端粒、端粒酶和肿瘤
作者：伍东升
单位：伍东升(中国医学科学院北京协和医院消化内科 邮政编码 100730)
关键词：
北京医学000314 随着人们对肿瘤这一挑战性难题研究的深入，涉及的范围、深度也不断扩大。端粒、端粒酶和肿瘤是近年肿瘤研究方面方兴未艾的新动向，下面就它们之间的关系从基础 到临床应用及前景等方面作一综述。
一、端粒
从低等动物的四膜虫到人类，线性染色体的末端都有端粒，它是一组重复串联排列的小序列 ，其组成的通式为：Cn(A/T)m，n>m=1-4。在人类，其端粒基本组成是TTAGGG，主要作用是 防止染色体的降解，人类端粒的长度约为15Kb碱基。由于dsDNA存在末端复制问题，故 细胞 每分裂一次约丢失一个岗崎片断长度的DNA，即25～100对碱基。在体细胞中，端粒随细胞的 分裂而缩短，也逐渐失去对染色体DNA的保护作用。一般体细胞分裂100次左右，细胞即开始 衰老或凋亡，故称端粒为细胞分裂次数的分子钟。
, 百拇医药
二、端粒酶
端粒酶是由RNA组成的逆转录酶，合成端粒的DNA片段TTAGGG，其基因定位于人类染色体的3q .26.3上[1]。通过结合蛋白固定到端粒上，以自己的RNA为模板合成端粒的TTAGGG ，以补偿在细胞分裂过程中丢失的端粒DNA，使某些增殖旺盛的细胞和肿瘤细胞的端粒保持 一个动态的平衡，如胚胎细胞、造血干细胞、皮肤的基底细胞、胃肠的隐窝细胞和大多数的 肿瘤细胞中都可检测到端粒酶的活性。
三、端粒、端粒酶和肿瘤及细胞衰老的关系
端粒酶在临床肿瘤的诊断方面，首先是由Counter所描述，在卵巢癌中表达出活性。然而 后来发现在大多数的肿瘤中均可检测到端粒酶的活性，如在结肠癌中为92%[2]，肝 癌(HCC)中为85%[3]，肺癌中为80%[4]，胃癌中为85%[5]，其它 恶性肿瘤中也有高水平的端粒酶表达。而在良性肿瘤和炎性病变中则很少表达，故端粒酶可 作为诊断恶性肿瘤的标记物之一。
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端粒可人为地划分为：短(<4Kb)，中(4～10Kb)、长(>10Kb)三种长度。虽然大多数肿瘤 都有较短的端粒，但也有部分肿瘤有中等长度或较长的端粒。其与端粒及肿瘤的相关性并不 好，故端粒长度不宜作为诊断肿瘤的标记物。
根据细胞衰老的理论，细胞衰老分为M1和M2期，在M1期，靠近端粒附近的基因激活或 靠近染色体附近的92个端粒一部分DNA损伤所导致。在M1期，P53或PRB基因被启动，端粒 酶不被激活。端粒随细胞的分裂而缩短到不能保护染色体，导致染色体末端的降解或融合， 使染色体变得不稳定，导致细胞衰老凋亡。而一旦P53/PRB突变或结合了原癌基因，如SV40 的T抗原，乳头瘤病毒的E6/E7蛋白，则细胞进入M2期，激活端粒酶以维持端粒一定长度， 而导致细胞无限增殖。因此，肿瘤细胞的无限增殖，需要一定长度的端粒或不太长的端粒， 但必需有端粒酶的活性，以补偿细胞增殖过程所丢失的端粒。
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在Landberg等[6]对乳腺癌的研究中，在其增殖周期中，M1阶段主要由PRB所调控 ，如细胞周期因子cyclinD1/cyclinE的过量表达及正常的PRB，则有高水平的端粒酶，而 与低水平的P16INK4结合，也有高水平的活性。而P16INK4的主要作用是使PRB磷酸化而 失活，提高端粒酶的活性，间接促进肿瘤细胞的增殖。细胞核抗原Ki-67是细胞增殖的标志 抗原，如果PRB的失活和高水平的Ki-67，仅表达为中等强度的端粒酶。CyclinD1本身是 一种原癌基因，可以直接激活端粒酶而导致肿瘤细胞的增殖。在乳腺癌的发病机理中，可能 与细胞周期的某些调控因子缺乏有关，从而激活端粒酶，导致细胞无限增殖。
四、检测方法
