儿童急性白血病G-CSF自身抗体及其对G-CSF血清浓度的影响
作者：孙金英 刘乐宇 刘明泽 刘桂兰 殷惠君
单位：孙金英(北京医科大学人民医院儿科 邮政编码 100044)；刘乐宇(北京医科大学人民医院儿科 邮政编码 100044)；刘明泽(北京医科大学人民医院儿科 邮政编码 100044)；刘桂兰(北京医科大学人民医院儿科 邮政编码 100044) ；殷惠君(北京医科大学人民医院儿科 邮政编码 100044)
关键词：自身抗体；G-CSF；白血病
北京医学000302 摘要 目的 研究急性白血病患儿应用rhG-CSF后自 身抗体的产生及对G-CSF血清浓度的影响。方法 应用ELISA技术检 测46例急性白血病患儿和104例正常儿童。结果 11例应用rh G-CSF的急性白血病患儿检测到自身抗体。结论 G-CSF自身抗体 的产生与rhG-CSF剂量和疗程无关，且不显著地降低G-CSF血清浓度。rhG-CSF临床应用具 有安全性。
, 百拇医药
Occurrence of therapy-induced autoantibodies to G-CSF and th eir influence on
serum G-CSF concentration in children with acute leukemia
Sun Jinying Liu Leyu Liu Mingze et al
(Department of Pediatrics,People's Hospital,Beijing Medical Universit y,Beijing 100044)
Abstract Objective To investigate the occurrence of aut oantibodies after using rhG-CSF in children with acute leukemia and their influ ence on serum G-CSF concentration.Methods Blood samples collected from 46 patients with acute leukemia and 104 normal children were meas ured with ELISA technique.Results Autoantibodies were det ected in 11 children with acute leukemia.Conclusions The occurrence of G-CSF autoantibodies have no significant relationship to rhG-CSF doses and courses,and have no influence on serum G-CSF concentration.Clinical application of rhG-CSF is safety.
, 百拇医药
Key words Autoantibodies G-CSF Leukemia
在儿童急性白血病化疗的辅助治疗中，应用最广泛的是重组粒细胞集落刺激因子(rhG- CSF)，并已成为常规的治疗手段。已知一些细胞因子(如IL-2、GM-CSF、INF等)应用于人 体可诱导自身抗体的产生[1]，我们既往的研究亦证实急性白血病患儿应用rhG-CS F的过程中可以诱导产生自身抗体。由于此诱导产生的主要是中和型抗体(IgG)，因此 我们试图探讨该自身抗体对G-CSF的某些影响作用，现报告如下。
对象与方法
一、研究对象与标本
1994～1998年在我院儿科住院治疗的46例急性白血病患儿，年龄1.5～15岁，平均9.4岁。 其中男32例，女14例。急性淋巴细胞白血病30例，急性髓性白血病14例，淋巴瘤细胞性 白血病2例。共收集到91份血清标本。患儿按常规方法接受大剂量的化疗[2]，其中 有38例患儿在化疗的不同时间接受G-CSF治疗。所选用的G-CSF制剂为真核细胞表达的人重 组产品(rhG-CSF)，每疗程用量为5μg/d，共用10～14天。平均每人应用rhG-CSF 2.64个疗程，用量为2 296μg。有8例患儿始终未应用rhG-CSF。在不同的治疗时间留取患儿的血 清标本，-70℃条件下冻存。将104例不同年龄的正常儿童的血清作为正常对照(年龄1～14 岁，平均8.6岁)。
, 百拇医药
二、方法
1.ELISA检测rhG-CSF自身抗体：操作程序如下：200ng rhG-CSF直接包被于96孔酶标板(nu nc)上，加入1∶100稀释的被检血清100μl，37℃ 1小时；洗板、甩干后，加入辣根过氧化 酶标记的羊抗人IgG抗体100μl(1∶1 000稀释)，37℃ 30分钟。加酶显色底物各100μl，显 色5分钟后用2mol H2SO4终止显色反应。在酶标仪(denleywellscan)450nm下测定A 值。
