血管紧张素Ⅰ转换酶基因多态性与2型糖尿病肾病的关系
作者：顾敏峰 邓振霞 唐建英
单位：顾敏峰(无锡市第一人民医院内分泌科 214002)； 邓振霞(无锡市第一人民医院内分泌科 214002)； 唐建英(无锡市第一人民医院内分泌科 214002)
关键词：血管紧张素转换酶；基因多态性；糖尿病肾病
江苏医药000303 摘 要：目的 研究血管紧张素Ⅰ转换酶(ACE)基因多态性是否与2型糖尿病肾病(DN)相关。方法 用聚合酶链反应(PCR)扩增ACE基因第16内含子的一个287bp的插入/缺失(I/D)基因片段,1.5%琼脂糖凝胶电泳,紫外线灯下观察结果。共检测了225例江苏籍汉人(2型糖尿病175例,其中100例不伴DN,75例伴DN；对照者50例)的ACE I/D基因型。结果 各组间ACE I/D基因型和等位基因频率分布无明显差异(P>0.05)。结论 ACE基因I/D多态性与2型DN的发病无明显相关性。
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Relationship between angiotensin I converting enzyme gene polymorphism and diabetic nephropathy in Type 2 diabetes
GU Minfeng,DENG Zhengxia,TANG Jianying
(Department of Endocrinology,Wuxi First People′s Hospital,Wuxi 214002)
Abstract：Objective To study the relationship between angiotensin I converting enzyme (ACE) gene polymorphism and diabetic nephropathy(DN) in Type 2 diabetes.Methods A fragment of 287bp Alu sequence in inron 16 of ACE gene was used as insertion/deletion (I/D) polymorphic marker.After polymerase chain reaction(PCR) amplification of gene fragment,1.5% agarose gel electrophoresis was performed and the results were observed under ultraviolet.175 patients with Type 2 diabetes (Han,Jiangsu Province) were studied.Among them,100 who did not develop DN concomitantly formed the non-DN group,while the remaining 75,having DN, made up the DN group.Control group consisted of 50 healthy subjects.Results There was no significant difference between ACE gene I/D types and frequency of allele D,I in DN and non-DN group (P>0.05),between clinical DN and non-DN group (P>0.05),between early DN and non-DN group (P>0.05),between DN and control group.Conclusion There is not significant correlation between ACE gene I/D polymorphism and DN pathogenesis in patients with Type 2 diabetes.
, 百拇医药
Key words：Angiotensin converting enzyme Gene polymorphism Diabetic nephropathy▲
糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)重要的微血管并发症之一。迄今它的确切发病机制尚未完全明了。严格控制血糖能明显减少胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)肾病的发生和发展,但血糖控制后,仍有26%的病人尿白蛋白排泄率增加；相反,许多病人多年血糖控制不好,却不发生DN。说明高血糖只是DN发生的必要条件,而非充分条件。流行病学调查显示DN发病率在不同种族间存在很大差异；以及DN在家族群聚现象,均提示遗传因素参与DN的发病。血管紧张素Ⅰ转换酶(ACE)基因可能是其候选基因。近年来Marre等报道法国白种人ACEⅡ基因型与IDDM肾病危险性降低有关[1]。引起各国学者广泛关注,随后进行的各项研究,结果不一。本项研究调查了ACE基因I/D多态性与2型DN的相关性,旨在明确ACE基因变异型是否为预测2型DN有用的遗传标志。
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对象与方法
一、对象
1997年7月～1999年2月在本院内分泌科住院的2型糖尿病人175例。其诊断和分型符合1985年WHO的标准。江苏籍汉人。根据尿白蛋白排泄率(AER)分组(通过相关临床检查排除AER升高继发性原因)。
