TNFα对培养的脐静脉内皮细胞增殖的影响
作者：董红梅 喻伦银 贾宗智 张正彬 张玉霞
单位：董红梅(汕头大学医学院病理学教研室，汕头 515031)；喻伦银 张正彬 张玉霞(湖北医科大学病理学教研室，武汉 430071)；贾宗智(山西省长治医学院病理学教研室，长治 046000)
关键词：肿瘤坏死因子；血管内皮细胞；细胞增殖；脐静脉
临床与实验病理学杂志000317 摘要 目的：探讨肿瘤坏死因子α(TNFα,4×105 U/L)对血管内皮细胞增殖的影响。方法：将传代培养的脐静脉内皮细胞随机分为实验组和对照组两组，分别在细胞传代时加入含TNFα(TNFα含量为4×105 U/L)和等量的不含TNFα的培养液，通过描绘生长曲线及运用图像分析测定DNA相对含量来观察两组细胞增殖情况。结果：处理因素作用3天内实验组细胞增殖快于对照组，而3天后则慢于对照组。结论：TNFα(4×105 U/L)对培养的脐静脉内皮细胞的增殖的影响具有双向性。
, 百拇医药
中图分类号 R730.3 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(2000)03-0232-03
Effect of TNFα on endothelial cell proliferation
Dong Hongmei Yu Lunyin Jia Zongzhi Zhang Zhengbin Zhang Yuxia
(Dept of Pathol,Shantou University Medical College,Shantou 515031)
ABSTRACT Purpose To investigate the effect of TNFα on human umbilical vein endothelial cell proliferation.Methods Two groups were divided:experiment group,the medium with TNFα(4×105 U/L);control group,the medium without TNFα.TNFα was added in the cell passage. The growth curve and DNA image analysis were used for estimating the endothelial cell proliferation in the experiment. Results The cell proliferation was promoted in the first three days, but it was inhibited in the second three days. Conclusion TNFα has two-sided effect on the proliferation of the umbilical vein endothelial cells.
, 百拇医药
KEY WORDS tumor necrosis factor; vascular endothelial cell; cell proliferation;umbilical veins
肿瘤坏死因子(TNFα)是一种主要由活化的单核巨噬细胞产生的糖蛋白，TNFα通过肿瘤血管损伤和抑制血管形成的机制而产生抗肿瘤作用〔1〕。血管内皮表面存在TNFα受体〔2〕,为TNFα主要的靶细胞之一。
血管内皮细胞损伤是许多疾病发生发展的关键因素〔3，4〕。血管损伤后的修复与血管内皮细胞增殖情况有很大的关系。本研究旨在通过观察TNFα对血管内皮细胞生长曲线及细胞DNA相对含量的影响来探讨TNFα与血管内皮细胞增殖的关系，尝试探讨心血管疾病的发病机制。
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 材料
1.1.1 细胞来源 ECV304血管内皮细胞株购自武汉大学典型培养物保藏中心。
1.1.2 主要试剂 TNFα(10万U/支，北京邦定生物医学公司产品)，MEM培养基(Gibico产品)，EDTA(武汉化学试剂厂生产)，碱性品红(上海试剂三厂生产)，偏重亚硫酸钠(上海试剂四厂生产)。
1.1.3 实验仪器 IBAS-2000型图像分析仪及其配套计算机设备(德国Kontron公司生产)。
1.2 方法
1.2.1 细胞传代培养 参照文献〔5〕的方法操作：吸净培养瓶中的旧培养液，加入胰蛋白酶消化液，在倒置显微镜下观察，待细胞由多边形变为明显的圆形后，立即终止消化，并加入含有10%小牛血清、抗生素、谷氨酰胺培养液，将细胞轻轻吹散、混匀，按1∶2或1∶3装入培养瓶，37℃CO2培养箱培养。
, 百拇医药
1.2.2 生长曲线的绘制〔6〕 细胞用消化液消化，制成细胞悬液并细胞计数。以4×107细胞/L接种于24孔培养板中，连续观察7天，分别进行细胞消化，制成细胞悬液，计数。平均每天每组4孔，每孔计数2次，取其平均值为该天细胞数。以天数为横轴，以每天所得细胞数为纵轴，将各点连成线即为生长曲线。