端粒酶的检测可以利用痰、唾液、血液、尿液、大便以及各种管腔冲洗液，首先是1985年由 Greider在四膜虫中检测了端粒酶的活性，1994年由Kim[7]描述的建立在PCR基 础上的TRAP(telomeric repeat amplification protocol)法使检测端粒酶成为灵敏可靠的 方法。其主要原理是：端粒酶在TS的寡聚核苷酸上合成3～4个TTAGGG结构，然后以CT为引物 与TTAGGG结合，在同一反应体系中，加入Taq酶和细胞提取物-端粒酶，完成约27～31次PCR的扩增。并以[32P]dCTP为标记物，通过凝胶电泳放射自显影，可检测 出含TTA GGG的小片段，灵敏度可达1∶104个肿瘤细胞中均可检测出端粒酶的活性。1995年，Wrigh t等[8]应用改良的TRAP方法，使端粒酶检测成为半定量的方法，并且消除了假阴性 的结果，且可以在显微镜下直接利用单个肿瘤细胞进行端粒酶的检测。其具体方法是：将小 鼠肌蛋白的第97～132位DNA分别连到TS和CX引物上，使TS和CX有一段互补重叠区，然后合成 一个约150bp的内在端粒酶试验标准(internal telomerase assay standard，ITAS)，ITAS 既可作为端粒酶活性的参照标准，又可鉴别组织细胞中抑制端粒酶物质的存在。
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检测端粒的DNA，主要是利用Southern blot法，其长度主要是通过限制性核酸内切酶的方法 ，分析TRF(terminal restriction fragment)而获得。
hTR(human telomeric,RNA)是用Northern blot方法，并且发现在端粒酶阴性的肿瘤中，hTR 普遍较长，hTR在肿瘤细胞中不随端粒酶的升高而升高[9]，其原因有以下几种：① 某些肿瘤组织中RNA较少，而主要由端粒酶的RNA所组成，故测得的hTR显得较少。②一些癌 基因直接被激活，导致端粒延长，而不影响端粒酶。如幽门螺旋杆菌感染的胃癌中[5 ]。③虽有较长的hTR，端粒酶由于缺乏结合蛋白或端粒酶的下调作用而活性低下。
五、端粒酶的检测在临床中的应用
在消化系肿瘤中：胃癌中端粒酶[5]的阳性率为85%，肝癌[3](HCC)为85% ，结肠癌[2]为92%，并且尚可利用肠腔的灌洗液或肠镜所取的标本或大便进行端粒 酶 的检测。在胰腺癌[10]中，端粒酶的阳性率为95%，在11例胰腺良性病变中则未检 测到端粒酶的活性，但在3%的胰腺炎和14%的癌旁组织中(病理上未见癌细胞)发现端粒酶为 阳性。在慢性胰腺炎中，端粒酶阳性可能与淋巴结的浸润有关，而在癌旁组织中端粒酶的表 达可能与肿瘤的微小转移有关。
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在膀胱癌中，Yoshida等[11]发现：在固体标本中，端粒酶的阳性率为86%(48/56) ，且在其中28例pTa/pT1膀胱癌中，端粒酶均呈阳性。在5例分化为G1期的膀胱癌中，进行 尿液的脱落细胞学端粒酶的检测，3例为阳性，优于P53和H-ras的检查结果，而与膀胱癌的 CD44mRNA及蛋白检查结果相似。在头颈部肿瘤、神经系统肿瘤及乳腺癌中，端粒酶 的阳性率均可达80%以上。且端粒酶为阴性的肿瘤的预后要比阳性的要好，如神经母细胞瘤 端粒酶为阴性的预后要比阳性的要好，且部分肿瘤有自动消退的可能，在其它肿瘤中也有类 似的情况。
六、前景展望
1.对肿瘤的早期诊断已如前述，为提高诊断的敏感性，可与其它的肿瘤基因标记物相结合， 如：K-ras、P53基因或hTR。
2.判断外科手术效果：在切除肿瘤后，通过测定端粒酶的活性可以帮助判断有无癌细胞残留 。
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3.肿瘤治疗：可以利用纯化出的端粒酶基因、纯化蛋白、单克隆抗体等用以治疗。例如在胃 癌的治疗中，可做常规治疗后的辅助治疗，以清除体内的残余肿瘤细胞，对进展期的胃癌即 可以利用寡聚核苷酸PAN[12](peptide nucleic acids)，虽有副作用，如抑制造血 干细胞的增殖，但比常规化疗要轻得多，因为肿瘤细胞的增殖要比干细胞快得多。也可设法 加速端粒的缩短，此时加用PAN既能抑制肿瘤细胞，加速肿瘤细胞衰老死亡，又能使更新组 织细胞得到恢复，因此是行之有效的方法。
总之，有关端粒酶方面的问题尚有许多空白领域等待我们去探索。
(本文承蒙麦灿荣、陆星华大夫审校，特此致谢)
参 考 文 献