1.不伴肾病的2型DM组(AER<20μg/min)：100例,其中男51例,女49例,年龄56.3±11.3岁,病程4.29±4.99年,已剔除伴高血压、心脑疾病者。
2.伴肾病的2型糖尿病组(AER≥20μg/min)：75例,其中男39例,女36例,年龄62.4±9.9岁,病程9.23±7.58年。进一步分为2个亚组：
(1)早期DN组(AER20～200μg/min)：44例,男23例,女21例,年龄58.9±9.8岁,病程6.76±6.80年。
, 百拇医药
(2)临床DN组(AER>200μg/min)：31例,男16例,女15例,年龄66.7±8.3岁,病程12.45±7.45年。
3.正常对照组：参加健康体检血糖正常的本院职工50例,男26例,女24例,年龄58.1±8.6岁,无糖尿病、高血压、心脑肾疾病史。
二、方法
1.基因组DNA的抽提：从外周血快速提取DNA(按宝灵曼公司DNA抽提试剂盒说明书操作)。
2.ACE基因的PCR扩增：按Rigat[2]的方法。PCR反应引物分别为：5′-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3′,5′-GATGTGGCCATCACATT-CGTCAGAT-3′(引物委托上海市内分泌研究所合成)。用该对引物分别扩增490bp和190bp的基因片段,引用PCR扩增仪(美国PE-9600)。反应条件：初期变性为95℃,5分钟；继之30个周期,每个周期中变性94℃,1分钟；退火58℃,1分钟及延伸72℃,2分钟；终末延伸72℃,10分钟。取PCR扩增产物10μl,用1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴乙锭染色,紫外线灯下观察结果。出现490bp和190bp二条区带者为ID型；仅有490bp区带者为Ⅱ型；仅有190bp区带者为DD型。
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3.统计学分析：数据以
表示。组间频率比较用2×3表,χ2检验或2×2表,连续纠正χ2检验,P<0.05,认为有统计学意义。
结果
2型DM组(伴或不伴DN)和正常对照组的ACE基因型分布和等位基因频率见表1。临床DN亚组与正常组比较DD基因型和D等位基因频率分布有显著差异,P<0.05(χ2＝8.41；χ2＝6.26)。其余各组比较ACE基因型和D等位基因频率均无明显差异,P>0.05。
表1 2型DM与正常人的ACE基因型分布和等位基因频率 组 别
例数
基 因 型 频 率
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等位基因频率
DD
ID
Ⅱ
D
Ⅰ
不伴肾病的DM组
100
0.30(30)
0.48(48)
0.22(22)
0.54(108)
0.46(92)
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DN组
75
0.33(25)
0.45(34)
0.21(16)
0.56(84)
0.44(66)
临床DN亚组
31
0.45(14)*
0.39(12)
0.16(5)
, 百拇医药
0.65(40)*
0.35(22)
早期DN亚组
44
0.25(11)
0.50(22)
0.25(11)
0.50(44)
0.50(44)
正常组
50
0.16(8)
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0.54(27)
0.30(15)
0.43(43)
0.57(57)
注：括号内为例数,等位基因频率为染色体数；临床DN组与正常组比较DD基因型和D等位基因频率明显增加,*P<0.05
讨论
人群中每个个体的ACE水平很稳定,但个体间差异很大,可相差5倍。研究发现,血浆ACE水平主要由遗传因素决定,与ACE基因I/D多态性相关[3],DD纯合子血浆ACE水平最高；Ⅱ纯合子ACE水平最低；ID杂合子ACE水平介于两者之间。ACE是肾素-血管紧张素系统(R-AS)的关键酶,将血管紧张素Ⅰ(AT-Ⅰ)转换成具有强烈血管收缩活性的血管紧张素Ⅱ(AT-Ⅱ)；以及灭活舒血管物质缓激肽,从而影响全身及肾脏的血液动力学,调节全身血压以及肾小球内的压力,引起肾小球滤过压增高。近年来发现,ACE基因多态性与多种心血管疾病关联,与冠心病、心肌病、左心室肥厚关联；与DN相关性结果不一,一些报道与DN关联[1,4]；另一些报道未见关联[5,6]。本研究结果显示,伴或不伴肾病的2型糖尿病组相比较,ACE基因型及等位基因频率分布并无显著差异；与正常对照组比较,亦无显著差异；但临床DN亚组DD型及D等位基因频率明显高于正常组。从而表明ACE基因I/D多态性与DN发病无关联,但与疾病严重性相关。这在以往的研究中亦已报道,需行肾透析的IgA肾病病人中DD型明显增加[7],ACE抑制剂对DD型的DN患者疗效差[8]。但考虑到本项研究的病人数量较少,研究的统计力度还不够,故尚需进行广泛深入研究,积累更多的资料后才能明确ACE基因I/D多态性与DN的关系。■
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参考文献：
[1]Marre M,Bernadet P,Gallois Y,et al.Relationships between angiotensin 1 converting enzyme gene polymorphism,plasmal levels,and diabetic retinal and renal complications.Diabetes,1994,43：384-388.