1.2.3 图像分析观察DNA含量〔7，8〕 (1)标本制作：将无菌处理好的盖玻片传代时放入培养瓶中，分别于培养1、2、3、7天取出盖玻片，漂洗、固定。(2)Schiff试剂配制：将100 ml蒸馏水煮沸后立即放入碱性品红1 g，冷却至50℃后，加偏重亚硫酸钠2 g及1 mol/L稀盐酸20 ml，充分混合后避光保存18～24 h，加活性碳300 mg，用力摇动1 min后过滤即可染色。(3)Feulgen染色：室温下用8 mol/L盐酸水解10 min后入Schiff试剂作用20 min，水洗、脱水、透明、封片。(4)图像分析：用图像分析仪测量Feulgen染色后的内皮细胞，随机计数1个视野50个细胞，测出其积分光密度值(IOD)，然后计算IOD均值作为该细胞的DNA相对含量。
, 百拇医药
2 结果
2.1 实验组与对照组生长曲线 见图1。
图1 实验组与对照组长生曲线
从生长曲线可看出，正常的内皮细胞生长曲线呈光滑均匀的上升趋势，从第6天进入生长衰退期。TNFα前3天表现为对内皮细胞的促增殖作用，而3天后则表现为抑制作用。
2.2 实验组与对照组DNA含量图像分析 结果如表1，所有数据用
±s表示。 参照文献〔9〕将表1数据进行t检验，结果见表2。
表1 TNFα对血管内皮细胞DNA含量平均积分光密度的影响 组别
, 百拇医药
实验天数
1
2
3
7
对照组
19.71
(±4.13)
24.71
(±2.76)
23.62
(±3.51)
22.65
, 百拇医药
(±4.31)
实验组
20.40
(±3.51)
27.64
(±6.84)
25.84
(±2.46)
18.72
(±3.78)
表2 血管内皮细胞DNA含量平均积分光密度值检验表 组-组
实验天数
, 百拇医药
1
2
3
7
实验组-对照组
U=0.90
U=2.78
U=3.66
U=4.85
P值
P>0.05
P<0.05
P<0.05
, 百拇医药
P<0.05
3 讨论
观察细胞增殖的方法很多，生长曲线即是一种比较直观，简便的方法之一。细胞增殖活跃时，处于细胞增殖周期的细胞则明显增多，亦即处于S期(DNA合成期)的细胞增多，细胞的平均DNA含量也多。因而可用图像分析仪对细胞DNA相对含量进行测量，从而间接反映细胞增殖的活跃程度。
从本实验结果可看出，TNFα(4×105 U/L)短时间促内皮细胞增殖，而长时间则抑制其增殖。有关TNFα对内皮细胞增殖影响的报道很多，与其剂量、作用时间以及实验其他相关条件有关。Girando等〔10〕与Faris等〔11〕的研究结果显示：TNFα以时间、剂量依赖性上调血管内皮细胞生长因子受体-2(VEGFR-2)的表达和功能。TNFα亦能使内皮细胞表达不同型的碱性成纤维生长因子(bFGF)增多，而VEGFR-2 、bFGF均与血管内皮细胞增殖有关。这些结果均显示TNFα有间接促内皮细胞增殖的作用。而亦有报道显示〔12〕，TNFα(4×107 U/L)能直接抑制20%的血管内皮细胞增殖，且这种抑制作用是可逆的。据此，我们推测小剂量TNFα(4×105 U/L)短时间促内皮细胞增殖的作用可能与其表达VEGFR-2与bFGF增多有关。而长时间超生理剂量的TNFα本身对内皮细胞增殖抑制作用越来越明显，加之内皮细胞功能受损而导致VEGFR-2与bFGF生成减少，从而导致内皮细胞增殖抑制。
, http://www.100md.com
作者简介：董红梅，女，27岁，硕士研究生，现在汕头大学医学院病理学教研室工作
参考文献
1，Mclntosh JK,Mule JJ,Travis WD et al.Studies of effects of recombinant human tumor necrosis factor on autochthonous and transplanted normal tissue in mice.Cancer Res,1990;50:2463
2，Nawroth PP,Stern DM.Modulation of endothelial cell hemostatic properties by tumor necrosis factor.J Exp Med,1986;163:740
3，Roberts JM,Taylor RN,Musci TJ et al.Preeclampsia:An endothelial cell disorder. Am J Obstet Gynecol,1989;161:1200
, 百拇医药
4，Goldblum SE,Henning B,Jay M et al.Tumor necrosis factor α-induced pulmonary vascular endothelial injury.Infect Immunol,1989;57:1218
5，鄂 征主编.组织培养和分子细胞学技术.北京：北京出版社，1995：78
6，章静波主编.细胞生物学实用方法与技术.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1995：94