1，Soder AI,Hoare SF,Muir S,et al.Amplification,increased dosage and in s itu expression of the telomerase RNA gene in human cancer.Oncogene,1997,14:1013.
, 百拇医药
2，Chadeneau C,Hay K,Hirte H,et al.Telomerase activity associated with acquisitio n of malignancy in human colorectal cancer.Cancer Res,1995,55:2533.
3，Tahara H,Nakanishi T,Kitamoto M,et al.Telomerase activity in human liver tissu es:comparison between chronic liver disease and hepatocelluler carcinoma.Cancer Res,1995,55:2734.
4，Hiyma K,Hiyma E,Ishioka S,et al.Telomerase activity in small-cell and non-sm all-cell lung cancers.J Natl Cancer Inst,1995,87:895.
, 百拇医药
5，Hiyama E,Yokoyama T,Tatsumoto N,et al.Telomerase activity in gastric cancer.Ca ncer Res,1995,55:3258.
6，Landberg G,Niels HN,Pia N,et al.Telomerase activity is associated with cell cycle deregulation in human breast cancer.Cancer Res,1997,57:549.
7，Nam WK,Mieczyslaw A,Piatyszek,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.Science,1994,26:2011.
8，Woodring E,Wright,Jerry W,et al.Piatyszek modifications of a telomeric repeat ampilification protocol (TRAP) result in increased reliablity,linearity and sens itivity.Nucleic Acids Res,1995,23:3794.
, 百拇医药
9，Aiel AA,Mieczyslaw AP,Jyothi G,et al.Human telomerase RNA and telomerase act ivity in immortal cell lines and tumor tissues.Cancer Res,1996,56:645.
10，Eiso H,Takashi K,Kanae S,et al.Telomerase activity is detected in pancreatic cancer but not in benign tumors.Cancer Res,1997,57:326.
11，Yoshida K,Sugino T,Tahara H,et al.Telomerase activity in bladder cacinoma an d its implication for noninvasive diagnosis by detection of exfolated cancer cel ls in urine.Cancer,1997,79:362.
12，Norton JC,Piatyzek MA,Wright WE,et al.Inhibition of human telomeras activity by peptide nucleic acid oligomers.Nat Biotech,1996,14:615.
