立因素对IGFBPs合成和代谢的影响，以期阐明IGFBPs发生紊乱的机制及其紊乱与生长障碍的关系。
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1 材料和方法
1.1 动物实验及标本采集 24只6周龄、体重在190～240g的雄性SD大鼠(购自中国科学院上海实验动物中心)被随机分成：正常对照(Control，5只)，食物对照组(Pair-fed，5只)，肾病(Nephrotic，6只)和激素治疗的肾病(Des-treated，8只)四组。肾病模型通过实验第一天尾静脉一次注射阿霉素(5 mg/kg，意大利爱宝大药厂)法制备；激素治疗的肾病组，自实验第二周末开始，皮下注射地塞米松(1.8 mg/kg*d-1)至第四周末实验结束；余下各组注射等量生理盐水做对照。
在整个实验过程中，所有大鼠均被饲养在12h白昼、12h黑夜的标准温度(21～22℃)和湿度(50%～70%)环境中，均食用我院动物实验中心自产的全价颗粒饲料和自来水。除食物对照组大鼠喂养肾病组等量饲料而作为继发性营养不良模型观察外(按每只大鼠每天平均摄食量计算，食物构成不变)，余各组自由进食。
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在实验初和实验末，所有大鼠均于乙醚麻醉下测量体重和鼻-尾长度，并将其单个地置入代谢笼中收集24h尿标本，离心后取上清置-20℃冰箱保存。实验第四周末，在乙醚麻醉下，从腹主动脉取血，分离血清置-20℃冰箱保存，并切取0.5g左右肝组织在液氮中速冻后置-70℃冰箱保存。
1.2 检测方法
1.2.1 探针标记 rhIGF-I(Promega)和rhIGFBP-3(湖南医科大学内分泌研究所廖二元教授馈赠)参照文献[3]方法用125I-Na标记，标记产物分别经2×40和1×30cm Sephdex G-50(Pharmacia)层析柱纯化，终产物特殊的比放射活性为150和670 μCi/μg。
1.2.2 血清IGF-I浓度 按试剂盒(DSL-2900)说明采用放射免疫法检测。
1.2.3 血清及尿IGFBP-2，-3浓度：参照文献[4]报道，采用Western ligand blot法检测，并略加修改：5μl血清或尿标本加入30μl 1×SDS上样缓冲液中100℃变性3～5min后，加样于12%聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上90V电压电泳10h，再于240mA电流下转膜8h，硝酸纤维膜经含3%Nonidet P-40(Sigma)、0.1% Tween-20(Sigma)和1%BSA的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)封闭后，与3×106/min125I-IGF-I在4℃下孵育24h，将膜漂洗并干燥，放入带增感屏的暗盒中置-70℃冰箱，分别曝光10天或14天。
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1.2.4 血清及尿IGFBP-3蛋白酶活性 检测方法参照文献[4]报道并稍加修改：5μl血清或3μl尿标本中加入1×106/min125I-IGFBP-3和PBS缓冲液(含2 mmol/L CaCl2)至总体积25 μl，37℃水浴下分别孵育6h和2h后，加20μl 1×SDS上样缓冲液100℃变性3～5min，上样于12%聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)90V电压电泳8h，待凝胶自然干燥后，放入带增感屏的暗盒中至-70℃冰箱，分别曝光4天或7天。
1.2.5 肝组织IGFBP-2，-3 mRNA表达 采用RT-PCR法检测。IGFBP-2，-3、内参照β-actin引物由上海生物工程研究所合成，其寡核甘酸序列分别为：IGFBP-2上游5-TGGAGGAGCCCAAGAAGCT-3下游5-GGTTCACACACCAGCACTC-3扩增产物228bp；IGFBP-3上游5-AGAACTTCTCCTCCGAGTC-3下游5-CTTTGGAAGGGCGACACTG-3扩增产物174bp；β-actin上游5-TGACGTTGACATCCGTAAAG-3下游5-ACAGTGAGGCCAGGATAGAG-3扩增产物194bp。
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(1)RNA提取：100mg左右肝组织按TRIZOL(GIBCO)试剂说明书进行提取，并经紫外分光光度计测定其纯度。
(2)逆转录：按试剂盒说明采用SUPERSCRIPTTM反转录系统(GIBCO)合成cDNA第一链。
(3)PCR扩增：取2μl cDNA模板，依次加入5 μl 10×PCR-Buffer、3μl 25mmol/L MgCl2、1μl 10mmol/L dNTPs、0.5μl 25 μmol/L IGFBP-2或-3和β-actin引物，及2U Taq DNA Polymerase，用去离子水补充至总体积50μl；IGFBP-2，-3扩增条件均为95℃ 2min，95℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 30s、共30个循环，72℃ 5min。
取扩增产物3～5 μl，在10%聚丙烯酰胺凝胶(TBE-PAGE)上电泳，凝胶经硝酸银染色后，进行密度扫描。
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1.3 统计学处理 采用SPSS-7.5统计软件包进行统计学处理，所有资料均采用
