体外培养诱导人肝脏星形细胞表型激活及其鉴定
作者：朱永红 胡大荣 聂青和 刘国栋
单位：朱永红(第三军医大学附属西南医院感染病科、全军传染病专科中心，重庆 400038)；刘国栋(第三军医大学附属西南医院感染病科、全军传染病专科中心，重庆 400038)；胡大荣(北京军区总医院全军肝病研究所，北京 100700)；聂青和(第四军医大学唐都医院感染病科，西安 710038)
关键词：人肝脏星形细胞；细胞培养；细胞表型
第三军医大学学报000310
提 要 目的：观察常规培养条件下正常人肝脏星形细胞(HSCs)表型激活并对其进行鉴定。方法：由正常人肝脏中分离HSCs，在未包被的玻璃及塑料培养支持物上，以常规的含小牛血清的DMEM培养，相差显微镜下观察培养过程中细胞形态改变，荧光显微镜下观察维生素A自发荧光，免疫细胞化学染色观察α-SMA、Ⅰ型胶原、FN及PCNA改变。结果：正常人HSCs未包被的玻璃及塑料培养支持物上培养时，其表型由刚分离时及原代培养初期的静息型转变为原代培养后期及传代后的激活型。激活的人HSCs呈现典型的成纤维细胞样形态，胞质中无明显脂滴，维生素A自发荧光明显减弱或消失，同时明显表达α-SMA、Ⅰ型胶原、FN及PCNA。结论：体外常规培养可诱导人HSCs激活，激活的人HSCs具有典型的形态及功能特点。
, 百拇医药
中图法分类号 R322.47;R329.2 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(2000)03-0235-04
In vitro cultureinduced activation of human hepatic satellite cells and characterization of activated phenotype
ZHU Yong-hong, HU Da-rong, NIE Qin-he, LIU Guo-Dong
(Department of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038,China)
, http://www.100md.com
Abstract Objective: To induce activation of normal human hepatic satellite cells (HSCs) by in vitro culture and characterize the activated phenotype. Methods: HSCs were isolated from normal human liver and cultured on uncoated plastic and glass materials in DMEM containing bovine serum. HSCs were observed with phasecontrast and fluroscence microscopy at various intervals in primary and secondary cultures. α-smooth muscle actin (α-SMA), type I collagen, fibronectin (FN) and PCNA expression in the cells were detected with immunohistochemistry. Results: Freshly isolated HSCs during early days of primary culture maintained a quiescent phenotype. During late days of primary culture or after subculture, HSCs assumed an activated phenotype. Activated HSCs were characterized by a typical fibroblastlike morphology under the phasecontrast microscope, a decrease or loss in fat droplets and vitamin A autofluroscence, and increase or obvious positive immunohistochemical staining for α-SMA, type I collagen, FN and PCNA. Conclusion: Routine in vitro culture on uncoated plastic or glass in DMEM containing bovine serum could induce phenotype activation of normal human HSCs and this activation was associated with characteristic morphological and functional changes.
