微波固定组织对超微结构影响的电镜观察
作者：胡闻 陈柯 邢晓皖 吴红阳
单位：(安徽省立医院病理科，合肥 230001)
关键词：微波照射；组织固定；超微结构
临床与实验病理学杂志000218 摘要 目的：观察微波照射(microwave irradiation，MI)固定对组织细胞器结构的影响。方法：将大鼠肝组织分别浸泡在生理盐水、0.25%戊二醛、2.5%戊二醛、5%戊二醛液体中，按不同时间进行微波照射固定后，常规制片，电镜观察。结果：MI时间≤20 s，液体的温度≤25℃，肝细胞内各有形成分均有一定膨胀。MI时间≥60 s，液体的温度≥45℃时，肝细胞内各有形成分示不同程度破坏，其中戊二醛各组均较生理盐水组严重，且戊二醛组中，戊二醛浓度越高，对细胞内结构破坏性就越大。微波照射在40 s，各组液体的温度为33℃左右时固定最好，超微结构清晰，细胞器中各有形成分膨胀及损伤最小。结论：用微波照射浸泡在生理盐水内固定组织，做常规电镜制片，不失为一种组织固定的较佳方案。
, 百拇医药
中图分类号 R446.8 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(2000)03-0235-03
Electron microscopic observation on effect of ultrastructure of fixed tissue with microwave
Hu Wen Chen Ke Xing Xiaowan Wu Hongyang
(Dept of Pathol ，Provincial Hospital of Anhui，Hefei 230001)
ABSTRACT Purpose To observe the effect of microwave irradiation on cell organelles in tissue. Methods Four groups of mouse hepatic tissue immersed in physiological saline, 0.25%、2.5%、5% glutaraldehyde were irradiated with microwave for various time, then it was slided using normal method to observe by electron microscope. Results The hepatic cell organelles such as mitochondrion, endoplasmic reticulum were swelled to vavious degree when the irradiating time was less than 20 seconds and the solution temperature was lower than 25℃. When the irradiation time was more than 60 seconds and the solution temperature was higher than 45℃, the hepatic cell organelles were damaged to various degree. The destructive effect on hepatic cell organelles in glutaraldehyde group was higher than in physiological saline group.In glutaraldehyde groups ,destructive effect was remarkably gerious with its concentration. When the irradiation time was 40 seconds and the solution temperature was 33℃ or so ,the best fixed effect could be acquired. The ultrastructure was clear and no swelling or damage could be seen in cell organelles. Conclusion It is a better method that tissue-fixation using physiological saline with micowave irradiation instead of traditional glutaraldehyde solution.
, 百拇医药
KEY WORDS microwave irradiation; tissue fixation; ultrastructure
近年来,微波照射(microwave irradiation, MI)被越来越多地应用到组织细胞的固定中〔1〕，包括在电镜标本的前固定中〔2〕。但是MI在不同条件下，其固定效果不同。为了选择MI组织固定的最佳方案，我们做了以下的实验，现予报道。
1 材料与方法