±s表示；多组资料间比较，采用One-Way ANOVA分析，组间两两比较采用LSD法；对有相关趋势的变量采用Pearson相关分析。
2 结 果
2.1 四组大鼠实验初及实验末鼻-尾长度、体重、24h尿蛋白定量和实验末血清白蛋白之比较 四组大鼠中，以正常组鼻-尾长度和体重增长最多，食物对照组次之，肾病组再次，激素治疗组最少。肾病和激素治疗组尿蛋白排泄均显著增加(表1)。
2.2 四组大鼠血清IGF-I、血清和尿IGFBP-2，-3浓度之比较 食物对照和肾病组大鼠血清IGF-I明显下降，但两组间差异不显著；激素治疗组则较肾病组进一步减低(表2)。
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Table 1. The nutritional status of the rats before and after experiment(±s) Groups
n
Nose-tail length(cm)
Body Weight(g)
24-hour UPE(mg/L)
Serum Albumin(g/L)
PRE-EX
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POST-EX
PRE-EX
POST-EX
PRE-EX
POST-EX
POST-EX
Control
5
39.66±0.34
42.16±0.41
216.8±4.4
308.6±8.5
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14.0±1.8
44.6±7.0
39.3±1.0
Pair-fed
5
39.36±0.61
41.16±0.41
217.3±5.9
257.5±4.1△
12.6±2.1
36.0±4.8
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33.2±1.7△
Nephrotic
6
39.03±0.16
40.00±0.26△☆
216.1±4.5
222.3±9.9△▲
12.3±0.9
235.9±15.5△▲
26.5±0.8△▲
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Des treated
8
39.28±0.13
39.78±0.20△▲
216.6±3.7
132.2±6.4△▲★
13.0±1.2
215.5±12.0△▲
27.8±1.0△▲
P<0.05 △P<0.01 vs control， ☆P<0.05 ▲P<0.01 vs pair-fed， ★P<0.01 vs nephrotic
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食物对照和肾病组大鼠血清IGFBP-3浓度均减低，且肾病组更明显；激素治疗组较肾病组则增高。食物对照组大鼠血清IGFBP-2浓度也减低，肾病和激素治疗组却显著增高，但后两组间差异不显著(表2)。
IGFBP-3仅在肾病组大鼠尿中被检测到；IGFBP-2则见于肾病和激素治疗组，但两组间差异不显著(5.31±0.61 vs 5.41±0.43，×104 ADU，P>0.05)。
Table 2. Comparison of serum IGF-I，IGFBP-2，IGFBP-3
(±s) Groups
n
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IGF-1(μg/L)
IGFBP-2＃
IGFBP-3＃
Pair-fred group
5
2023.01±142.56△
2.05±0.21△
16.42±1.44△
Nephrotic group
6
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2045.00±118.06△
6.75±0.57△▲
8.13±0.99△☆
Des-treated group
8
857.13±76.72△▲★
6.44±0.51△▲
21.29±2.05★
Control group
5
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2495.53±68.42
4.14±0.36
29.00±3.51
＃×104ADU。 P<0.05 △P<0.01 vs control，☆P<0.05 ▲P<0.01 vs pair-fed， ★P<0.01 vs nephrotic
2.3 四组大鼠血清和尿IGFBP-3蛋白酶活性之比较 肾病和激素治疗组大鼠血清IGFBP-3蛋白酶活性正常，食物对照组增高；尿中IGFBP-3蛋白酶活性，食物对照组正常，肾病组升高，激素治疗组较肾病组下降。
2.4 四组大鼠肝脏IGFBP-2，-3 mRNA表达之比较 食物对照组大鼠肝脏IGFBP-2 mRNA表达下降，肾病组升高，激素治疗组较肾病组减低。食物对照组大鼠肝脏IGFBP-3 mRNA表达正常，肾病组减低，激素治疗组较肾病组进一步下降(表3和附图)。
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Fig.1. RT-PCR of Liver IGFBP2，-3 in the four group
of rats
Lane 1～4：control，pair-fed，nephrotic and des-treated groups ，Marker Lane：PUC19DNA/MspI.