, http://www.100md.com
Key words human hepatic satellite cell; culture; phenotype; characterization
肝脏星形细胞(Hepatic satellite cells,HSCs)的体外培养研究对于阐明肝纤维化发生机制及体外筛选抗肝纤维化药物均具有十分重要的意义[1]。自1992年Friedman等[2]分离培养人HSCs成功以来，国内尚未见这方面的研究报道。我们在成功分离培养人HSCs的基础上[3]，体外培养诱导人HSCs表型激活并对其进行了鉴定，为进一步开展人HSCs表型激活调控机制的研究打下了良好基础。
1 材料与方法
1.1 肝脏标本来源
来源于非肝病死亡之成人肝脏。将所获肝脏标本置于DMEM培养液中保存待用，于2 h内进行HSCs的分离培养。所取肝脏标本均经组织学HE染色证实肝组织结构正常。
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1.2 主要试剂
链霉蛋白酶(活性4 U/mg)、Ⅳ型胶原酶(活性512 U/mg)及DNA酶Ⅰ(活性20000 U/mg)均为美国Sigma公司产品；DMEM为Gibco公司产品；胰蛋白酶(活性1∶250)为进口试剂分装；小牛血清为第三军医大学分子生物学教研室产品；淋巴细胞分离液为上海试剂二厂产品，用D-Hanks液调整密度为1.050备用；前灌流液、酶配制液及D-Hanks液均按文献方法配制。鼠抗人Ⅰ型胶原单克隆抗体、鼠抗人纤维连接蛋白(FN)单克隆抗体及鼠抗人增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体均为北京中山生物技术公司产品；鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)单克隆抗体及SP免疫组化试剂盒为福建迈新生物技术开发公司产品。
1.3 HSCs的分离及培养
HSCs的分离、培养及鉴定参照文献[3]的方法。刚分离的HSCs纯度85%以上，活力96%以上，24 h内经2次换液后纯度达95%以上。将细胞悬浮在含20%小牛血清的DMEM内，调整细胞浓度为2×105个/ml，接种于塑料培养瓶及含盖玻片的塑料培养板中，在37°C、5%CO2培养箱中培养，12 h后进行第1次换液，24 h后更换为含10%小牛血清的DMEM培养液，以后每2～3 d换液1次，当细胞铺满瓶底时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，以2×105个/ml浓度接种。在原代及传代培养时，均于培养板孔中加入干净的盖玻片，常规制备原代培养第1天、第5天、第10天、传1代第3天及传5代第3天的细胞铺展开。
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1.4 培养细胞形态学观察
在细胞培养不同时间，于倒置显微镜下动态观察细胞生长变化情况。
1.5 维生素A自发荧光观察
将不同培养时间的细胞铺展片置于荧光显微镜下观察维生素A自发荧光，紫外线激发波长为328 nm。
1.6 免疫细胞化学染色
将刚分离的细胞悬液涂片及不同培养时间的细胞铺展片用4%多聚甲醛固定10 min后，进行α-SMA、Ⅰ型胶原、FN及PCNA免疫细胞化学染色，采用SP法，DAB显色，并以PBS替代一抗设置阴性对照。
2 结果
2.1 形态学观察
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刚分离得到的HSCs在相差显微镜下为折光性很强的圆球，远小于肝细胞，接种后12 h，细胞即贴壁，少量细胞开始伸展，48 h后大部分细胞伸展，一部分细胞出现多角突起，呈现星状外形，胞质中脂滴明显。培养至第10天时，细胞接近铺满，胞质中脂滴不明显，面积明显增大，细胞呈典型的成纤维细胞样形态。传代后细胞保持典型的成纤维细胞样形态不变。
2.2 激发荧光试验
原代培养48 h的HSCs在波长为328 nm的紫外光激发下，呈现蓝绿色自发荧光，但极易淬灭，经过培养后，其自发荧光逐渐减弱，传代后荧光几乎消失。
2.3 α-SMA免疫细胞化学染色
刚分离的及原代培养第1天的人HSCs其α-SMA免疫细胞化学染色均为阴性，原代培养第5天时，有部分细胞α-SMA表达阳性，原代培养第10天时，α-SMA染色阳性细胞接近100%，见图1。传代后α-SMA染色均为阳性，染色特点与原代培养第10天时相似。
, 百拇医药
图1 原代培养10 d的正常人HSCs的α-SMA免疫细胞
化学染色 (S-P×250)
Fig 1 Immunocytochemical staining of α-SMA
in normal human HSCs in primary culture
for 10 days (S-P×250)
2.4 Ⅰ型胶原及FN免疫细胞化学染色
原代培养24 h的HSCs铺展片Ⅰ型胶原染色阴性，FN染色很弱，培养第10天时，Ⅰ型胶原及FN染色均为明显阳性，见图2、3。传代后其染色特点与原代培养第10天时差别不明显。
