应用流式细胞术检测胃癌P53蛋白的表达水平
作者：管增伟 徐妙生 焦建峰 王起恩
单位：管增伟(北京医科大学分析中心 邮政编码100083)；徐妙生(北京医科大学放射医学基础教研室)；焦建峰(北京天坛医院病理科)；王起恩(北京医科大学公卫学院劳卫教研室)
关键词：
北京医学000317 P53蛋白在肿瘤组织中的表达水平及其与肿瘤分化、浸润、转移 以及预后的关系是近年来肿瘤研究领域的热点之一。我们应用流式细胞术检测胃癌组织P53 蛋白的表达水平，探讨其与胃癌发病的关系。
材料与方法
组织标本由北京天坛医院病理科提供，胃癌16例，不典型增生11例，肠上皮化生10例，浅表 性胃炎13例，正常胃粘膜10例。P53单克隆抗体pAb1801购于美国Ocogene Sci Inc。二抗为 荧光标记的羊抗小鼠抗体IgG-FITC，购于军事医学科学院微生物研究所(批号9109)。
, 百拇医药
1.单细胞悬液的制备：将石蜡组织块用切片机切成45μm厚的组织4～5片，加二甲苯5ml，室 温下脱蜡2天，期间更换3次，以充分脱蜡。然后，依次用95%、75%、50%梯度酒精水化，每 步10分钟，最后，用蒸馏水漂洗。捣碎组织片，加入0.5%胃蛋白酶(pH 1.5)，置37℃温箱 内消化30分钟，每隔10分钟摇动一次，消化结束后加生理盐水终止消化，用400目尼龙网过 滤，滤液用生理盐水漂洗，1 000rpm离心5分钟，弃上清，加75%酒精固定，置4℃冰箱中备 检。
2.P53蛋白的免疫荧光染色：将所制备的单细胞悬液用PBS以1 000rpm离心2分钟，洗涤2次， 弃上清，加1∶100稀释的鼠抗人P53蛋白单克隆抗体100μl，37℃水浴30分钟，用PBS离心2 次，弃上清液，加1∶20稀释的羊抗鼠IgG-FITC 100μl，37℃水浴30分钟，离心洗涤2次， 去上清，除去未结合荧光抗体，调整细胞数为1×106/ml，上机检测。
, 百拇医药 3.流式细胞仪检测：流式细胞仪为FACSCan (Becton Dickison)。所测数据用Lysys Ⅱ软件 处理。
4.测量数据的分析：以DNA指数值(DI)作为判断DNA倍体的标准，DI=1.0±2CV为二倍体肿 瘤，DI≠1.0±2CV为异倍体肿瘤。用cell Fit软件处理得DNA组方图各期百分比，以增殖指 数(PI)表示细胞增殖活性。以荧光指数(FI)表示P53的相对含量，公式为：FI=(瘤细胞P53平 均荧光强度-对照组平均荧光强度)/正常胃粘膜细胞P53平均荧光强度，如FI>1.0为P53阳 性，FI<1.0为阴性。
5.统计学处理：用方差分析及t检验进行统计学分析。
结 果
1.各组FI值：见表1。
2.不同病变DNA倍体分布：见表2。
, 百拇医药
3.不典型增生及胃癌的增殖活性及DNA倍体与P53蛋白表达的关系：见表3。
表1 胃癌及癌前病变P53蛋白的FI值(
±s) 组织
例数
FI值
正常胃粘膜
10
0.602±0.077
浅表性胃炎
13
0.898±0.052
, 百拇医药
肠上皮化生
10
1.050±0.074*
不典型增生
11
1.143±0.060*△
轻
4
0.924±0.068
中
3
1.152±0.092
, 百拇医药
重
4
1.501±0.096
胃 癌
16
1.866±0.096*▲#△
与正常胃粘膜组比较 * P<0.05；与浅表性胃炎组比较△ P<0.05 ；与肠上皮化生组比较▲ P<0.05；与不典型增生组比较# P<0.05表2 不同病变DNA倍体情况 组织
例数
二倍体
异倍体
, 百拇医药 异倍体率(%)
正常胃粘膜
10
10
0
0
浅表性胃炎
13
13
0
0
肠上皮化生
10
10
, 百拇医药
0
0
不典型增生
11
8
3
27.2*△▲
轻
4
4
0
中
3
, 百拇医药 2
1
重
4
2
2
胃 癌
16
0
16
100*△▲