Table 3. Comparison of liver IGFBP-2 mRNA，IGFBP-3
mRNA expression(±s，ADU) Groups
n
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IGFBP-2
IGFBP-3
Pair-fed
5
0.254±0.034△
0.362±0.016
Nephrotic
5
0.586±0.029△▲
0.298±0.029
Des-treated
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5
0.386±0.028▲★
0.230±0.021△▲☆
Control
5
0.410±0.028
0.348±0.016
△P<0.01 vs control， P<0.05 ▲P<0.01 vs pair-fed，P<0.05 ★P<0.01 vs nephrotic3 讨 论
3.1 营养、肾病和糖皮质激素对肝脏IGFBP-2，-3 mRNA表达和血清IGFBP-2，3浓度的影响 既往的研究证实，在限制蛋白饮食或营养不良的大鼠，血清IGFBP-3减低[5]，IGFBP-2增高[6]；并与肝脏IGFBP-3 mRNA表达下降[5]，IGFBP-2 mRNA增高[6]相一致；提示营养可通过影响肝脏IGFBP-2，3基因转录水平调节其血清浓度。与上述报道不同，在我们的研究中，食物对照组大鼠血清IGFBP-2，3浓度均减低，相对应，只有肝脏IGFBP-2 mRNA表达下降，IGFBP-3 mRNA正常，说明营养不良时仅有血清IGFBP-2减低来源于肝脏合成减少。
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我们发现，与NS患儿血清IGFBP-3减低、IGFBP-2增高相似[1，7]；肾病组大鼠血清IGFBP-3较食物对照组进一步减低的同时，血清IGFBP-2却明显升高，并与其肝脏IGFBP-2 mRNA表达增高，IGFBP-3 mRNA下降相一致，提示肾病时肝脏IGFBP-2/IGFBP-3合成增多/减少可能是其血清浓度发生改变的原因之一。肾病本身可导致血清IGFBP-2/IGFBP-3增高/减低也见于Thabet[8]和Hirschberg[4]等的报道，不同的是，后者在研究肝脏基因表达时仅证实IGFBP-2 mRNA增高，而IGFBP-3 mRNA正常。
激素对IGFBPs的影响研究不多，Miell等[9]报道激素治疗可导致健康成人血清IGFBP-2下降，IGFBP-3升高，这与激素治疗的胎鼠肝脏IGFBP-2 mRNA表达增多、IGFBP-3 mRNA减少[10]不相符。我们也观察到激素治疗组大鼠血清IGFBP-3浓度显著回升；尽管差异不显著，血清IGFBP-2亦轻度下降；这与经激素治疗后完全缓解的肾病患儿，其血清IGFBP-2，-3浓度完全恢复正常相一致[7]。由于肾病组大鼠肝脏IGFBP-2，-3 mRNA表达亦同时减少，提示除血清IGFBP-2减低来源于肝脏合成下降外，血清IGFBP-3浓度增高与肝脏合成无关。
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3.2 尿中IGFBP-2，-3排泄对血清IGFBP-2，-3浓度的影响 我们的研究证实，肾病组大鼠尿中IGFBP-2，-3排泄显著增高，与在肾病儿童[1]尿中观察到的相类似。不过，伴随着肾小球通透性减低，激素治疗组尿中IGFBP-2排泄虽无减少，但IGFBP-3却明显下降；这可能与IGFBP-2主要以分子量50 000的复合物形式存在，分子量较小而易于从肾小球滤过有关。通过相关分析我们进一步发现，血清IGFBP-3与血清白蛋白呈正相关(r＝0.658，P<0.01)、与尿蛋白呈负相关(r＝-0.475，P<0.05)，血清IGFBP-2与尿蛋白呈正相关(r＝0.732，P<0.01)，提示肾病时血清IGFBP-3减低可能部分源于尿中丢失增多，而血清IGFBP-2浓度增高则与其尿中排泄增多引起的肝脏代偿合成过度增加有关。Hirschberg等[4]确曾发现增高的尿中IGFBP-2排泄与更高的肝脏IGFBP-2合成同时存在于肾病大鼠，但为何都从尿中丢失，肝脏IGFBP-3合成却未代偿增加，其机制有待进一步探讨。
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3.3 IGFBP-3蛋白降解酶活性对血清IGFBP-3浓度的影响 血清IGFBP-3减低可能也与其降解加速有关。在许多生理和病理状态下，如妊娠、生长障碍和慢性肾功能不全时，这种蛋白酶的活性显著增高。尽管有报道夜间短期禁食对人血清IGFBP-3蛋白酶活性无影响[11]，但我们发现食物对照组大鼠血清IGFBP-3蛋白酶的活性仍明显增高，说明营养不良所致的血清IGFBP-3减低主要源于其在血清中降解加速。Pucilowsky等[12]也曾报道，营养不良儿童增高的血清IGFBP-3蛋白酶活性在重新进食后下降，支持我们的结论。与肾病儿童相同[1]，在肾病组大鼠，血清IGFBP-3蛋白酶活性正常；但尿中IGFBP-3蛋白酶活性却显著增高，Hirschberg等[4]也曾报道，肾病组大鼠尿中IGFBP-3蛋白酶活性增高且血清中含有IGFBP-3降解片段，提示肾病时IGFBP-3蛋白酶降解活性增强也是其血清浓度下降的重要因素。由于肾病时血清IGFBP-3蛋白酶活性正常而尿中增高，提示这种蛋白酶产生于肾脏并由肾小管分泌入尿中。Davenport等[13]曾发现孕鼠子宫组织内IGFBP-3蛋白酶活性显著增高，进一步证实了IGFBP-3的这种组织特殊降解作用。由此我们推测当血液流经肾脏时，血浆中的IGFBP-3才被降解而导致血清IGFBP-3浓度下降。激素治疗组尿中蛋白酶活降低，提示激素治疗引起的血清IGFBP-3浓度增高部分归因于IGFBP-3在肾脏的降解减弱。
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3.4 血清IGFBPs紊乱与生长障碍的关系 与营养状态良好的NS患儿血清IGF-I浓度正常[1]相似，我们的研究也证实了NS大鼠血清IGF-I浓度减低归因于继发性营养不良或随后的糖皮质激素治疗，肾病本身对血清IGF-I无影响；相反，NS大鼠血清IGFBP-2浓度增高仅基于肾病本身，而与继发性营养不良或随后的糖皮质激素治疗无关。通过相关分析进一步发现，大鼠鼻-尾长度和体重均与血清IGF-I呈正相关(r＝0.677，0.911，P均<0.01)，与血清IGFBP-2呈负相关(r＝-0.600，-0.523，P均<0.01)，提示除继发性营养不良和糖皮质激素治疗所致的生长障碍与血清IGF-I减低有关外，肾病本身所致的生长障碍与血清IGFBP-2增高有关。