[2]Rigat B,Hubert C,Corvol P,et al.PCR detection of the insertiondeletion polymorphism of the human angiotensin converting enzyme gene.Nucleic Acids Res,1992,20：1433.
[3]Winkelmann BR,Nauck M,Klein B,et al.Deletion polymorphism of the angiotensin-1 converting enzyme gene is associated with increased plasma angiotensin-converting enzyme activity but not with increased risk for myocardial infarction and coronary artery disease.Ann Intern Med,1996,125：19-25.
, 百拇医药
[4]Doria A,Warram JH,Krolewski AS.Genetic predisposition to diabetic nephropathy：evidence for a role of the angiotensin 1-converting enzyme gene.Diabetes,1994,43：690-695.
[5]Schmidt S,Schone N,Ritz E.Association of ACE gene polymorphism and diabetic nephropathy.Kidney Int,1995,47：1176-1181.
[6]Nakajima S,Baba T,Yajima Y.Is ACE gene polymorphism a useful marker for diabetic albuminuria in Japanese NIDDM patients？Diabetes Care,1996,19：1420-1422.
, 百拇医药
[7]Harden PN,Geddes C,Rowe PA,et al.Polymorphisms in angiotensin-converting enzyme gene and progression of IgA nephropathy.Lancet,1995,345：1540-1542.
[8]Penno G,Chaturvedi N,Talmud PJ,et al.Effect of angiotensin-converting enzyme gene polymorphism on progression of renal disease and the influence of ACE inhibition in IDDM patients：findings from the EUCLID randomized controlled trial.Diabetes,1998,47：1507-1511.
收稿日期：1999-05-06
修稿日期：1999-08-27, 百拇医药
单位：顾敏峰(无锡市第一人民医院内分泌科 214002)； 邓振霞(无锡市第一人民医院内分泌科 214002)； 唐建英(无锡市第一人民医院内分泌科 214002)
关键词：血管紧张素转换酶；基因多态性；糖尿病肾病
江苏医药000303 摘 要：目的 研究血管紧张素Ⅰ转换酶(ACE)基因多态性是否与2型糖尿病肾病(DN)相关。方法 用聚合酶链反应(PCR)扩增ACE基因第16内含子的一个287bp的插入/缺失(I/D)基因片段,1.5%琼脂糖凝胶电泳,紫外线灯下观察结果。共检测了225例江苏籍汉人(2型糖尿病175例,其中100例不伴DN,75例伴DN；对照者50例)的ACE I/D基因型。结果 各组间ACE I/D基因型和等位基因频率分布无明显差异(P>0.05)。结论 ACE基因I/D多态性与2型DN的发病无明显相关性。
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Relationship between angiotensin I converting enzyme gene polymorphism and diabetic nephropathy in Type 2 diabetes
GU Minfeng,DENG Zhengxia,TANG Jianying
(Department of Endocrinology,Wuxi First People′s Hospital,Wuxi 214002)
Abstract：Objective To study the relationship between angiotensin I converting enzyme (ACE) gene polymorphism and diabetic nephropathy(DN) in Type 2 diabetes.Methods A fragment of 287bp Alu sequence in inron 16 of ACE gene was used as insertion/deletion (I/D) polymorphic marker.After polymerase chain reaction(PCR) amplification of gene fragment,1.5% agarose gel electrophoresis was performed and the results were observed under ultraviolet.175 patients with Type 2 diabetes (Han,Jiangsu Province) were studied.Among them,100 who did not develop DN concomitantly formed the non-DN group,while the remaining 75,having DN, made up the DN group.Control group consisted of 50 healthy subjects.Results There was no significant difference between ACE gene I/D types and frequency of allele D,I in DN and non-DN group (P>0.05),between clinical DN and non-DN group (P>0.05),between early DN and non-DN group (P>0.05),between DN and control group.Conclusion There is not significant correlation between ACE gene I/D polymorphism and DN pathogenesis in patients with Type 2 diabetes.