, 百拇医药
图2 原代培养10 d的正常人HSCs的Ⅰ型胶原免疫
细胞化学染色 (S-P×250)
Fig 2 Immunocytochemical staining of type Ⅰ collagen
in normal human HSCs in primary culture for
10 days (S-P×250)
图3 原代培养10 d的正常人HSCs的FN免疫细胞
化学染色 (S-P×250)
Fig 3 Immunocytochemical staining of FN in
, 百拇医药
normal human HSCs in primary culture
for 10 days (S-P×250)
2.5 PCNA免疫细胞化学染色
刚分离的HSCs未见明显的PCNA核表达，原代培养24 h后即可见较明显的PCNA核表达，原代培养第10天时可见明显的PCNA核表达。传代细胞的PCNA染色与原代培养第10天时无明显区别。
3 讨论
目前，采用体外培养方法对HSCs的生物学特点、激活机制、凋亡特性及针对HSCs激活的抗肝纤维化药物研究已成为肝纤维化发生机制及抗肝纤维化药物研究中的热点[4]。在进行HSCs的体外培养研究时，常常需要对HSCs的表型状态，尤其是培养过程中HSCs表型的变化进行鉴定，以此来确定各种不同因素对HSCs表型变化的影响，以及观察各种信号转导通路在HSCs表型变化中所起的作用。在体外培养过程中，由于生长环境的改变，HSCs的表型由刚分离时的静息型转变为培养后期的激活型或分泌型，这种表型的转变类似于肝纤维化形成过程中HSCs表型的变化。因此，体外培养的HSCs可以作为研究HSCs表型分化调控机制、筛选抗肝纤维化药物及研究药物作用机制的理想细胞模型[5]。HSCs被激活后，其形态和功能发生明显改变，此时细胞对各种外界因素的反应性也发生改变，因此，在评价某一因素对HSCs的作用时，也需对HSCs的表型状态作出准确鉴定[1]。
, 百拇医药
诱导HSCs表型激活的因素很多[6]。研究发现，在含10%小牛血清的培养液中，HSCs的表型自发地由刚分离时及原代培养早期的静息型转变为培养后期及传代后的激活型。HSCs的这种自发激活，可能系培养液血清中所含的多种生长因子或细胞因子综合作用的结果，也可能与其整个生长环境的改变有关。由于在肝纤维化形成过程中HSCs的体内激活系多种因素共同作用的结果，这种常规培养条件下HSCs的激活可能比单一因素(如单一细胞因子)诱导的激活更接近体内HSCs的激活过程。
一般认为，HSCs激活的两个最主要标志是：1细胞中出现α-SMA的表达；2胞质中维生素A脂滴减少或消失[1]。此外，HSCs在激活后还呈现非常显著的形态学及功能改变，如典型的成纤维细胞样形态特征、合成各种ECM成分(尤其是Ⅰ型胶原)的能力及增殖能力明显增强等[4]。我们对正常人HSCs的表型变化进行检测发现，在原代培养早期，α-SMA表达阴性，胞质中含有较多的脂滴且呈现较强的维生素A自发荧光，此时细胞表达Ⅰ型胶原及FN很少或阴性；随着培养时间的延长，HSCs表达α-SMA增多，胞质中脂滴及维生素A自发荧光逐渐减少，其表达Ⅰ型胶在及FN逐渐增多，同时细胞逐渐呈现出成纤维细胞样形态特征。到原代培养第10天时，细胞呈现典型的成纤维细胞样形态，胞质中维生素A自发荧光明显减弱，α-SMA、Ⅰ型胶原及FN表达明显阳性，提示HSCs此时已被激活。对传1代及传5代的HSCs进行检测发现，其形态及功能特点与原代培养第10天时无明显差别，提示HSCs在传代后持续处于激活状态。因此，刚分离的及原代培养初期的正常人HSCs可视为静息的HSCs，原代培养第10天以后及传代的人HSCs可视为激活的HSCs。
, 百拇医药
PCNA是反映细胞增殖潜力的一种核抗原，它对细胞由G1期向S期过渡起着重要的调节作用。处于增殖状态的细胞和肿瘤细胞，PCNA的表达明显增强，其在细胞中表达的多少(或强弱)可反映该细胞增殖能力的大小。对原代培养初期及后期的人HSCs进行PCNA免疫细胞化学染色，发现原代培养初期的人HSCs即呈现较明显的PCNA表达，原代培养后期及传代的人HSCs其PCNA表达明显增强，提示原代培养后期及传代后HSCs的增殖能力增强，这也是HSCs激活后所呈现的重要生物学特性之一。体外培养的人HSCs能连续传代达10代以上，也说明人HSCs也具有很强的增殖能力。但随着传代次数的增加，HSCs的增殖能力逐渐减弱，出现这一现象的原因尚不清楚。
作者简介：朱永红(1966.2)，男，湖北省荆门市人，博士，讲师， 主要从事肝纤维化发生机制方面的研究，发表论文10篇。
参考文献
[1] Bachem M G, Meyer D, Schafer W, et al. The response of rat liver perisinusoidal lipocytes to polypeptide growth regulator changes with their transdifferentiation into myofibroblastlike cells in culture[J]. J Hepatol,1993,18(1):40-52.