2.ELISA方法测定血清G-CSF含量：应用双抗体夹心法(北京协和医院诊断试剂厂G-CSF酶联 免疫检测试剂盒)按说明书及文献进行操作，用酶标仪在450nm波长下检测A值。每一份 标本均检测两次，取其平均值进行分析研究。
G-CSF定量标准曲线的制作：将G-CSF标准品经系列稀释成不同浓度后按同上检测方法测定 。用不同浓度G-CSF标准品的对数值及所读出的A值，通过最小二乘法得出回归方程Y=0 .3436+0.7651X，r=0.996。G-CSF的检测敏感性(下限)为1ng/ml。
, 百拇医药
结 果
一、ELISA方法检测G-CSF抗体的结果
对104例正常儿童血清标本的ELISA检测，其A值的均值为0.0694±0.0190，均值加上3 个标准差(P=0.99)值为0.126。我们选用A=0.130作为正常值的标准。根据这一 标准，正常的儿童组及8例未用过rhG-CSF的患儿均为阴性结果。在38例应用rhG-CSF的患 儿中，有11例患儿的31份不同时期的血清标本为抗体阳性，抗体稀释度为1∶200～1∶ 400之间。有6例患儿G-CSF抗体阳性发生在第一个疗程的rhG-CSF结束后，另5例患儿在多 个rhG-CSF疗程后G-CSF抗体成为阳性。
二、G-CSF抗体与血清G-CSF浓度的关系
在38例临床应用rhG-CSF的患儿中，有29例患儿的47份血清标本取自应用G-CSF期间或之 后的数天内。G-CSF浓度定量为5.335±5.597ng/ml，最低值为2.474ng/ml，最高值为 31.293ng/ml。在G-CSF抗体阳性的病例中，平均血清G-CSF浓度为8.019±9.861ng/ml ，而G-CSF抗体检测为阴性的病例中，平均血清G-CSF浓度为5.040±3.318ng/ml。统计学 分析两者之间无显著性差异(P>0.05)。
, 百拇医药
三、G-CSF抗体与临床rhG-CSF用量的关系
在11例G-CSF抗体检测为阳性的患儿中，抗体阳性前平均rhG-CSF用量为2 800.00±2 673.52μg，平均疗程为3.00±2.30；而在G-CSF抗体检测为阴性的患儿中，平均rhG-CSF 用量为1 918.75±2 024.59μg，平均疗程为2.38±2.03。统计学分析证实，两者均无 显著性差异(P>0.05)。
讨 论
根据文献报道，应用细胞因子进行临床治疗时自身抗体的发生率为20%～30%[3] 。我们的研究中，患儿临床应用的rhG-CSF为真核细胞的表达产物，38例中有11例(28.9%) 自身抗体检测为阳性。鉴于有如此高比例的患儿在临床应用rhG-CSF的过程中可能发生自身 抗体，因此，进一步了解该自身抗体对血液G-CSF的影响是十分重要的。
, http://www.100md.com
根据我们的研究，在G-CSF自身抗体阴性和阳性的病例之间，抗体的产生与临床rhG-CSF的 用量及疗程无明确的关系，统计学分析无显著性差异。这一结果提示，G-CSF自身抗体的产 生可能更取决于患儿机体的免疫状态。
由于治疗诱导的G-CSF自身抗体的类型主要为IgG[4]，其本身具有中和抗体的特性 ，因此我们同时对患儿的G-CSF血清浓度进行了测定。结果发现在G-CSF抗体阴性组和阳性 组之间，血清G-CSF浓度值之间无显著性差异，提示G-CSF自身抗体可能并不显著地降低G -CSF血清浓度。
根据以上结果，如何来评价G-CSF自身抗体的临床意义呢?尽管有一些观点认为自身抗体可 抑制细胞因子的功能，产生负性的作用；但Bendtzen[5]却认为细胞因子抗体可能 具有有益的作用，例如其可以防止蛋白酶对细胞因子的降解，或减少其它细胞表面的特 异性受体与细胞因子的结合。抗体的这种作用的结果，应当是保持细胞因子体内浓度的稳定 。我们的研究结果与Bendtzen的观点相一致，其意义在于为临床大剂量、长 期反复地应用rhG-CSF提供了安全性方面的依据。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，Bendtzen K,Hansen MB,Ross C,et al.Cytokines and autoantibodies to cyt okines.Stem Cells,1995,13:206.
2，殷慧君.急性淋巴细胞白血病的化学治疗和急性髓性白血病的化学治疗.见：殷慧君主编 .小儿急性白血病化学治疗.北京：科学出版社.1996：55～90.