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Key words：Angiotensin converting enzyme Gene polymorphism Diabetic nephropathy▲
糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)重要的微血管并发症之一。迄今它的确切发病机制尚未完全明了。严格控制血糖能明显减少胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)肾病的发生和发展,但血糖控制后,仍有26%的病人尿白蛋白排泄率增加；相反,许多病人多年血糖控制不好,却不发生DN。说明高血糖只是DN发生的必要条件,而非充分条件。流行病学调查显示DN发病率在不同种族间存在很大差异；以及DN在家族群聚现象,均提示遗传因素参与DN的发病。血管紧张素Ⅰ转换酶(ACE)基因可能是其候选基因。近年来Marre等报道法国白种人ACEⅡ基因型与IDDM肾病危险性降低有关[1]。引起各国学者广泛关注,随后进行的各项研究,结果不一。本项研究调查了ACE基因I/D多态性与2型DN的相关性,旨在明确ACE基因变异型是否为预测2型DN有用的遗传标志。
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对象与方法
一、对象
1997年7月～1999年2月在本院内分泌科住院的2型糖尿病人175例。其诊断和分型符合1985年WHO的标准。江苏籍汉人。根据尿白蛋白排泄率(AER)分组(通过相关临床检查排除AER升高继发性原因)。
1.不伴肾病的2型DM组(AER<20μg/min)：100例,其中男51例,女49例,年龄56.3±11.3岁,病程4.29±4.99年,已剔除伴高血压、心脑疾病者。
2.伴肾病的2型糖尿病组(AER≥20μg/min)：75例,其中男39例,女36例,年龄62.4±9.9岁,病程9.23±7.58年。进一步分为2个亚组：
(1)早期DN组(AER20～200μg/min)：44例,男23例,女21例,年龄58.9±9.8岁,病程6.76±6.80年。
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(2)临床DN组(AER>200μg/min)：31例,男16例,女15例,年龄66.7±8.3岁,病程12.45±7.45年。
3.正常对照组：参加健康体检血糖正常的本院职工50例,男26例,女24例,年龄58.1±8.6岁,无糖尿病、高血压、心脑肾疾病史。
二、方法
1.基因组DNA的抽提：从外周血快速提取DNA(按宝灵曼公司DNA抽提试剂盒说明书操作)。
2.ACE基因的PCR扩增：按Rigat[2]的方法。PCR反应引物分别为：5′-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3′,5′-GATGTGGCCATCACATT-CGTCAGAT-3′(引物委托上海市内分泌研究所合成)。用该对引物分别扩增490bp和190bp的基因片段,引用PCR扩增仪(美国PE-9600)。反应条件：初期变性为95℃,5分钟；继之30个周期,每个周期中变性94℃,1分钟；退火58℃,1分钟及延伸72℃,2分钟；终末延伸72℃,10分钟。取PCR扩增产物10μl,用1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴乙锭染色,紫外线灯下观察结果。出现490bp和190bp二条区带者为ID型；仅有490bp区带者为Ⅱ型；仅有190bp区带者为DD型。
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3.统计学分析：数据以
表示。组间频率比较用2×3表,χ2检验或2×2表,连续纠正χ2检验,P<0.05,认为有统计学意义。结果
2型DM组(伴或不伴DN)和正常对照组的ACE基因型分布和等位基因频率见表1。临床DN亚组与正常组比较DD基因型和D等位基因频率分布有显著差异,P<0.05(χ2＝8.41；χ2＝6.26)。其余各组比较ACE基因型和D等位基因频率均无明显差异,P>0.05。
表1 2型DM与正常人的ACE基因型分布和等位基因频率 组 别
例数
基 因 型 频 率
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等位基因频率
DD
ID
Ⅱ
D
Ⅰ
不伴肾病的DM组
100
0.30(30)
0.48(48)
0.22(22)
0.54(108)
0.46(92)
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DN组
75
0.33(25)
0.45(34)
0.21(16)
0.56(84)
0.44(66)
临床DN亚组
31
0.45(14)*
0.39(12)
0.16(5)
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0.65(40)*
0.35(22)
早期DN亚组
44
0.25(11)
0.50(22)
0.25(11)
0.50(44)
0.50(44)
正常组
50
0.16(8)
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0.54(27)