与正常胃粘膜组比较* P<0.05；与浅表性胃炎组比较△ P<0.05；与肠上皮化生组比较▲ P<0.05；与不典型增生组比较# P<0.05表3 不典型增生及胃癌DNA倍体与P53蛋白表达的关系 (±s) DNA倍体
, http://www.100md.com
例数
PI
FI
P53阳性例数(%)
二倍体
8
12.08±1.11
1.134±0.142
2(25)
异倍体
19
25.02±6.89*
, 百拇医药
1.883±0.202*
13(68.4)*
*与二倍体比较 P<0.05 讨 论
P53是一种很独特的基因，正常时是一个肿瘤抑制基因，突变后则是一个典型的显性癌基因 。研究表明，突变体P53基因产生的P53蛋白与肿瘤的发生有关。我们应用流式细胞术检测胃 癌，癌前病变及胃炎病理组织中P53蛋白的表达水平，结果表明，胃癌及癌前病变P53蛋白的 表达水平明显高于正常胃粘膜及浅表性胃炎，胃癌高于不典型增生及肠上皮化生，均有显著 性差异(P<0.05)。同时可以看到，P53蛋白的表达水平从肠上皮化生、不典型增生到 胃癌呈递增趋势。在异倍体标本中，P53蛋白阳性为68.4%，二倍体标本P53蛋白阳性率为25 %，二者有 显著性差异(P<0.05)。从增殖活性看，异倍体标本与二倍体标本的PI值有 显著性差异(P<0.05)。有学者应用免疫组化技术研究发现胃癌P53蛋白阳性率为61%， 重度不典型增生P53蛋白阳性率为20%，还有文献报道不典型增生及胃癌P53蛋白阳性率均为6 0%。我们的结果为不典型增生P53蛋白阳性率为27%，胃癌为68%。关于阳性率的差异可能与 检测方法不同有关，但我们的结果和报道资料都表明胃癌P53蛋白的表达水平增高。因此，P 53蛋白过度表达可能与胃的发病有关，检测P53蛋白的表达水平对胃癌的诊断可能有一定的 价值。关于癌前病变P53蛋白的表达水平及其意义有待进一步探讨。
收稿：1999-04-12
修回：1999-11-08, 百拇医药
单位：管增伟(北京医科大学分析中心 邮政编码100083)；徐妙生(北京医科大学放射医学基础教研室)；焦建峰(北京天坛医院病理科)；王起恩(北京医科大学公卫学院劳卫教研室)
关键词：
北京医学000317 P53蛋白在肿瘤组织中的表达水平及其与肿瘤分化、浸润、转移 以及预后的关系是近年来肿瘤研究领域的热点之一。我们应用流式细胞术检测胃癌组织P53 蛋白的表达水平，探讨其与胃癌发病的关系。
材料与方法
组织标本由北京天坛医院病理科提供，胃癌16例，不典型增生11例，肠上皮化生10例，浅表 性胃炎13例，正常胃粘膜10例。P53单克隆抗体pAb1801购于美国Ocogene Sci Inc。二抗为 荧光标记的羊抗小鼠抗体IgG-FITC，购于军事医学科学院微生物研究所(批号9109)。
, 百拇医药
1.单细胞悬液的制备：将石蜡组织块用切片机切成45μm厚的组织4～5片，加二甲苯5ml，室 温下脱蜡2天，期间更换3次，以充分脱蜡。然后，依次用95%、75%、50%梯度酒精水化，每 步10分钟，最后，用蒸馏水漂洗。捣碎组织片，加入0.5%胃蛋白酶(pH 1.5)，置37℃温箱 内消化30分钟，每隔10分钟摇动一次，消化结束后加生理盐水终止消化，用400目尼龙网过 滤，滤液用生理盐水漂洗，1 000rpm离心5分钟，弃上清，加75%酒精固定，置4℃冰箱中备 检。
2.P53蛋白的免疫荧光染色：将所制备的单细胞悬液用PBS以1 000rpm离心2分钟，洗涤2次， 弃上清，加1∶100稀释的鼠抗人P53蛋白单克隆抗体100μl，37℃水浴30分钟，用PBS离心2 次，弃上清液，加1∶20稀释的羊抗鼠IgG-FITC 100μl，37℃水浴30分钟，离心洗涤2次， 去上清，除去未结合荧光抗体，调整细胞数为1×106/ml，上机检测。