湖南省自然科学基金资助课题[基金号 湘科计字(97)37号-17]，CMB基金部分资助；
易著文(课题负责人)
, 百拇医药 参考文献
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(1999-11-01收稿，2000-03-01修回), 百拇医药
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关键词：生长障碍；肾病综合征；胰岛素样生长因子结合蛋白
肾脏病与透折肾移植杂志000206 摘 要 目的：探讨营养不良、肾病本身和糖皮质激素作为各自独立因素对大鼠血清胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBPs)浓度的影响，阐明血清IGFBPs代谢紊乱与肾病综合征(NS)大鼠生长障碍的关系。 方法：24只周龄相同体重相近的雄性SD大鼠被随机分成正常、食物对照、阿霉素(5 mg/kg)肾病和地塞米松(1.8 mg/kg.d-1)治疗的阿霉素肾病四组。血清IGFBPs浓度和肝脏IGFBPs mRNA表达分别采用 Western ligand blot和RT-PCR法检测。 结果：①食物对照和肾病组大鼠血清IGFBP-3浓度均减低，且肾病组更明显；激素治疗组较肾病组则增高。食物对照组大鼠血清IGFBP-2浓度也减低，肾病和激素治疗组却显著增高，但后两组间差异不显著。②食物对照组大鼠肝脏IGFBP-2 mRNA表达下降，肾病组升高，激素治疗组较肾病组减低。食物对照组大鼠肝脏IGFBP-3 mRNA表达正常，肾病组减低，激素治疗组较肾病组进一步下降。③血清IGFBP-2浓度与大鼠鼻-尾长度和体重均呈负相关(P均<0.01)。 结论：肾病本身所致的血清IGFBP-2浓度增高是NS大鼠生长障碍发生的重要因素之一。
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SERUM INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR BINDING PROTEIN(IGFBP)AND LIVER IGFBP mRNA IN NEPHROTIC RATS WITH GROWTH FAILURE
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OBJECTIVE To investigate the changes of insulin-like growth factor binding proteins(IGFBPs)in nephrotic rats and to exam its relationship with the nephrotic state，nutritional state，and steroid treatment. METHODOLOGY Twenty-four male Sprague-Dawley(SD)rats were randomly divided into control group，pair-fed group，doxorubincin-induced nephrotic group(nephrotic group)and dexamethasone-treated nephrotic group(des-treated group).Serum IGFBPs and liver IGFBPs mRNA were measured by Western blot and RT-PCR respectively. RESULTS Serum IGFBP-2 and IGFBP-3 were found significantly reduced in pair-fed rats(2.05±0.21，P<0.01；16.42±1.44，P<0.01)，nephrotic rats(6.75±0.57，P<0.01；8.13±0.99，P<0.01)and des-treated nephrotic rats (6.44±0.51，P<0.01；21.29±2.05，P<0.01)as compared to the control rats.No significant difference of both IGFBPs was found between the nephrotic and des-treated nephrotic rats.Liver IGFBP-2 mRNA was found decreased in pair-fed rats and increased in nephrotic rats as compared to the control rats.Significant increase of liver IGFBP-2 mRNA was found in nephrotic rats as compared to the des-treated rats.No significant difference of liver IGFBP-3 mRNA was found between the pair-fed rats and the control，while significant decrease of liver IGFBP-3 mRNA was found in nephrotic and des-treated nephrotic rats，with the later of more obviouse decrement.A significant negative correlation was found between the nose-tail length or body weight and serum IGFBP-2. CONCLUSION Increased serum IGFBP-2，induced by nephrosis itself，is one of the causes for growth failure in nephrotic syndrome.