, 百拇医药
[2] Friedman S L, Rockey D C, McGuire R F, et al. Isolated hepatic lipocytes and Kupffer cells from normal human liver:Morphological and functional characteristics in primary culture[J]. Hepatology,1992,15(2):234-243.
[3] 朱永红， 胡大荣， 谢 青， 等. 正常人肝脏星形细胞的分离、培养及鉴定[J].细胞生物学杂志，1999，21(3)：插页.
[4] Olaso E, Friedman S L. Molecular regulation of hepatic fibrogenesis[J]. J Hepatol,1998,29(5):836-847.
, http://www.100md.com
[5] Kawada N, Kuroki T, Kobayashi K, et al. Inhibition of myofibroblast transformation of cultured rat hepatic satellite cells by methylxanthines and dibutyryl cAMP[J]. Dig Dis Sci,1996,41(5):1022-1029.
[6] Gressner A M, Bachem M G. Molecular mechanisms of liver fibrogenesis: A homage to the role of activated fatstoring cells[J]. Digestion,1995,56(5):335-346.
收稿日期：1999-09-16；修回日期：1999-12-21, http://www.100md.com
单位：朱永红(第三军医大学附属西南医院感染病科、全军传染病专科中心，重庆 400038)；刘国栋(第三军医大学附属西南医院感染病科、全军传染病专科中心，重庆 400038)；胡大荣(北京军区总医院全军肝病研究所，北京 100700)；聂青和(第四军医大学唐都医院感染病科，西安 710038)
关键词：人肝脏星形细胞；细胞培养；细胞表型
第三军医大学学报000310
提 要 目的：观察常规培养条件下正常人肝脏星形细胞(HSCs)表型激活并对其进行鉴定。方法：由正常人肝脏中分离HSCs，在未包被的玻璃及塑料培养支持物上，以常规的含小牛血清的DMEM培养，相差显微镜下观察培养过程中细胞形态改变，荧光显微镜下观察维生素A自发荧光，免疫细胞化学染色观察α-SMA、Ⅰ型胶原、FN及PCNA改变。结果：正常人HSCs未包被的玻璃及塑料培养支持物上培养时，其表型由刚分离时及原代培养初期的静息型转变为原代培养后期及传代后的激活型。激活的人HSCs呈现典型的成纤维细胞样形态，胞质中无明显脂滴，维生素A自发荧光明显减弱或消失，同时明显表达α-SMA、Ⅰ型胶原、FN及PCNA。结论：体外常规培养可诱导人HSCs激活，激活的人HSCs具有典型的形态及功能特点。
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中图法分类号 R322.47;R329.2 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(2000)03-0235-04
In vitro cultureinduced activation of human hepatic satellite cells and characterization of activated phenotype
ZHU Yong-hong, HU Da-rong, NIE Qin-he, LIU Guo-Dong
(Department of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038,China)
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Abstract Objective: To induce activation of normal human hepatic satellite cells (HSCs) by in vitro culture and characterize the activated phenotype. Methods: HSCs were isolated from normal human liver and cultured on uncoated plastic and glass materials in DMEM containing bovine serum. HSCs were observed with phasecontrast and fluroscence microscopy at various intervals in primary and secondary cultures. α-smooth muscle actin (α-SMA), type I collagen, fibronectin (FN) and PCNA expression in the cells were detected with immunohistochemistry. Results: Freshly isolated HSCs during early days of primary culture maintained a quiescent phenotype. During late days of primary culture or after subculture, HSCs assumed an activated phenotype. Activated HSCs were characterized by a typical fibroblastlike morphology under the phasecontrast microscope, a decrease or loss in fat droplets and vitamin A autofluroscence, and increase or obvious positive immunohistochemical staining for α-SMA, type I collagen, FN and PCNA. Conclusion: Routine in vitro culture on uncoated plastic or glass in DMEM containing bovine serum could induce phenotype activation of normal human HSCs and this activation was associated with characteristic morphological and functional changes.