3，Bendtzen K,Hansen MB,Diamant M,et al，Naturally occurring autoantibodies to int， erleukin-la,interleukin-6,interleukin-10 and interferon-a，J Interferon Re s,1994,14:157，4，Svenson M,Hansen MB,Ross C,et al，Antibody to granulocyte-macrophage colony-s timulation factor is a dominant anticytokine activity in human IgG preparations， Blood,1998,91:2054，5，Bendtzen K,Svenson M,Jonsso V,et al，Autoantibodies to cytokines:friends or foe s? Immunol Today,1990,11:167，收稿：1999-01-18
修回：1999-08-12, 百拇医药
单位：孙金英(北京医科大学人民医院儿科 邮政编码 100044)；刘乐宇(北京医科大学人民医院儿科 邮政编码 100044)；刘明泽(北京医科大学人民医院儿科 邮政编码 100044)；刘桂兰(北京医科大学人民医院儿科 邮政编码 100044) ；殷惠君(北京医科大学人民医院儿科 邮政编码 100044)
关键词：自身抗体；G-CSF；白血病
北京医学000302 摘要 目的 研究急性白血病患儿应用rhG-CSF后自 身抗体的产生及对G-CSF血清浓度的影响。方法 应用ELISA技术检 测46例急性白血病患儿和104例正常儿童。结果 11例应用rh G-CSF的急性白血病患儿检测到自身抗体。结论 G-CSF自身抗体 的产生与rhG-CSF剂量和疗程无关，且不显著地降低G-CSF血清浓度。rhG-CSF临床应用具 有安全性。
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Occurrence of therapy-induced autoantibodies to G-CSF and th eir influence on
serum G-CSF concentration in children with acute leukemia
Sun Jinying Liu Leyu Liu Mingze et al
(Department of Pediatrics,People's Hospital,Beijing Medical Universit y,Beijing 100044)
Abstract Objective To investigate the occurrence of aut oantibodies after using rhG-CSF in children with acute leukemia and their influ ence on serum G-CSF concentration.Methods Blood samples collected from 46 patients with acute leukemia and 104 normal children were meas ured with ELISA technique.Results Autoantibodies were det ected in 11 children with acute leukemia.Conclusions The occurrence of G-CSF autoantibodies have no significant relationship to rhG-CSF doses and courses,and have no influence on serum G-CSF concentration.Clinical application of rhG-CSF is safety.
, 百拇医药
Key words Autoantibodies G-CSF Leukemia
在儿童急性白血病化疗的辅助治疗中，应用最广泛的是重组粒细胞集落刺激因子(rhG- CSF)，并已成为常规的治疗手段。已知一些细胞因子(如IL-2、GM-CSF、INF等)应用于人 体可诱导自身抗体的产生[1]，我们既往的研究亦证实急性白血病患儿应用rhG-CS F的过程中可以诱导产生自身抗体。由于此诱导产生的主要是中和型抗体(IgG)，因此 我们试图探讨该自身抗体对G-CSF的某些影响作用，现报告如下。
对象与方法
一、研究对象与标本
1994～1998年在我院儿科住院治疗的46例急性白血病患儿，年龄1.5～15岁，平均9.4岁。 其中男32例，女14例。急性淋巴细胞白血病30例，急性髓性白血病14例，淋巴瘤细胞性 白血病2例。共收集到91份血清标本。患儿按常规方法接受大剂量的化疗[2]，其中 有38例患儿在化疗的不同时间接受G-CSF治疗。所选用的G-CSF制剂为真核细胞表达的人重 组产品(rhG-CSF)，每疗程用量为5μg/d，共用10～14天。平均每人应用rhG-CSF 2.64个疗程，用量为2 296μg。有8例患儿始终未应用rhG-CSF。在不同的治疗时间留取患儿的血 清标本，-70℃条件下冻存。将104例不同年龄的正常儿童的血清作为正常对照(年龄1～14 岁，平均8.6岁)。
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二、方法
1.ELISA检测rhG-CSF自身抗体：操作程序如下：200ng rhG-CSF直接包被于96孔酶标板(nu nc)上，加入1∶100稀释的被检血清100μl，37℃ 1小时；洗板、甩干后，加入辣根过氧化 酶标记的羊抗人IgG抗体100μl(1∶1 000稀释)，37℃ 30分钟。加酶显色底物各100μl，显 色5分钟后用2mol H2SO4终止显色反应。在酶标仪(denleywellscan)450nm下测定A 值。