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Key words growth failure nephrotic syndrome insulin-like growth factor binding protein
尽管许多研究已证实，反复发作的肾病综合征(NS)患儿生长障碍与血清胰岛素样生长因子I(IGF-I)浓度减低有关，然而，由于NS时常伴随的继发性营养不良及随后的糖皮质激素治疗，也对血清IGF-I代谢产生影响，因而使得人们难以准确地认清其发生机制。的确，Haffner[1]最近的研究就发现，营养状态良好的NS患儿其血清IGF-I浓度在年龄相关的正常范围之内。这就使人们联想到，NS患儿生长障碍可能还有其它发生机制。胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBPs)作为IGF-I在血清中储存、运输及至靶器官发挥生物效应的载体，除了通过调节IGF-I半衰期影响其在血清中浓度外，可能也通过抑制其生物活性[2]而参与NS生长障碍的发病过程。为验证这一假设，本研究采用动物实验，通过观察营养、肾病和糖皮质激素作为各自独立因素对IGFBPs合成和代谢的影响，以期阐明IGFBPs发生紊乱的机制及其紊乱与生长障碍的关系。
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1 材料和方法
1.1 动物实验及标本采集 24只6周龄、体重在190～240g的雄性SD大鼠(购自中国科学院上海实验动物中心)被随机分成：正常对照(Control，5只)，食物对照组(Pair-fed，5只)，肾病(Nephrotic，6只)和激素治疗的肾病(Des-treated，8只)四组。肾病模型通过实验第一天尾静脉一次注射阿霉素(5 mg/kg，意大利爱宝大药厂)法制备；激素治疗的肾病组，自实验第二周末开始，皮下注射地塞米松(1.8 mg/kg*d-1)至第四周末实验结束；余下各组注射等量生理盐水做对照。
在整个实验过程中，所有大鼠均被饲养在12h白昼、12h黑夜的标准温度(21～22℃)和湿度(50%～70%)环境中，均食用我院动物实验中心自产的全价颗粒饲料和自来水。除食物对照组大鼠喂养肾病组等量饲料而作为继发性营养不良模型观察外(按每只大鼠每天平均摄食量计算，食物构成不变)，余各组自由进食。
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在实验初和实验末，所有大鼠均于乙醚麻醉下测量体重和鼻-尾长度，并将其单个地置入代谢笼中收集24h尿标本，离心后取上清置-20℃冰箱保存。实验第四周末，在乙醚麻醉下，从腹主动脉取血，分离血清置-20℃冰箱保存，并切取0.5g左右肝组织在液氮中速冻后置-70℃冰箱保存。
1.2 检测方法
1.2.1 探针标记 rhIGF-I(Promega)和rhIGFBP-3(湖南医科大学内分泌研究所廖二元教授馈赠)参照文献[3]方法用125I-Na标记，标记产物分别经2×40和1×30cm Sephdex G-50(Pharmacia)层析柱纯化，终产物特殊的比放射活性为150和670 μCi/μg。
1.2.2 血清IGF-I浓度 按试剂盒(DSL-2900)说明采用放射免疫法检测。
1.2.3 血清及尿IGFBP-2，-3浓度：参照文献[4]报道，采用Western ligand blot法检测，并略加修改：5μl血清或尿标本加入30μl 1×SDS上样缓冲液中100℃变性3～5min后，加样于12%聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上90V电压电泳10h，再于240mA电流下转膜8h，硝酸纤维膜经含3%Nonidet P-40(Sigma)、0.1% Tween-20(Sigma)和1%BSA的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)封闭后，与3×106/min125I-IGF-I在4℃下孵育24h，将膜漂洗并干燥，放入带增感屏的暗盒中置-70℃冰箱，分别曝光10天或14天。
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1.2.4 血清及尿IGFBP-3蛋白酶活性 检测方法参照文献[4]报道并稍加修改：5μl血清或3μl尿标本中加入1×106/min125I-IGFBP-3和PBS缓冲液(含2 mmol/L CaCl2)至总体积25 μl，37℃水浴下分别孵育6h和2h后，加20μl 1×SDS上样缓冲液100℃变性3～5min，上样于12%聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)90V电压电泳8h，待凝胶自然干燥后，放入带增感屏的暗盒中至-70℃冰箱，分别曝光4天或7天。