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Key words human hepatic satellite cell; culture; phenotype; characterization
肝脏星形细胞(Hepatic satellite cells,HSCs)的体外培养研究对于阐明肝纤维化发生机制及体外筛选抗肝纤维化药物均具有十分重要的意义[1]。自1992年Friedman等[2]分离培养人HSCs成功以来，国内尚未见这方面的研究报道。我们在成功分离培养人HSCs的基础上[3]，体外培养诱导人HSCs表型激活并对其进行了鉴定，为进一步开展人HSCs表型激活调控机制的研究打下了良好基础。
1 材料与方法
1.1 肝脏标本来源
来源于非肝病死亡之成人肝脏。将所获肝脏标本置于DMEM培养液中保存待用，于2 h内进行HSCs的分离培养。所取肝脏标本均经组织学HE染色证实肝组织结构正常。
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1.2 主要试剂
链霉蛋白酶(活性4 U/mg)、Ⅳ型胶原酶(活性512 U/mg)及DNA酶Ⅰ(活性20000 U/mg)均为美国Sigma公司产品；DMEM为Gibco公司产品；胰蛋白酶(活性1∶250)为进口试剂分装；小牛血清为第三军医大学分子生物学教研室产品；淋巴细胞分离液为上海试剂二厂产品，用D-Hanks液调整密度为1.050备用；前灌流液、酶配制液及D-Hanks液均按文献方法配制。鼠抗人Ⅰ型胶原单克隆抗体、鼠抗人纤维连接蛋白(FN)单克隆抗体及鼠抗人增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体均为北京中山生物技术公司产品；鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)单克隆抗体及SP免疫组化试剂盒为福建迈新生物技术开发公司产品。
1.3 HSCs的分离及培养
HSCs的分离、培养及鉴定参照文献[3]的方法。刚分离的HSCs纯度85%以上，活力96%以上，24 h内经2次换液后纯度达95%以上。将细胞悬浮在含20%小牛血清的DMEM内，调整细胞浓度为2×105个/ml，接种于塑料培养瓶及含盖玻片的塑料培养板中，在37°C、5%CO2培养箱中培养，12 h后进行第1次换液，24 h后更换为含10%小牛血清的DMEM培养液，以后每2～3 d换液1次，当细胞铺满瓶底时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，以2×105个/ml浓度接种。在原代及传代培养时，均于培养板孔中加入干净的盖玻片，常规制备原代培养第1天、第5天、第10天、传1代第3天及传5代第3天的细胞铺展开。
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1.4 培养细胞形态学观察
在细胞培养不同时间，于倒置显微镜下动态观察细胞生长变化情况。
1.5 维生素A自发荧光观察
将不同培养时间的细胞铺展片置于荧光显微镜下观察维生素A自发荧光，紫外线激发波长为328 nm。
1.6 免疫细胞化学染色
将刚分离的细胞悬液涂片及不同培养时间的细胞铺展片用4%多聚甲醛固定10 min后，进行α-SMA、Ⅰ型胶原、FN及PCNA免疫细胞化学染色，采用SP法，DAB显色，并以PBS替代一抗设置阴性对照。
2 结果
2.1 形态学观察
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刚分离得到的HSCs在相差显微镜下为折光性很强的圆球，远小于肝细胞，接种后12 h，细胞即贴壁，少量细胞开始伸展，48 h后大部分细胞伸展，一部分细胞出现多角突起，呈现星状外形，胞质中脂滴明显。培养至第10天时，细胞接近铺满，胞质中脂滴不明显，面积明显增大，细胞呈典型的成纤维细胞样形态。传代后细胞保持典型的成纤维细胞样形态不变。
2.2 激发荧光试验
原代培养48 h的HSCs在波长为328 nm的紫外光激发下，呈现蓝绿色自发荧光，但极易淬灭，经过培养后，其自发荧光逐渐减弱，传代后荧光几乎消失。