收稿：1998-12-10
修回：1999-06-07, http://www.100md.com
单位：伍东升(中国医学科学院北京协和医院消化内科 邮政编码 100730)
关键词：
北京医学000314 随着人们对肿瘤这一挑战性难题研究的深入，涉及的范围、深度也不断扩大。端粒、端粒酶和肿瘤是近年肿瘤研究方面方兴未艾的新动向，下面就它们之间的关系从基础 到临床应用及前景等方面作一综述。
一、端粒
从低等动物的四膜虫到人类，线性染色体的末端都有端粒，它是一组重复串联排列的小序列 ，其组成的通式为：Cn(A/T)m，n>m=1-4。在人类，其端粒基本组成是TTAGGG，主要作用是 防止染色体的降解，人类端粒的长度约为15Kb碱基。由于dsDNA存在末端复制问题，故 细胞 每分裂一次约丢失一个岗崎片断长度的DNA，即25～100对碱基。在体细胞中，端粒随细胞的 分裂而缩短，也逐渐失去对染色体DNA的保护作用。一般体细胞分裂100次左右，细胞即开始 衰老或凋亡，故称端粒为细胞分裂次数的分子钟。
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二、端粒酶
端粒酶是由RNA组成的逆转录酶，合成端粒的DNA片段TTAGGG，其基因定位于人类染色体的3q .26.3上[1]。通过结合蛋白固定到端粒上，以自己的RNA为模板合成端粒的TTAGGG ，以补偿在细胞分裂过程中丢失的端粒DNA，使某些增殖旺盛的细胞和肿瘤细胞的端粒保持 一个动态的平衡，如胚胎细胞、造血干细胞、皮肤的基底细胞、胃肠的隐窝细胞和大多数的 肿瘤细胞中都可检测到端粒酶的活性。
三、端粒、端粒酶和肿瘤及细胞衰老的关系
端粒酶在临床肿瘤的诊断方面，首先是由Counter所描述，在卵巢癌中表达出活性。然而 后来发现在大多数的肿瘤中均可检测到端粒酶的活性，如在结肠癌中为92%[2]，肝 癌(HCC)中为85%[3]，肺癌中为80%[4]，胃癌中为85%[5]，其它 恶性肿瘤中也有高水平的端粒酶表达。而在良性肿瘤和炎性病变中则很少表达，故端粒酶可 作为诊断恶性肿瘤的标记物之一。
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端粒可人为地划分为：短(<4Kb)，中(4～10Kb)、长(>10Kb)三种长度。虽然大多数肿瘤 都有较短的端粒，但也有部分肿瘤有中等长度或较长的端粒。其与端粒及肿瘤的相关性并不 好，故端粒长度不宜作为诊断肿瘤的标记物。
根据细胞衰老的理论，细胞衰老分为M1和M2期，在M1期，靠近端粒附近的基因激活或 靠近染色体附近的92个端粒一部分DNA损伤所导致。在M1期，P53或PRB基因被启动，端粒 酶不被激活。端粒随细胞的分裂而缩短到不能保护染色体，导致染色体末端的降解或融合， 使染色体变得不稳定，导致细胞衰老凋亡。而一旦P53/PRB突变或结合了原癌基因，如SV40 的T抗原，乳头瘤病毒的E6/E7蛋白，则细胞进入M2期，激活端粒酶以维持端粒一定长度， 而导致细胞无限增殖。因此，肿瘤细胞的无限增殖，需要一定长度的端粒或不太长的端粒， 但必需有端粒酶的活性，以补偿细胞增殖过程所丢失的端粒。
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在Landberg等[6]对乳腺癌的研究中，在其增殖周期中，M1阶段主要由PRB所调控 ，如细胞周期因子cyclinD1/cyclinE的过量表达及正常的PRB，则有高水平的端粒酶，而 与低水平的P16INK4结合，也有高水平的活性。而P16INK4的主要作用是使PRB磷酸化而 失活，提高端粒酶的活性，间接促进肿瘤细胞的增殖。细胞核抗原Ki-67是细胞增殖的标志 抗原，如果PRB的失活和高水平的Ki-67，仅表达为中等强度的端粒酶。CyclinD1本身是 一种原癌基因，可以直接激活端粒酶而导致肿瘤细胞的增殖。在乳腺癌的发病机理中，可能 与细胞周期的某些调控因子缺乏有关，从而激活端粒酶，导致细胞无限增殖。
四、检测方法