7，田玉旺，丁华野，吴 霞等.肿瘤细胞DNA图像定量分析.中华病理学杂志，1995；24：264
8，郑 伟，李一伟.肿瘤细胞DNA图像分析技术探讨.临床与实验病理学杂志，1997；13：180
9，杨树勤主编.卫生统计学.第3版，北京：人民卫生出版社，1992：33
, 百拇医药
10，Giraudo E,Primo L,Audero E et al.Tumor necrosis factor-alpha regulates expression of vascular endothelial growth factor receptor-2 and of its co-receptor neuropilin-1 in human vascular endothelial cells. J Biol Chem,1998;273:22128
11，Faris M,Ensoli B,Kokot N et al. Inflammatory cytokines induce the expression of basic fibroblast growth factor (bFGF) isoforms required for the growth of Kaposis sarcoma and endothelial cells through the activation of AP-1 response elements in the bFGF promoter. AIDS, 1998;12:19
12，ilmaz A,Bieler G,Spertini O et al.Pulse treatment of human vascular endothelial cells with high doses of tumor necrosis factor and interferon gamma results in simultaneous synergistic and reversible effects on proliferation and morphology. Int J Cancer,1998;77:592
收稿日期：1999-12-24, 百拇医药
单位：董红梅(汕头大学医学院病理学教研室，汕头 515031)；喻伦银 张正彬 张玉霞(湖北医科大学病理学教研室，武汉 430071)；贾宗智(山西省长治医学院病理学教研室，长治 046000)
关键词：肿瘤坏死因子；血管内皮细胞；细胞增殖；脐静脉
临床与实验病理学杂志000317 摘要 目的：探讨肿瘤坏死因子α(TNFα,4×105 U/L)对血管内皮细胞增殖的影响。方法：将传代培养的脐静脉内皮细胞随机分为实验组和对照组两组，分别在细胞传代时加入含TNFα(TNFα含量为4×105 U/L)和等量的不含TNFα的培养液，通过描绘生长曲线及运用图像分析测定DNA相对含量来观察两组细胞增殖情况。结果：处理因素作用3天内实验组细胞增殖快于对照组，而3天后则慢于对照组。结论：TNFα(4×105 U/L)对培养的脐静脉内皮细胞的增殖的影响具有双向性。
, 百拇医药
中图分类号 R730.3 文献标识码 A
文章编号 1001-7399(2000)03-0232-03
Effect of TNFα on endothelial cell proliferation
Dong Hongmei Yu Lunyin Jia Zongzhi Zhang Zhengbin Zhang Yuxia
(Dept of Pathol,Shantou University Medical College,Shantou 515031)
ABSTRACT Purpose To investigate the effect of TNFα on human umbilical vein endothelial cell proliferation.Methods Two groups were divided:experiment group,the medium with TNFα(4×105 U/L);control group,the medium without TNFα.TNFα was added in the cell passage. The growth curve and DNA image analysis were used for estimating the endothelial cell proliferation in the experiment. Results The cell proliferation was promoted in the first three days, but it was inhibited in the second three days. Conclusion TNFα has two-sided effect on the proliferation of the umbilical vein endothelial cells.