2.ELISA方法测定血清G-CSF含量：应用双抗体夹心法(北京协和医院诊断试剂厂G-CSF酶联 免疫检测试剂盒)按说明书及文献进行操作，用酶标仪在450nm波长下检测A值。每一份 标本均检测两次，取其平均值进行分析研究。
G-CSF定量标准曲线的制作：将G-CSF标准品经系列稀释成不同浓度后按同上检测方法测定 。用不同浓度G-CSF标准品的对数值及所读出的A值，通过最小二乘法得出回归方程Y=0 .3436+0.7651X，r=0.996。G-CSF的检测敏感性(下限)为1ng/ml。
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结 果
一、ELISA方法检测G-CSF抗体的结果
对104例正常儿童血清标本的ELISA检测，其A值的均值为0.0694±0.0190，均值加上3 个标准差(P=0.99)值为0.126。我们选用A=0.130作为正常值的标准。根据这一 标准，正常的儿童组及8例未用过rhG-CSF的患儿均为阴性结果。在38例应用rhG-CSF的患 儿中，有11例患儿的31份不同时期的血清标本为抗体阳性，抗体稀释度为1∶200～1∶ 400之间。有6例患儿G-CSF抗体阳性发生在第一个疗程的rhG-CSF结束后，另5例患儿在多 个rhG-CSF疗程后G-CSF抗体成为阳性。
二、G-CSF抗体与血清G-CSF浓度的关系
在38例临床应用rhG-CSF的患儿中，有29例患儿的47份血清标本取自应用G-CSF期间或之 后的数天内。G-CSF浓度定量为5.335±5.597ng/ml，最低值为2.474ng/ml，最高值为 31.293ng/ml。在G-CSF抗体阳性的病例中，平均血清G-CSF浓度为8.019±9.861ng/ml ，而G-CSF抗体检测为阴性的病例中，平均血清G-CSF浓度为5.040±3.318ng/ml。统计学 分析两者之间无显著性差异(P>0.05)。
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三、G-CSF抗体与临床rhG-CSF用量的关系
在11例G-CSF抗体检测为阳性的患儿中，抗体阳性前平均rhG-CSF用量为2 800.00±2 673.52μg，平均疗程为3.00±2.30；而在G-CSF抗体检测为阴性的患儿中，平均rhG-CSF 用量为1 918.75±2 024.59μg，平均疗程为2.38±2.03。统计学分析证实，两者均无 显著性差异(P>0.05)。
讨 论
根据文献报道，应用细胞因子进行临床治疗时自身抗体的发生率为20%～30%[3] 。我们的研究中，患儿临床应用的rhG-CSF为真核细胞的表达产物，38例中有11例(28.9%) 自身抗体检测为阳性。鉴于有如此高比例的患儿在临床应用rhG-CSF的过程中可能发生自身 抗体，因此，进一步了解该自身抗体对血液G-CSF的影响是十分重要的。
, http://www.100md.com
根据我们的研究，在G-CSF自身抗体阴性和阳性的病例之间，抗体的产生与临床rhG-CSF的 用量及疗程无明确的关系，统计学分析无显著性差异。这一结果提示，G-CSF自身抗体的产 生可能更取决于患儿机体的免疫状态。
由于治疗诱导的G-CSF自身抗体的类型主要为IgG[4]，其本身具有中和抗体的特性 ，因此我们同时对患儿的G-CSF血清浓度进行了测定。结果发现在G-CSF抗体阴性组和阳性 组之间，血清G-CSF浓度值之间无显著性差异，提示G-CSF自身抗体可能并不显著地降低G -CSF血清浓度。
根据以上结果，如何来评价G-CSF自身抗体的临床意义呢?尽管有一些观点认为自身抗体可 抑制细胞因子的功能，产生负性的作用；但Bendtzen[5]却认为细胞因子抗体可能 具有有益的作用，例如其可以防止蛋白酶对细胞因子的降解，或减少其它细胞表面的特 异性受体与细胞因子的结合。抗体的这种作用的结果，应当是保持细胞因子体内浓度的稳定 。我们的研究结果与Bendtzen的观点相一致，其意义在于为临床大剂量、长 期反复地应用rhG-CSF提供了安全性方面的依据。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，Bendtzen K,Hansen MB,Ross C,et al.Cytokines and autoantibodies to cyt okines.Stem Cells,1995,13:206.
2，殷慧君.急性淋巴细胞白血病的化学治疗和急性髓性白血病的化学治疗.见：殷慧君主编 .小儿急性白血病化学治疗.北京：科学出版社.1996：55～90.
3，Bendtzen K,Hansen MB,Diamant M,et al，Naturally occurring autoantibodies to int， erleukin-la,interleukin-6,interleukin-10 and interferon-a，J Interferon Re s,1994,14:157，4，Svenson M,Hansen MB,Ross C,et al，Antibody to granulocyte-macrophage colony-s timulation factor is a dominant anticytokine activity in human IgG preparations， Blood,1998,91:2054，5，Bendtzen K,Svenson M,Jonsso V,et al，Autoantibodies to cytokines:friends or foe s? Immunol Today,1990,11:167，收稿：1999-01-18
修回：1999-08-12, 百拇医药