选择正常成年SD小鼠断头处死，剖腹后迅速取肝组织切成1 mm3小块，立即浸入冷生理盐水中(8℃)。除对照组按常规方法固定处理外，其余标本置日产National-25型家用微波炉中，加热频率2 450 MHz，在全功率输出情况下，分不同时间进行微波照射。在微波炉内玻璃托盘中放1只四分格的塑料培养皿,培养皿中分别加入8 ml、6℃左右的生理盐水(第1组)、0.25%戊二醛(第2组)、2.5%戊二醛(第3组)、5%戊二醛(第4组)。将浸泡在冷生理盐水中的鼠肝组织分别放入以上4种液体内,每组标本都进行10、20、40、60以及100 s MI。为了避免培养皿中液体温度上升过快,以及低档微波间隙照射而产生的照射不均现象,故将微波炉开到最大档,全功率输出,并同时在培养皿四周等距离放置4个装有100 ml、6℃左右冷水杯子,以吸收多余微波。按设定时间进行MI固定。固定后将标本置入0.1 mol/L PBS液体中(pH7.4)清洗2次共20 min，然后加入2%锇酸后固定，在室温下60 min，逐级丙酮脱水，浸透后Spurr环氧树脂包埋，70℃聚合20 h〔3〕。LKB Ⅳ型切片机超薄切片，片厚60～70 nm。常规电子染色后，在日产JEM-1200 EX电镜下观察。
, http://www.100md.com
2 结果
4个实验组均随MI时间增加，培养皿内液体温度不断升高，细胞内各种细胞器的超微结构从固定不佳，逐渐变为固定良好。当MI处理过度时，则细胞内各种超微结构均有不同程度破坏，其破坏程度为戊二醛组大于生理盐水组。当MI 10 s、20 s时，各组液体温度分别是19℃、25℃时，细胞内线粒体、内质网呈不同程度膨胀，显示固定不佳(图1)；当MI 40 s时，液体温度为33℃左右，各组细胞超微结构都较好，境界清楚(图2)；当MI 60 s时液体温度为42℃左右，除生理盐水组变化较小外，其他3组超微结构都有不同程度破坏，尤其5%戊二醛组，组织破坏最为明显；当MI超过100 s时，各组液体温度为60℃以上，细胞内各种超微结构成分破坏，部分消失，出现微波损伤现象(图3)。
3 讨论
组织细胞的超微结构是否能清晰地在电镜观察中显示出来，主要取决于细胞中各种有形成分超微结构有无渗透损伤、收缩以及是否保留在原位。要想这些结构准确和清楚，组织细胞固定是极为重要环节。按照电镜制片经验，组织一般是用2.5%戊二醛固定，但有以下不足之处：①有时会出现组织结构不完整，图像不清楚等固定不良现象， 这可能与戊二醛穿透速度慢有关，在组织稍大或室温较高时，易出现组织深部固定不良，以及戊二醛在室温中长期保存则易产生沉淀。pH值改变又使醛的浓度下降等有关〔4〕。②原装戊二醛价格较高，且难购到。早在1985年，Leong等就采用微波技术进行电镜标本的前固定，并证明用生理盐水与2.5%戊二醛作固定介质经MI固定可获良好的标本。Marani等〔5，6〕曾经运用微波固定进行了脑的酶组织化学及肝琥珀酸脱氢酶细胞化学的电镜观察。上述研究结果均表明生理盐水能很好地保存酶活性及组织超微结构且优于微波福尔马林的固定和戊二醛固定〔5，6〕。本实验结果证实，微波生理盐水固定组织比微波戊二醛固定好，其中在生理盐水组中，MI 40 s或60 s、生理盐水温度在33℃～42℃时组织结构保存最好，经电子染色后，细胞内各种超微结构均清晰可见，定位准确。这可能与生理盐水能够维持细胞内外水、电解质平衡有关。当在化学试剂和标本上行MI时，产生快速分子运动，促进生理盐水向组织细胞内渗透。使生理盐水与组织蛋白在瞬间均匀热交联固定，使细胞内的超微结构形态位置不发生改变〔7〕。用这种方法固定组织更接近活体状态，固定时间也由原来2～6 h，缩短至60 s内，组织固定的质量也有所提高，同时生理盐水具有价廉、无毒、易配制等特点。因此我们认为，生理盐水浸泡组织后进行MI 40 s或60 s时组织损伤最少，优于不同浓度微波-戊二醛固定，同时也避免了因常规戊二醛固定的不足之处。
, 百拇医药
(本文承第一军医大学中心试验室罗深秋教授、朴英杰教授、刘辘璞高级实验师指导和帮助，特此致谢)
图1 微波照射20 s内肝细胞内线粒体及内质网有不同程度膨胀。TEM×18 000
图2 微波照射40 s左右，肝细胞内线粒体及内质网结构较好境界清楚。TEM×18 000
图3 微波照射60 s以上，肝细胞内线粒体及内质网结构破坏。TEM×18 000
作者简介：胡闻，男，43岁，主管技师。研究方向：临床病理超微结构
参考文献
1，陆珍风.微波-用于组织固定和染色的新技术.中华病理学杂志，1991；20：232
, 百拇医药
2，Gokhsle JA . Structure of rat kidneys following microwave accelerated fixation. Scanning Microsc, 1992；6(2):511～518
3，小川和朗,中根一穗主编(朴英杰等译).细胞膜的组织细胞化学技术. 广州：中山大学出版社，1991：9～10
4，AGE皮尔斯著(马促魁译).组织化学理论和实用—制备与光学技术.北京：人民卫生出版社，1985：92
5，Marani E,Bolhuis P,Boon ME et al.Brain enzyme histochemistry follwing slabilization by microwave irradiation.Histochem J，1988;20(6～7):397～404
6，胡 闻,肖 沙,汪凤霞. 微波固定对琥珀酸脱氢酶细胞化学影响的电镜观察. 临床与实验病理学杂志，1995；11(2)：105～107
7，黄 立.生物标本的微波固定.电子显微学报,1990；9(3)：116
收稿日期：1999-09-20
修回日期：2000-04-12, http://www.100md.com
单位：(安徽省立医院病理科，合肥 230001)