1.2.5 肝组织IGFBP-2，-3 mRNA表达 采用RT-PCR法检测。IGFBP-2，-3、内参照β-actin引物由上海生物工程研究所合成，其寡核甘酸序列分别为：IGFBP-2上游5-TGGAGGAGCCCAAGAAGCT-3下游5-GGTTCACACACCAGCACTC-3扩增产物228bp；IGFBP-3上游5-AGAACTTCTCCTCCGAGTC-3下游5-CTTTGGAAGGGCGACACTG-3扩增产物174bp；β-actin上游5-TGACGTTGACATCCGTAAAG-3下游5-ACAGTGAGGCCAGGATAGAG-3扩增产物194bp。
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(1)RNA提取：100mg左右肝组织按TRIZOL(GIBCO)试剂说明书进行提取，并经紫外分光光度计测定其纯度。
(2)逆转录：按试剂盒说明采用SUPERSCRIPTTM反转录系统(GIBCO)合成cDNA第一链。
(3)PCR扩增：取2μl cDNA模板，依次加入5 μl 10×PCR-Buffer、3μl 25mmol/L MgCl2、1μl 10mmol/L dNTPs、0.5μl 25 μmol/L IGFBP-2或-3和β-actin引物，及2U Taq DNA Polymerase，用去离子水补充至总体积50μl；IGFBP-2，-3扩增条件均为95℃ 2min，95℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 30s、共30个循环，72℃ 5min。
取扩增产物3～5 μl，在10%聚丙烯酰胺凝胶(TBE-PAGE)上电泳，凝胶经硝酸银染色后，进行密度扫描。
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1.3 统计学处理 采用SPSS-7.5统计软件包进行统计学处理，所有资料均采用
±s表示；多组资料间比较，采用One-Way ANOVA分析，组间两两比较采用LSD法；对有相关趋势的变量采用Pearson相关分析。2 结 果
2.1 四组大鼠实验初及实验末鼻-尾长度、体重、24h尿蛋白定量和实验末血清白蛋白之比较 四组大鼠中，以正常组鼻-尾长度和体重增长最多，食物对照组次之，肾病组再次，激素治疗组最少。肾病和激素治疗组尿蛋白排泄均显著增加(表1)。
2.2 四组大鼠血清IGF-I、血清和尿IGFBP-2，-3浓度之比较 食物对照和肾病组大鼠血清IGF-I明显下降，但两组间差异不显著；激素治疗组则较肾病组进一步减低(表2)。
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Table 1. The nutritional status of the rats before and after experiment(
±s) Groupsn
Nose-tail length(cm)
Body Weight(g)
24-hour UPE(mg/L)
Serum Albumin(g/L)
PRE-EX
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POST-EX
PRE-EX
POST-EX
PRE-EX
POST-EX
POST-EX
Control
5
39.66±0.34
42.16±0.41
216.8±4.4
308.6±8.5
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14.0±1.8
44.6±7.0
39.3±1.0
Pair-fed
5
39.36±0.61
41.16±0.41
217.3±5.9
257.5±4.1△
12.6±2.1
36.0±4.8
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33.2±1.7△
Nephrotic
6
39.03±0.16
40.00±0.26△☆
216.1±4.5
222.3±9.9△▲
12.3±0.9
235.9±15.5△▲
26.5±0.8△▲
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Des treated
8
39.28±0.13
39.78±0.20△▲
216.6±3.7
132.2±6.4△▲★
13.0±1.2
215.5±12.0△▲
27.8±1.0△▲
P<0.05 △P<0.01 vs control， ☆P<0.05 ▲P<0.01 vs pair-fed， ★P<0.01 vs nephrotic
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食物对照和肾病组大鼠血清IGFBP-3浓度均减低，且肾病组更明显；激素治疗组较肾病组则增高。食物对照组大鼠血清IGFBP-2浓度也减低，肾病和激素治疗组却显著增高，但后两组间差异不显著(表2)。