端粒酶的检测可以利用痰、唾液、血液、尿液、大便以及各种管腔冲洗液，首先是1985年由 Greider在四膜虫中检测了端粒酶的活性，1994年由Kim[7]描述的建立在PCR基 础上的TRAP(telomeric repeat amplification protocol)法使检测端粒酶成为灵敏可靠的 方法。其主要原理是：端粒酶在TS的寡聚核苷酸上合成3～4个TTAGGG结构，然后以CT为引物 与TTAGGG结合，在同一反应体系中，加入Taq酶和细胞提取物-端粒酶，完成约27～31次PCR的扩增。并以[32P]dCTP为标记物，通过凝胶电泳放射自显影，可检测 出含TTA GGG的小片段，灵敏度可达1∶104个肿瘤细胞中均可检测出端粒酶的活性。1995年，Wrigh t等[8]应用改良的TRAP方法，使端粒酶检测成为半定量的方法，并且消除了假阴性 的结果，且可以在显微镜下直接利用单个肿瘤细胞进行端粒酶的检测。其具体方法是：将小 鼠肌蛋白的第97～132位DNA分别连到TS和CX引物上，使TS和CX有一段互补重叠区，然后合成 一个约150bp的内在端粒酶试验标准(internal telomerase assay standard，ITAS)，ITAS 既可作为端粒酶活性的参照标准，又可鉴别组织细胞中抑制端粒酶物质的存在。
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检测端粒的DNA，主要是利用Southern blot法，其长度主要是通过限制性核酸内切酶的方法 ，分析TRF(terminal restriction fragment)而获得。
hTR(human telomeric,RNA)是用Northern blot方法，并且发现在端粒酶阴性的肿瘤中，hTR 普遍较长，hTR在肿瘤细胞中不随端粒酶的升高而升高[9]，其原因有以下几种：① 某些肿瘤组织中RNA较少，而主要由端粒酶的RNA所组成，故测得的hTR显得较少。②一些癌 基因直接被激活，导致端粒延长，而不影响端粒酶。如幽门螺旋杆菌感染的胃癌中[5 ]。③虽有较长的hTR，端粒酶由于缺乏结合蛋白或端粒酶的下调作用而活性低下。
五、端粒酶的检测在临床中的应用
在消化系肿瘤中：胃癌中端粒酶[5]的阳性率为85%，肝癌[3](HCC)为85% ，结肠癌[2]为92%，并且尚可利用肠腔的灌洗液或肠镜所取的标本或大便进行端粒 酶 的检测。在胰腺癌[10]中，端粒酶的阳性率为95%，在11例胰腺良性病变中则未检 测到端粒酶的活性，但在3%的胰腺炎和14%的癌旁组织中(病理上未见癌细胞)发现端粒酶为 阳性。在慢性胰腺炎中，端粒酶阳性可能与淋巴结的浸润有关，而在癌旁组织中端粒酶的表 达可能与肿瘤的微小转移有关。
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在膀胱癌中，Yoshida等[11]发现：在固体标本中，端粒酶的阳性率为86%(48/56) ，且在其中28例pTa/pT1膀胱癌中，端粒酶均呈阳性。在5例分化为G1期的膀胱癌中，进行 尿液的脱落细胞学端粒酶的检测，3例为阳性，优于P53和H-ras的检查结果，而与膀胱癌的 CD44mRNA及蛋白检查结果相似。在头颈部肿瘤、神经系统肿瘤及乳腺癌中，端粒酶 的阳性率均可达80%以上。且端粒酶为阴性的肿瘤的预后要比阳性的要好，如神经母细胞瘤 端粒酶为阴性的预后要比阳性的要好，且部分肿瘤有自动消退的可能，在其它肿瘤中也有类 似的情况。
六、前景展望
1.对肿瘤的早期诊断已如前述，为提高诊断的敏感性，可与其它的肿瘤基因标记物相结合， 如：K-ras、P53基因或hTR。
2.判断外科手术效果：在切除肿瘤后，通过测定端粒酶的活性可以帮助判断有无癌细胞残留 。
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3.肿瘤治疗：可以利用纯化出的端粒酶基因、纯化蛋白、单克隆抗体等用以治疗。例如在胃 癌的治疗中，可做常规治疗后的辅助治疗，以清除体内的残余肿瘤细胞，对进展期的胃癌即 可以利用寡聚核苷酸PAN[12](peptide nucleic acids)，虽有副作用，如抑制造血 干细胞的增殖，但比常规化疗要轻得多，因为肿瘤细胞的增殖要比干细胞快得多。也可设法 加速端粒的缩短，此时加用PAN既能抑制肿瘤细胞，加速肿瘤细胞衰老死亡，又能使更新组 织细胞得到恢复，因此是行之有效的方法。
总之，有关端粒酶方面的问题尚有许多空白领域等待我们去探索。
(本文承蒙麦灿荣、陆星华大夫审校，特此致谢)
参 考 文 献