关键词：微波照射；组织固定；超微结构
临床与实验病理学杂志000218 摘要 目的：观察微波照射(microwave irradiation，MI)固定对组织细胞器结构的影响。方法：将大鼠肝组织分别浸泡在生理盐水、0.25%戊二醛、2.5%戊二醛、5%戊二醛液体中，按不同时间进行微波照射固定后，常规制片，电镜观察。结果：MI时间≤20 s，液体的温度≤25℃，肝细胞内各有形成分均有一定膨胀。MI时间≥60 s，液体的温度≥45℃时，肝细胞内各有形成分示不同程度破坏，其中戊二醛各组均较生理盐水组严重，且戊二醛组中，戊二醛浓度越高，对细胞内结构破坏性就越大。微波照射在40 s，各组液体的温度为33℃左右时固定最好，超微结构清晰，细胞器中各有形成分膨胀及损伤最小。结论：用微波照射浸泡在生理盐水内固定组织，做常规电镜制片，不失为一种组织固定的较佳方案。
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中图分类号 R446.8 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(2000)03-0235-03
Electron microscopic observation on effect of ultrastructure of fixed tissue with microwave
Hu Wen Chen Ke Xing Xiaowan Wu Hongyang
(Dept of Pathol ，Provincial Hospital of Anhui，Hefei 230001)
ABSTRACT Purpose To observe the effect of microwave irradiation on cell organelles in tissue. Methods Four groups of mouse hepatic tissue immersed in physiological saline, 0.25%、2.5%、5% glutaraldehyde were irradiated with microwave for various time, then it was slided using normal method to observe by electron microscope. Results The hepatic cell organelles such as mitochondrion, endoplasmic reticulum were swelled to vavious degree when the irradiating time was less than 20 seconds and the solution temperature was lower than 25℃. When the irradiation time was more than 60 seconds and the solution temperature was higher than 45℃, the hepatic cell organelles were damaged to various degree. The destructive effect on hepatic cell organelles in glutaraldehyde group was higher than in physiological saline group.In glutaraldehyde groups ,destructive effect was remarkably gerious with its concentration. When the irradiation time was 40 seconds and the solution temperature was 33℃ or so ,the best fixed effect could be acquired. The ultrastructure was clear and no swelling or damage could be seen in cell organelles. Conclusion It is a better method that tissue-fixation using physiological saline with micowave irradiation instead of traditional glutaraldehyde solution.
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KEY WORDS microwave irradiation; tissue fixation; ultrastructure
近年来,微波照射(microwave irradiation, MI)被越来越多地应用到组织细胞的固定中〔1〕，包括在电镜标本的前固定中〔2〕。但是MI在不同条件下，其固定效果不同。为了选择MI组织固定的最佳方案，我们做了以下的实验，现予报道。
1 材料与方法