, 百拇医药 3.流式细胞仪检测：流式细胞仪为FACSCan (Becton Dickison)。所测数据用Lysys Ⅱ软件 处理。
4.测量数据的分析：以DNA指数值(DI)作为判断DNA倍体的标准，DI=1.0±2CV为二倍体肿 瘤，DI≠1.0±2CV为异倍体肿瘤。用cell Fit软件处理得DNA组方图各期百分比，以增殖指 数(PI)表示细胞增殖活性。以荧光指数(FI)表示P53的相对含量，公式为：FI=(瘤细胞P53平 均荧光强度-对照组平均荧光强度)/正常胃粘膜细胞P53平均荧光强度，如FI>1.0为P53阳 性，FI<1.0为阴性。
5.统计学处理：用方差分析及t检验进行统计学分析。
结 果
1.各组FI值：见表1。
2.不同病变DNA倍体分布：见表2。
, 百拇医药
3.不典型增生及胃癌的增殖活性及DNA倍体与P53蛋白表达的关系：见表3。
表1 胃癌及癌前病变P53蛋白的FI值(
±s) 组织例数
FI值
正常胃粘膜
10
0.602±0.077
浅表性胃炎
13
0.898±0.052
, 百拇医药
肠上皮化生
10
1.050±0.074*
不典型增生
11
1.143±0.060*△
轻
4
0.924±0.068
中
3
1.152±0.092
, 百拇医药
重
4
1.501±0.096
胃 癌
16
1.866±0.096*▲#△
与正常胃粘膜组比较 * P<0.05；与浅表性胃炎组比较△ P<0.05 ；与肠上皮化生组比较▲ P<0.05；与不典型增生组比较# P<0.05表2 不同病变DNA倍体情况 组织
例数
二倍体
异倍体
, 百拇医药 异倍体率(%)
正常胃粘膜
10
10
0
0
浅表性胃炎
13
13
0
0
肠上皮化生
10
10
, 百拇医药
0
0
不典型增生
11
8
3
27.2*△▲
轻
4
4
0
中
3
, 百拇医药 2
1
重
4
2
2
胃 癌
16
0
16
100*△▲
与正常胃粘膜组比较* P<0.05；与浅表性胃炎组比较△ P<0.05；与肠上皮化生组比较▲ P<0.05；与不典型增生组比较# P<0.05表3 不典型增生及胃癌DNA倍体与P53蛋白表达的关系 (
±s) DNA倍体, http://www.100md.com
例数
PI
FI
P53阳性例数(%)
二倍体
8
12.08±1.11
1.134±0.142
2(25)
异倍体
19
25.02±6.89*
, 百拇医药
1.883±0.202*
13(68.4)*
*与二倍体比较 P<0.05 讨 论
P53是一种很独特的基因，正常时是一个肿瘤抑制基因，突变后则是一个典型的显性癌基因 。研究表明，突变体P53基因产生的P53蛋白与肿瘤的发生有关。我们应用流式细胞术检测胃 癌，癌前病变及胃炎病理组织中P53蛋白的表达水平，结果表明，胃癌及癌前病变P53蛋白的 表达水平明显高于正常胃粘膜及浅表性胃炎，胃癌高于不典型增生及肠上皮化生，均有显著 性差异(P<0.05)。同时可以看到，P53蛋白的表达水平从肠上皮化生、不典型增生到 胃癌呈递增趋势。在异倍体标本中，P53蛋白阳性为68.4%，二倍体标本P53蛋白阳性率为25 %，二者有 显著性差异(P<0.05)。从增殖活性看，异倍体标本与二倍体标本的PI值有 显著性差异(P<0.05)。有学者应用免疫组化技术研究发现胃癌P53蛋白阳性率为61%， 重度不典型增生P53蛋白阳性率为20%，还有文献报道不典型增生及胃癌P53蛋白阳性率均为6 0%。我们的结果为不典型增生P53蛋白阳性率为27%，胃癌为68%。关于阳性率的差异可能与 检测方法不同有关，但我们的结果和报道资料都表明胃癌P53蛋白的表达水平增高。因此，P 53蛋白过度表达可能与胃的发病有关，检测P53蛋白的表达水平对胃癌的诊断可能有一定的 价值。关于癌前病变P53蛋白的表达水平及其意义有待进一步探讨。
收稿：1999-04-12
修回：1999-11-08, 百拇医药