IGFBP-3仅在肾病组大鼠尿中被检测到；IGFBP-2则见于肾病和激素治疗组，但两组间差异不显著(5.31±0.61 vs 5.41±0.43，×104 ADU，P>0.05)。
Table 2. Comparison of serum IGF-I，IGFBP-2，IGFBP-3
(
±s) Groupsn
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IGF-1(μg/L)
IGFBP-2＃
IGFBP-3＃
Pair-fred group
5
2023.01±142.56△
2.05±0.21△
16.42±1.44△
Nephrotic group
6
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2045.00±118.06△
6.75±0.57△▲
8.13±0.99△☆
Des-treated group
8
857.13±76.72△▲★
6.44±0.51△▲
21.29±2.05★
Control group
5
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2495.53±68.42
4.14±0.36
29.00±3.51
＃×104ADU。 P<0.05 △P<0.01 vs control，☆P<0.05 ▲P<0.01 vs pair-fed， ★P<0.01 vs nephrotic
2.3 四组大鼠血清和尿IGFBP-3蛋白酶活性之比较 肾病和激素治疗组大鼠血清IGFBP-3蛋白酶活性正常，食物对照组增高；尿中IGFBP-3蛋白酶活性，食物对照组正常，肾病组升高，激素治疗组较肾病组下降。
2.4 四组大鼠肝脏IGFBP-2，-3 mRNA表达之比较 食物对照组大鼠肝脏IGFBP-2 mRNA表达下降，肾病组升高，激素治疗组较肾病组减低。食物对照组大鼠肝脏IGFBP-3 mRNA表达正常，肾病组减低，激素治疗组较肾病组进一步下降(表3和附图)。
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Fig.1. RT-PCR of Liver IGFBP2，-3 in the four group
of rats
Lane 1～4：control，pair-fed，nephrotic and des-treated groups ，Marker Lane：PUC19DNA/MspI.
Table 3. Comparison of liver IGFBP-2 mRNA，IGFBP-3
mRNA expression(
±s，ADU) Groupsn
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IGFBP-2
IGFBP-3
Pair-fed
5
0.254±0.034△
0.362±0.016
Nephrotic
5
0.586±0.029△▲
0.298±0.029
Des-treated
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5
0.386±0.028▲★
0.230±0.021△▲☆
Control
5
0.410±0.028
0.348±0.016
△P<0.01 vs control， P<0.05 ▲P<0.01 vs pair-fed，P<0.05 ★P<0.01 vs nephrotic3 讨 论
3.1 营养、肾病和糖皮质激素对肝脏IGFBP-2，-3 mRNA表达和血清IGFBP-2，3浓度的影响 既往的研究证实，在限制蛋白饮食或营养不良的大鼠，血清IGFBP-3减低[5]，IGFBP-2增高[6]；并与肝脏IGFBP-3 mRNA表达下降[5]，IGFBP-2 mRNA增高[6]相一致；提示营养可通过影响肝脏IGFBP-2，3基因转录水平调节其血清浓度。与上述报道不同，在我们的研究中，食物对照组大鼠血清IGFBP-2，3浓度均减低，相对应，只有肝脏IGFBP-2 mRNA表达下降，IGFBP-3 mRNA正常，说明营养不良时仅有血清IGFBP-2减低来源于肝脏合成减少。
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我们发现，与NS患儿血清IGFBP-3减低、IGFBP-2增高相似[1，7]；肾病组大鼠血清IGFBP-3较食物对照组进一步减低的同时，血清IGFBP-2却明显升高，并与其肝脏IGFBP-2 mRNA表达增高，IGFBP-3 mRNA下降相一致，提示肾病时肝脏IGFBP-2/IGFBP-3合成增多/减少可能是其血清浓度发生改变的原因之一。肾病本身可导致血清IGFBP-2/IGFBP-3增高/减低也见于Thabet[8]和Hirschberg[4]等的报道，不同的是，后者在研究肝脏基因表达时仅证实IGFBP-2 mRNA增高，而IGFBP-3 mRNA正常。