, 百拇医药
KEY WORDS tumor necrosis factor; vascular endothelial cell; cell proliferation;umbilical veins
肿瘤坏死因子(TNFα)是一种主要由活化的单核巨噬细胞产生的糖蛋白，TNFα通过肿瘤血管损伤和抑制血管形成的机制而产生抗肿瘤作用〔1〕。血管内皮表面存在TNFα受体〔2〕,为TNFα主要的靶细胞之一。
血管内皮细胞损伤是许多疾病发生发展的关键因素〔3，4〕。血管损伤后的修复与血管内皮细胞增殖情况有很大的关系。本研究旨在通过观察TNFα对血管内皮细胞生长曲线及细胞DNA相对含量的影响来探讨TNFα与血管内皮细胞增殖的关系，尝试探讨心血管疾病的发病机制。
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 材料
1.1.1 细胞来源 ECV304血管内皮细胞株购自武汉大学典型培养物保藏中心。
1.1.2 主要试剂 TNFα(10万U/支，北京邦定生物医学公司产品)，MEM培养基(Gibico产品)，EDTA(武汉化学试剂厂生产)，碱性品红(上海试剂三厂生产)，偏重亚硫酸钠(上海试剂四厂生产)。
1.1.3 实验仪器 IBAS-2000型图像分析仪及其配套计算机设备(德国Kontron公司生产)。
1.2 方法
1.2.1 细胞传代培养 参照文献〔5〕的方法操作：吸净培养瓶中的旧培养液，加入胰蛋白酶消化液，在倒置显微镜下观察，待细胞由多边形变为明显的圆形后，立即终止消化，并加入含有10%小牛血清、抗生素、谷氨酰胺培养液，将细胞轻轻吹散、混匀，按1∶2或1∶3装入培养瓶，37℃CO2培养箱培养。
, 百拇医药
1.2.2 生长曲线的绘制〔6〕 细胞用消化液消化，制成细胞悬液并细胞计数。以4×107细胞/L接种于24孔培养板中，连续观察7天，分别进行细胞消化，制成细胞悬液，计数。平均每天每组4孔，每孔计数2次，取其平均值为该天细胞数。以天数为横轴，以每天所得细胞数为纵轴，将各点连成线即为生长曲线。
1.2.3 图像分析观察DNA含量〔7，8〕 (1)标本制作：将无菌处理好的盖玻片传代时放入培养瓶中，分别于培养1、2、3、7天取出盖玻片，漂洗、固定。(2)Schiff试剂配制：将100 ml蒸馏水煮沸后立即放入碱性品红1 g，冷却至50℃后，加偏重亚硫酸钠2 g及1 mol/L稀盐酸20 ml，充分混合后避光保存18～24 h，加活性碳300 mg，用力摇动1 min后过滤即可染色。(3)Feulgen染色：室温下用8 mol/L盐酸水解10 min后入Schiff试剂作用20 min，水洗、脱水、透明、封片。(4)图像分析：用图像分析仪测量Feulgen染色后的内皮细胞，随机计数1个视野50个细胞，测出其积分光密度值(IOD)，然后计算IOD均值作为该细胞的DNA相对含量。
, 百拇医药
2 结果
2.1 实验组与对照组生长曲线 见图1。
图1 实验组与对照组长生曲线
从生长曲线可看出，正常的内皮细胞生长曲线呈光滑均匀的上升趋势，从第6天进入生长衰退期。TNFα前3天表现为对内皮细胞的促增殖作用，而3天后则表现为抑制作用。
2.2 实验组与对照组DNA含量图像分析 结果如表1，所有数据用
±s表示。 参照文献〔9〕将表1数据进行t检验，结果见表2。表1 TNFα对血管内皮细胞DNA含量平均积分光密度的影响 组别
, 百拇医药
实验天数
1
2
3
7
对照组
19.71
(±4.13)
24.71
(±2.76)
23.62
(±3.51)
22.65
, 百拇医药
(±4.31)
实验组
20.40
(±3.51)
27.64
(±6.84)
25.84
(±2.46)
18.72
(±3.78)
表2 血管内皮细胞DNA含量平均积分光密度值检验表 组-组
实验天数
, 百拇医药
1
2
3
7
实验组-对照组
U=0.90
U=2.78
U=3.66
U=4.85
P值
P>0.05
P<0.05
P<0.05
, 百拇医药
P<0.05
3 讨论
观察细胞增殖的方法很多，生长曲线即是一种比较直观，简便的方法之一。细胞增殖活跃时，处于细胞增殖周期的细胞则明显增多，亦即处于S期(DNA合成期)的细胞增多，细胞的平均DNA含量也多。因而可用图像分析仪对细胞DNA相对含量进行测量，从而间接反映细胞增殖的活跃程度。