选择正常成年SD小鼠断头处死，剖腹后迅速取肝组织切成1 mm3小块，立即浸入冷生理盐水中(8℃)。除对照组按常规方法固定处理外，其余标本置日产National-25型家用微波炉中，加热频率2 450 MHz，在全功率输出情况下，分不同时间进行微波照射。在微波炉内玻璃托盘中放1只四分格的塑料培养皿,培养皿中分别加入8 ml、6℃左右的生理盐水(第1组)、0.25%戊二醛(第2组)、2.5%戊二醛(第3组)、5%戊二醛(第4组)。将浸泡在冷生理盐水中的鼠肝组织分别放入以上4种液体内,每组标本都进行10、20、40、60以及100 s MI。为了避免培养皿中液体温度上升过快,以及低档微波间隙照射而产生的照射不均现象,故将微波炉开到最大档,全功率输出,并同时在培养皿四周等距离放置4个装有100 ml、6℃左右冷水杯子,以吸收多余微波。按设定时间进行MI固定。固定后将标本置入0.1 mol/L PBS液体中(pH7.4)清洗2次共20 min，然后加入2%锇酸后固定，在室温下60 min，逐级丙酮脱水，浸透后Spurr环氧树脂包埋，70℃聚合20 h〔3〕。LKB Ⅳ型切片机超薄切片，片厚60～70 nm。常规电子染色后，在日产JEM-1200 EX电镜下观察。
, http://www.100md.com
2 结果
4个实验组均随MI时间增加，培养皿内液体温度不断升高，细胞内各种细胞器的超微结构从固定不佳，逐渐变为固定良好。当MI处理过度时，则细胞内各种超微结构均有不同程度破坏，其破坏程度为戊二醛组大于生理盐水组。当MI 10 s、20 s时，各组液体温度分别是19℃、25℃时，细胞内线粒体、内质网呈不同程度膨胀，显示固定不佳(图1)；当MI 40 s时，液体温度为33℃左右，各组细胞超微结构都较好，境界清楚(图2)；当MI 60 s时液体温度为42℃左右，除生理盐水组变化较小外，其他3组超微结构都有不同程度破坏，尤其5%戊二醛组，组织破坏最为明显；当MI超过100 s时，各组液体温度为60℃以上，细胞内各种超微结构成分破坏，部分消失，出现微波损伤现象(图3)。
3 讨论
组织细胞的超微结构是否能清晰地在电镜观察中显示出来，主要取决于细胞中各种有形成分超微结构有无渗透损伤、收缩以及是否保留在原位。要想这些结构准确和清楚，组织细胞固定是极为重要环节。按照电镜制片经验，组织一般是用2.5%戊二醛固定，但有以下不足之处：①有时会出现组织结构不完整，图像不清楚等固定不良现象， 这可能与戊二醛穿透速度慢有关，在组织稍大或室温较高时，易出现组织深部固定不良，以及戊二醛在室温中长期保存则易产生沉淀。pH值改变又使醛的浓度下降等有关〔4〕。②原装戊二醛价格较高，且难购到。早在1985年，Leong等就采用微波技术进行电镜标本的前固定，并证明用生理盐水与2.5%戊二醛作固定介质经MI固定可获良好的标本。Marani等〔5，6〕曾经运用微波固定进行了脑的酶组织化学及肝琥珀酸脱氢酶细胞化学的电镜观察。上述研究结果均表明生理盐水能很好地保存酶活性及组织超微结构且优于微波福尔马林的固定和戊二醛固定〔5，6〕。本实验结果证实，微波生理盐水固定组织比微波戊二醛固定好，其中在生理盐水组中，MI 40 s或60 s、生理盐水温度在33℃～42℃时组织结构保存最好，经电子染色后，细胞内各种超微结构均清晰可见，定位准确。这可能与生理盐水能够维持细胞内外水、电解质平衡有关。当在化学试剂和标本上行MI时，产生快速分子运动，促进生理盐水向组织细胞内渗透。使生理盐水与组织蛋白在瞬间均匀热交联固定，使细胞内的超微结构形态位置不发生改变〔7〕。用这种方法固定组织更接近活体状态，固定时间也由原来2～6 h，缩短至60 s内，组织固定的质量也有所提高，同时生理盐水具有价廉、无毒、易配制等特点。因此我们认为，生理盐水浸泡组织后进行MI 40 s或60 s时组织损伤最少，优于不同浓度微波-戊二醛固定，同时也避免了因常规戊二醛固定的不足之处。
, 百拇医药
(本文承第一军医大学中心试验室罗深秋教授、朴英杰教授、刘辘璞高级实验师指导和帮助，特此致谢)
图1 微波照射20 s内肝细胞内线粒体及内质网有不同程度膨胀。TEM×18 000
图2 微波照射40 s左右，肝细胞内线粒体及内质网结构较好境界清楚。TEM×18 000
图3 微波照射60 s以上，肝细胞内线粒体及内质网结构破坏。TEM×18 000
作者简介：胡闻，男，43岁，主管技师。研究方向：临床病理超微结构
参考文献
1，陆珍风.微波-用于组织固定和染色的新技术.中华病理学杂志，1991；20：232
, 百拇医药
2，Gokhsle JA . Structure of rat kidneys following microwave accelerated fixation. Scanning Microsc, 1992；6(2):511～518
3，小川和朗,中根一穗主编(朴英杰等译).细胞膜的组织细胞化学技术. 广州：中山大学出版社，1991：9～10
4，AGE皮尔斯著(马促魁译).组织化学理论和实用—制备与光学技术.北京：人民卫生出版社，1985：92
5，Marani E,Bolhuis P,Boon ME et al.Brain enzyme histochemistry follwing slabilization by microwave irradiation.Histochem J，1988;20(6～7):397～404
6，胡 闻,肖 沙,汪凤霞. 微波固定对琥珀酸脱氢酶细胞化学影响的电镜观察. 临床与实验病理学杂志，1995；11(2)：105～107
7，黄 立.生物标本的微波固定.电子显微学报,1990；9(3)：116
收稿日期：1999-09-20
修回日期：2000-04-12, http://www.100md.com