激素对IGFBPs的影响研究不多，Miell等[9]报道激素治疗可导致健康成人血清IGFBP-2下降，IGFBP-3升高，这与激素治疗的胎鼠肝脏IGFBP-2 mRNA表达增多、IGFBP-3 mRNA减少[10]不相符。我们也观察到激素治疗组大鼠血清IGFBP-3浓度显著回升；尽管差异不显著，血清IGFBP-2亦轻度下降；这与经激素治疗后完全缓解的肾病患儿，其血清IGFBP-2，-3浓度完全恢复正常相一致[7]。由于肾病组大鼠肝脏IGFBP-2，-3 mRNA表达亦同时减少，提示除血清IGFBP-2减低来源于肝脏合成下降外，血清IGFBP-3浓度增高与肝脏合成无关。
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3.2 尿中IGFBP-2，-3排泄对血清IGFBP-2，-3浓度的影响 我们的研究证实，肾病组大鼠尿中IGFBP-2，-3排泄显著增高，与在肾病儿童[1]尿中观察到的相类似。不过，伴随着肾小球通透性减低，激素治疗组尿中IGFBP-2排泄虽无减少，但IGFBP-3却明显下降；这可能与IGFBP-2主要以分子量50 000的复合物形式存在，分子量较小而易于从肾小球滤过有关。通过相关分析我们进一步发现，血清IGFBP-3与血清白蛋白呈正相关(r＝0.658，P<0.01)、与尿蛋白呈负相关(r＝-0.475，P<0.05)，血清IGFBP-2与尿蛋白呈正相关(r＝0.732，P<0.01)，提示肾病时血清IGFBP-3减低可能部分源于尿中丢失增多，而血清IGFBP-2浓度增高则与其尿中排泄增多引起的肝脏代偿合成过度增加有关。Hirschberg等[4]确曾发现增高的尿中IGFBP-2排泄与更高的肝脏IGFBP-2合成同时存在于肾病大鼠，但为何都从尿中丢失，肝脏IGFBP-3合成却未代偿增加，其机制有待进一步探讨。
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3.3 IGFBP-3蛋白降解酶活性对血清IGFBP-3浓度的影响 血清IGFBP-3减低可能也与其降解加速有关。在许多生理和病理状态下，如妊娠、生长障碍和慢性肾功能不全时，这种蛋白酶的活性显著增高。尽管有报道夜间短期禁食对人血清IGFBP-3蛋白酶活性无影响[11]，但我们发现食物对照组大鼠血清IGFBP-3蛋白酶的活性仍明显增高，说明营养不良所致的血清IGFBP-3减低主要源于其在血清中降解加速。Pucilowsky等[12]也曾报道，营养不良儿童增高的血清IGFBP-3蛋白酶活性在重新进食后下降，支持我们的结论。与肾病儿童相同[1]，在肾病组大鼠，血清IGFBP-3蛋白酶活性正常；但尿中IGFBP-3蛋白酶活性却显著增高，Hirschberg等[4]也曾报道，肾病组大鼠尿中IGFBP-3蛋白酶活性增高且血清中含有IGFBP-3降解片段，提示肾病时IGFBP-3蛋白酶降解活性增强也是其血清浓度下降的重要因素。由于肾病时血清IGFBP-3蛋白酶活性正常而尿中增高，提示这种蛋白酶产生于肾脏并由肾小管分泌入尿中。Davenport等[13]曾发现孕鼠子宫组织内IGFBP-3蛋白酶活性显著增高，进一步证实了IGFBP-3的这种组织特殊降解作用。由此我们推测当血液流经肾脏时，血浆中的IGFBP-3才被降解而导致血清IGFBP-3浓度下降。激素治疗组尿中蛋白酶活降低，提示激素治疗引起的血清IGFBP-3浓度增高部分归因于IGFBP-3在肾脏的降解减弱。
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3.4 血清IGFBPs紊乱与生长障碍的关系 与营养状态良好的NS患儿血清IGF-I浓度正常[1]相似，我们的研究也证实了NS大鼠血清IGF-I浓度减低归因于继发性营养不良或随后的糖皮质激素治疗，肾病本身对血清IGF-I无影响；相反，NS大鼠血清IGFBP-2浓度增高仅基于肾病本身，而与继发性营养不良或随后的糖皮质激素治疗无关。通过相关分析进一步发现，大鼠鼻-尾长度和体重均与血清IGF-I呈正相关(r＝0.677，0.911，P均<0.01)，与血清IGFBP-2呈负相关(r＝-0.600，-0.523，P均<0.01)，提示除继发性营养不良和糖皮质激素治疗所致的生长障碍与血清IGF-I减低有关外，肾病本身所致的生长障碍与血清IGFBP-2增高有关。
湖南省自然科学基金资助课题[基金号 湘科计字(97)37号-17]，CMB基金部分资助；
易著文(课题负责人)
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(1999-11-01收稿，2000-03-01修回), 百拇医药