从本实验结果可看出，TNFα(4×105 U/L)短时间促内皮细胞增殖，而长时间则抑制其增殖。有关TNFα对内皮细胞增殖影响的报道很多，与其剂量、作用时间以及实验其他相关条件有关。Girando等〔10〕与Faris等〔11〕的研究结果显示：TNFα以时间、剂量依赖性上调血管内皮细胞生长因子受体-2(VEGFR-2)的表达和功能。TNFα亦能使内皮细胞表达不同型的碱性成纤维生长因子(bFGF)增多，而VEGFR-2 、bFGF均与血管内皮细胞增殖有关。这些结果均显示TNFα有间接促内皮细胞增殖的作用。而亦有报道显示〔12〕，TNFα(4×107 U/L)能直接抑制20%的血管内皮细胞增殖，且这种抑制作用是可逆的。据此，我们推测小剂量TNFα(4×105 U/L)短时间促内皮细胞增殖的作用可能与其表达VEGFR-2与bFGF增多有关。而长时间超生理剂量的TNFα本身对内皮细胞增殖抑制作用越来越明显，加之内皮细胞功能受损而导致VEGFR-2与bFGF生成减少，从而导致内皮细胞增殖抑制。
, http://www.100md.com
作者简介：董红梅，女，27岁，硕士研究生，现在汕头大学医学院病理学教研室工作
参考文献
1，Mclntosh JK,Mule JJ,Travis WD et al.Studies of effects of recombinant human tumor necrosis factor on autochthonous and transplanted normal tissue in mice.Cancer Res,1990;50:2463
2，Nawroth PP,Stern DM.Modulation of endothelial cell hemostatic properties by tumor necrosis factor.J Exp Med,1986;163:740
3，Roberts JM,Taylor RN,Musci TJ et al.Preeclampsia:An endothelial cell disorder. Am J Obstet Gynecol,1989;161:1200
, 百拇医药
4，Goldblum SE,Henning B,Jay M et al.Tumor necrosis factor α-induced pulmonary vascular endothelial injury.Infect Immunol,1989;57:1218
5，鄂 征主编.组织培养和分子细胞学技术.北京：北京出版社，1995：78
6，章静波主编.细胞生物学实用方法与技术.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1995：94
7，田玉旺，丁华野，吴 霞等.肿瘤细胞DNA图像定量分析.中华病理学杂志，1995；24：264
8，郑 伟，李一伟.肿瘤细胞DNA图像分析技术探讨.临床与实验病理学杂志，1997；13：180
9，杨树勤主编.卫生统计学.第3版，北京：人民卫生出版社，1992：33
, 百拇医药
10，Giraudo E,Primo L,Audero E et al.Tumor necrosis factor-alpha regulates expression of vascular endothelial growth factor receptor-2 and of its co-receptor neuropilin-1 in human vascular endothelial cells. J Biol Chem,1998;273:22128
11，Faris M,Ensoli B,Kokot N et al. Inflammatory cytokines induce the expression of basic fibroblast growth factor (bFGF) isoforms required for the growth of Kaposis sarcoma and endothelial cells through the activation of AP-1 response elements in the bFGF promoter. AIDS, 1998;12:19
12，ilmaz A,Bieler G,Spertini O et al.Pulse treatment of human vascular endothelial cells with high doses of tumor necrosis factor and interferon gamma results in simultaneous synergistic and reversible effects on proliferation and morphology. Int J Cancer,1998;77:592
收稿日期：1999-12-24, 百拇医药