2.3 α-SMA免疫细胞化学染色
刚分离的及原代培养第1天的人HSCs其α-SMA免疫细胞化学染色均为阴性，原代培养第5天时，有部分细胞α-SMA表达阳性，原代培养第10天时，α-SMA染色阳性细胞接近100%，见图1。传代后α-SMA染色均为阳性，染色特点与原代培养第10天时相似。
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图1 原代培养10 d的正常人HSCs的α-SMA免疫细胞
化学染色 (S-P×250)
Fig 1 Immunocytochemical staining of α-SMA
in normal human HSCs in primary culture
for 10 days (S-P×250)
2.4 Ⅰ型胶原及FN免疫细胞化学染色
原代培养24 h的HSCs铺展片Ⅰ型胶原染色阴性，FN染色很弱，培养第10天时，Ⅰ型胶原及FN染色均为明显阳性，见图2、3。传代后其染色特点与原代培养第10天时差别不明显。
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图2 原代培养10 d的正常人HSCs的Ⅰ型胶原免疫
细胞化学染色 (S-P×250)
Fig 2 Immunocytochemical staining of type Ⅰ collagen
in normal human HSCs in primary culture for
10 days (S-P×250)
图3 原代培养10 d的正常人HSCs的FN免疫细胞
化学染色 (S-P×250)
Fig 3 Immunocytochemical staining of FN in
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for 10 days (S-P×250)
2.5 PCNA免疫细胞化学染色
刚分离的HSCs未见明显的PCNA核表达，原代培养24 h后即可见较明显的PCNA核表达，原代培养第10天时可见明显的PCNA核表达。传代细胞的PCNA染色与原代培养第10天时无明显区别。
3 讨论
目前，采用体外培养方法对HSCs的生物学特点、激活机制、凋亡特性及针对HSCs激活的抗肝纤维化药物研究已成为肝纤维化发生机制及抗肝纤维化药物研究中的热点[4]。在进行HSCs的体外培养研究时，常常需要对HSCs的表型状态，尤其是培养过程中HSCs表型的变化进行鉴定，以此来确定各种不同因素对HSCs表型变化的影响，以及观察各种信号转导通路在HSCs表型变化中所起的作用。在体外培养过程中，由于生长环境的改变，HSCs的表型由刚分离时的静息型转变为培养后期的激活型或分泌型，这种表型的转变类似于肝纤维化形成过程中HSCs表型的变化。因此，体外培养的HSCs可以作为研究HSCs表型分化调控机制、筛选抗肝纤维化药物及研究药物作用机制的理想细胞模型[5]。HSCs被激活后，其形态和功能发生明显改变，此时细胞对各种外界因素的反应性也发生改变，因此，在评价某一因素对HSCs的作用时，也需对HSCs的表型状态作出准确鉴定[1]。
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诱导HSCs表型激活的因素很多[6]。研究发现，在含10%小牛血清的培养液中，HSCs的表型自发地由刚分离时及原代培养早期的静息型转变为培养后期及传代后的激活型。HSCs的这种自发激活，可能系培养液血清中所含的多种生长因子或细胞因子综合作用的结果，也可能与其整个生长环境的改变有关。由于在肝纤维化形成过程中HSCs的体内激活系多种因素共同作用的结果，这种常规培养条件下HSCs的激活可能比单一因素(如单一细胞因子)诱导的激活更接近体内HSCs的激活过程。
