呼吸道合胞病毒对人肺腺癌细胞系Paa的影响
作者：陈杭薇 钱桂生 邬光惠 李继成
单位：陈杭薇(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)；钱桂生(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)；邬光惠(北京军区总医院，北京 100700)；李继成(北京军区总医院，北京 100700)
关键词：呼吸道合胞病毒；肿瘤细胞；p53基因；聚合酶链反应；单链构象多态性分析
第三军医大学学报000304
提 要 目的：探讨呼吸道合胞病毒(RSV)感染对体外培养人肺腺癌细胞系PAa的影响。方法：应用RSV体外感染PAa细胞，观察PAa细胞的变化；聚合酶链反应(PCR)结合单链构象多态性分析(SSCP)检测PAa细胞p53基因突变情况。结果：RSV感染PAa细胞24 h后，细胞出现融合病变，形成巨融合细胞；病变细胞p53第5、6、7、8、9外显子突变热点区域未见单链多态性变化。结论：RSV对PAa细胞形态影响明显，对PAa细胞基因水平的改变有待深入研究。
, http://www.100md.com
中图法分类号 R373.1;R730.261 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(2000)03-0213-03
Effects of respiratory syncytial virus on human lung adenocarcinoma cell line PAa and p53 gene mutation
CHEN Hang-wei, QIAN Gui-sheng, WU Guang-hui, LI Ji-cheng
(Research Institute of Respiratory Disease, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China)
, 百拇医药
Abstract Objective: To study the effects of respiratory syncytial virus (RSV) on the morphology of human lung adenocarcinoma cell line PAa and the mutation of p53. Methods： PAa cells were infected with RSV and the mutation of p53 in PAa cells was observed with polymerase chain reactionsingle strand conformation polymorphism (PCRSSCP). Results: 24 hours after RSV infection, huge fused PAa cells were formed. PCRSSCP revealed no change of exon 5, 6, 7, 8 and 9 of p53 gene in the fused PAa cells. Conclusion: RSV infection affects significantly the morphology of PAa cells but its effects on the changes of genes in PAa cells needs further investigation.
, 百拇医药
Key words respiratory syncytial virus; tumor cell; p53 gene; PCR; SSCP
呼吸道合胞病毒(RSV)是有包膜的单股负链RNA病毒，属副粘病毒科肺炎病毒属[1]。它广泛流行于世界各地人群中，不仅是婴幼儿急性下呼吸道感染的重要病因[2]，也是引起成人许多严重疾病的重要感染原[3～5]。本研究于体外应用RSV感染人肺腺癌细胞系PAa，观察培养过程中细胞形态变化，并应用聚合酶链反应(PCR)结合单链构象多态性分析(SSCP)，从基因水平观察被感染的PAa细胞抑癌基因p53是否突变，探讨RSV感染对PAa细胞的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
PAa细胞为人肺腺癌细胞系[6]，由北京医科大学病理学系购入。培养液为RPMI1640，含10%热灭活小牛血清。于37°C、5%CO2孵育箱内培养。
, 百拇医药
1.2 RSV感染
收获对数生长期PAa细胞，接种于96孔细胞培养板，培养24 h，待其贴壁后加入实验培育的RSV Long株病毒液(毒力TCID50，10-5/ml)0.15 ml/孔，33°C吸附2 h后，转入37°C、5%CO2孵育箱内培养，分别于24、48、72、96 h和120 h观察细胞改变。设不加病毒的PAa细胞作对照。RSV标准Long株由首都儿科研究所病毒室提供。
1.3 提取PAa细胞DNA
胰酶消化收获PAa细胞，用生理盐水洗涤3次，重新悬浮后，常规酚/氯仿抽提DNA。
1.4 PCR扩增p53基因第5、6、7、8和9外显子