0.30(15)
0.43(43)
0.57(57)
注：括号内为例数,等位基因频率为染色体数；临床DN组与正常组比较DD基因型和D等位基因频率明显增加,*P<0.05
讨论
人群中每个个体的ACE水平很稳定,但个体间差异很大,可相差5倍。研究发现,血浆ACE水平主要由遗传因素决定,与ACE基因I/D多态性相关[3],DD纯合子血浆ACE水平最高；Ⅱ纯合子ACE水平最低；ID杂合子ACE水平介于两者之间。ACE是肾素-血管紧张素系统(R-AS)的关键酶,将血管紧张素Ⅰ(AT-Ⅰ)转换成具有强烈血管收缩活性的血管紧张素Ⅱ(AT-Ⅱ)；以及灭活舒血管物质缓激肽,从而影响全身及肾脏的血液动力学,调节全身血压以及肾小球内的压力,引起肾小球滤过压增高。近年来发现,ACE基因多态性与多种心血管疾病关联,与冠心病、心肌病、左心室肥厚关联；与DN相关性结果不一,一些报道与DN关联[1,4]；另一些报道未见关联[5,6]。本研究结果显示,伴或不伴肾病的2型糖尿病组相比较,ACE基因型及等位基因频率分布并无显著差异；与正常对照组比较,亦无显著差异；但临床DN亚组DD型及D等位基因频率明显高于正常组。从而表明ACE基因I/D多态性与DN发病无关联,但与疾病严重性相关。这在以往的研究中亦已报道,需行肾透析的IgA肾病病人中DD型明显增加[7],ACE抑制剂对DD型的DN患者疗效差[8]。但考虑到本项研究的病人数量较少,研究的统计力度还不够,故尚需进行广泛深入研究,积累更多的资料后才能明确ACE基因I/D多态性与DN的关系。■
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参考文献：
[1]Marre M,Bernadet P,Gallois Y,et al.Relationships between angiotensin 1 converting enzyme gene polymorphism,plasmal levels,and diabetic retinal and renal complications.Diabetes,1994,43：384-388.
[2]Rigat B,Hubert C,Corvol P,et al.PCR detection of the insertiondeletion polymorphism of the human angiotensin converting enzyme gene.Nucleic Acids Res,1992,20：1433.
[3]Winkelmann BR,Nauck M,Klein B,et al.Deletion polymorphism of the angiotensin-1 converting enzyme gene is associated with increased plasma angiotensin-converting enzyme activity but not with increased risk for myocardial infarction and coronary artery disease.Ann Intern Med,1996,125：19-25.
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[4]Doria A,Warram JH,Krolewski AS.Genetic predisposition to diabetic nephropathy：evidence for a role of the angiotensin 1-converting enzyme gene.Diabetes,1994,43：690-695.
[5]Schmidt S,Schone N,Ritz E.Association of ACE gene polymorphism and diabetic nephropathy.Kidney Int,1995,47：1176-1181.
[6]Nakajima S,Baba T,Yajima Y.Is ACE gene polymorphism a useful marker for diabetic albuminuria in Japanese NIDDM patients？Diabetes Care,1996,19：1420-1422.
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[7]Harden PN,Geddes C,Rowe PA,et al.Polymorphisms in angiotensin-converting enzyme gene and progression of IgA nephropathy.Lancet,1995,345：1540-1542.
[8]Penno G,Chaturvedi N,Talmud PJ,et al.Effect of angiotensin-converting enzyme gene polymorphism on progression of renal disease and the influence of ACE inhibition in IDDM patients：findings from the EUCLID randomized controlled trial.Diabetes,1998,47：1507-1511.
收稿日期：1999-05-06
修稿日期：1999-08-27, 百拇医药