一般认为，HSCs激活的两个最主要标志是：1细胞中出现α-SMA的表达；2胞质中维生素A脂滴减少或消失[1]。此外，HSCs在激活后还呈现非常显著的形态学及功能改变，如典型的成纤维细胞样形态特征、合成各种ECM成分(尤其是Ⅰ型胶原)的能力及增殖能力明显增强等[4]。我们对正常人HSCs的表型变化进行检测发现，在原代培养早期，α-SMA表达阴性，胞质中含有较多的脂滴且呈现较强的维生素A自发荧光，此时细胞表达Ⅰ型胶原及FN很少或阴性；随着培养时间的延长，HSCs表达α-SMA增多，胞质中脂滴及维生素A自发荧光逐渐减少，其表达Ⅰ型胶在及FN逐渐增多，同时细胞逐渐呈现出成纤维细胞样形态特征。到原代培养第10天时，细胞呈现典型的成纤维细胞样形态，胞质中维生素A自发荧光明显减弱，α-SMA、Ⅰ型胶原及FN表达明显阳性，提示HSCs此时已被激活。对传1代及传5代的HSCs进行检测发现，其形态及功能特点与原代培养第10天时无明显差别，提示HSCs在传代后持续处于激活状态。因此，刚分离的及原代培养初期的正常人HSCs可视为静息的HSCs，原代培养第10天以后及传代的人HSCs可视为激活的HSCs。
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PCNA是反映细胞增殖潜力的一种核抗原，它对细胞由G1期向S期过渡起着重要的调节作用。处于增殖状态的细胞和肿瘤细胞，PCNA的表达明显增强，其在细胞中表达的多少(或强弱)可反映该细胞增殖能力的大小。对原代培养初期及后期的人HSCs进行PCNA免疫细胞化学染色，发现原代培养初期的人HSCs即呈现较明显的PCNA表达，原代培养后期及传代的人HSCs其PCNA表达明显增强，提示原代培养后期及传代后HSCs的增殖能力增强，这也是HSCs激活后所呈现的重要生物学特性之一。体外培养的人HSCs能连续传代达10代以上，也说明人HSCs也具有很强的增殖能力。但随着传代次数的增加，HSCs的增殖能力逐渐减弱，出现这一现象的原因尚不清楚。
作者简介：朱永红(1966.2)，男，湖北省荆门市人，博士，讲师， 主要从事肝纤维化发生机制方面的研究，发表论文10篇。
参考文献
[1] Bachem M G, Meyer D, Schafer W, et al. The response of rat liver perisinusoidal lipocytes to polypeptide growth regulator changes with their transdifferentiation into myofibroblastlike cells in culture[J]. J Hepatol,1993,18(1):40-52.
, 百拇医药
[2] Friedman S L, Rockey D C, McGuire R F, et al. Isolated hepatic lipocytes and Kupffer cells from normal human liver:Morphological and functional characteristics in primary culture[J]. Hepatology,1992,15(2):234-243.
[3] 朱永红， 胡大荣， 谢 青， 等. 正常人肝脏星形细胞的分离、培养及鉴定[J].细胞生物学杂志，1999，21(3)：插页.
[4] Olaso E, Friedman S L. Molecular regulation of hepatic fibrogenesis[J]. J Hepatol,1998,29(5):836-847.
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[5] Kawada N, Kuroki T, Kobayashi K, et al. Inhibition of myofibroblast transformation of cultured rat hepatic satellite cells by methylxanthines and dibutyryl cAMP[J]. Dig Dis Sci,1996,41(5):1022-1029.
[6] Gressner A M, Bachem M G. Molecular mechanisms of liver fibrogenesis: A homage to the role of activated fatstoring cells[J]. Digestion,1995,56(5):335-346.
收稿日期：1999-09-16；修回日期：1999-12-21, http://www.100md.com