1，Soder AI,Hoare SF,Muir S,et al.Amplification,increased dosage and in s itu expression of the telomerase RNA gene in human cancer.Oncogene,1997,14:1013.
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2，Chadeneau C,Hay K,Hirte H,et al.Telomerase activity associated with acquisitio n of malignancy in human colorectal cancer.Cancer Res,1995,55:2533.
3，Tahara H,Nakanishi T,Kitamoto M,et al.Telomerase activity in human liver tissu es:comparison between chronic liver disease and hepatocelluler carcinoma.Cancer Res,1995,55:2734.
4，Hiyma K,Hiyma E,Ishioka S,et al.Telomerase activity in small-cell and non-sm all-cell lung cancers.J Natl Cancer Inst,1995,87:895.
, 百拇医药
5，Hiyama E,Yokoyama T,Tatsumoto N,et al.Telomerase activity in gastric cancer.Ca ncer Res,1995,55:3258.
6，Landberg G,Niels HN,Pia N,et al.Telomerase activity is associated with cell cycle deregulation in human breast cancer.Cancer Res,1997,57:549.
7，Nam WK,Mieczyslaw A,Piatyszek,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.Science,1994,26:2011.
8，Woodring E,Wright,Jerry W,et al.Piatyszek modifications of a telomeric repeat ampilification protocol (TRAP) result in increased reliablity,linearity and sens itivity.Nucleic Acids Res,1995,23:3794.
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9，Aiel AA,Mieczyslaw AP,Jyothi G,et al.Human telomerase RNA and telomerase act ivity in immortal cell lines and tumor tissues.Cancer Res,1996,56:645.
10，Eiso H,Takashi K,Kanae S,et al.Telomerase activity is detected in pancreatic cancer but not in benign tumors.Cancer Res,1997,57:326.
11，Yoshida K,Sugino T,Tahara H,et al.Telomerase activity in bladder cacinoma an d its implication for noninvasive diagnosis by detection of exfolated cancer cel ls in urine.Cancer,1997,79:362.
12，Norton JC,Piatyzek MA,Wright WE,et al.Inhibition of human telomeras activity by peptide nucleic acid oligomers.Nat Biotech,1996,14:615.
收稿：1998-12-10
修回：1999-06-07, http://www.100md.com