试剂盒由北京师范大学京师生物工程公司提供。第5外显子(181 bp)，引物1：5′TACTCCCCTGCCCTCAACAAGA3′；引物2：5′CGCTACCTGAGCAGCGCTCAT 3′；第6外显子(201 bp)，引物1：5′ACGACAGGGCTGGTTGCCCA3′；引物2：5′CTCCCAGAGACCCCAGTTGC3′；第7外显子(171 bp)，引物1：5′GGCCTCATCTTGGGCCTGTG3′；引物2：5′CAGTGTGCAGGGTGGCAAGT3′；第8外显子(204 bp)，引物1：5′CTGCCTCTTGCTTCTCTTTT3′；引物2：5′TCTCCTCCACCGCTTCTTGT3′；第9外显子(185 bp)，引物1：5′GCAGTTATGCCTCAGATTCA3′；引物2：5′CTGGCATTTTGAGTGTTAGA3′。扩增采用常规标准反应体系，模板(变性DNA)5 μl，10×Taq酶缓冲液2.5 μl,4 mmol/L dNTP 1 μl，引物1，2各1 μl,Taq酶2 U，补双蒸水至25 μl混匀，石蜡油封液面。94°C 45 s，50°C 45 s，72°C 45 s，35次循环。72°C再延伸5 min，反应完毕后取10 μl扩增产物进行琼脂糖电泳，确认目标DNA区带。
, 百拇医药
1.5 SSCP电泳
取5 μl PCR产物，加等量变性上样缓冲液，95°C变性5 min后上样于制备好的10%聚丙烯酰胺凝胶上，40 V 8°C条件下电泳15 h。取下凝胶固定：30%乙醇10%乙酸液30 min×2，蒸馏水10 min×2。银染色：0.1%AgNO3避光浸泡30 min，蒸馏水 冲洗。显色：2.5%Na2CO3加0.02%甲醛液浸泡至条带清晰，1%乙酸终止反应，判断结果。同时设置未突变型作对照。
2 结果
2.1 RSV感染PAa细胞
PAa细胞接种96孔培养板，细胞浓度4×105/ml，每孔50～100 μl，贴壁后加入RSV病毒液，24 h后即可观察到细胞发生融合病变，见图1，逐渐形成巨融合细胞，见图2，而未加病毒液的PAa细胞对照组则无此改变，见图3。
, 百拇医药
图1 RSV液(毒力TCID50 10-5)感染24 h，PAa腺癌
细胞出现融合病变 (×250)
Fig 1 24 hours after RSV treatment,the PAa cells were
fused (TCID50 10-5×250)
图2 RSV液(毒力TCID50 10-5)感染120 h，PAa腺癌
细胞出现融合病变，形成巨融合细胞 (×250)
, http://www.100md.com
Fig 2 120 hours after RSV treatment, the PAa cells
were fused and formed a huge fusion cell
(TCID50 10-5×250)
图3 人肺腺癌细胞(PAa)传代后培养24 h，细胞无
融合现象(对照组) (×250)
Fig 3 24 hours after generational culture, the PAa cells
were not fused (Control) (×250)
, 百拇医药
2.2 PAa细胞p53基因PCRSSCP检测
收获RSV感染120 hPAa细胞提取DNA，进行p53第5、6、7、8和9外显子突变热点区域PCR扩增，分别得到了与预计相同的DNA片断(171～204 bp)。经SSCP电泳分析，其单链迁移率与未经RSV感染的PAa细胞比较，未见变化。
3 讨论
RSV适合在Hela及Hep-2传代细胞上生长，对KB细胞和A549(人肺癌细胞株)也比较敏感[7，8]。本实验应用的是人肺腺癌细胞系PAa，既往虽然没有RSV在此细胞系上生长的报道，但从本实验结果看，病毒感染PAa细胞仅24 h，即可观察到细胞融合现象，并逐渐形成巨融合细胞，说明RSV对PAa细胞是敏感的。
从另一个意义上说，一种动物病毒只能在一定范围的宿主细胞内复制。这种细胞应具备病毒吸附的受体或病毒基因表达必须的某种因素。病毒吸附之后浸入细胞才能很好增殖。PAa细胞可能具备以上条件，它可以作为RSV的一种感染细胞，供RSV研究之用。
, http://www.100md.com
抑癌基因p53定位于17号染色体短臂3.1带[9]。人乳头瘤病毒(HPV)可经插入等方式整合到人染色体某一位点，致p53突变。
RSV感染PAa细胞后，PAa细胞形态上出现了融合病变，检测其p53基因第5、6、7、8和9外显子突变热点区域，未发现有变化。高浓度病毒颗粒或病毒外壳蛋白的毒性作用可以诱导细胞形态改变。RSV如果尚未整合到细胞染色体上，对p53基因就不会有影响。从基因水平改变考虑，今后仍需要深入研究。
肺癌患者鼻咽部分泌物的RSV检出阳性率较高，可能与肺癌患者免疫力下降，继发病毒感染有关。RSV感染对肺癌细胞有何影响?从本研究看值得进一步探讨，可能为肺癌的病因和治疗提供新思路。
基金项目：全军“九五”医药卫生科研基金重点资助项目(98Z061)
作者简介：陈杭薇(1952.4)，女，江苏省扬中市人，博士，主任医师，主要从事呼吸道感染方面的研究，发表论文15篇，现在北京军区总医院呼吸内科。
, 百拇医药
参考文献
[1] 陈杭薇，邬光惠，李继成，等.反转录聚合酶链反应在呼吸道合胞病毒感染检测的应用[J]. 军医进修学院学报，1997，18(2)：114-117.
[2] Haoqiang Z, Teresa C T P, Valerie B R, et al. Strainspecific reverse transcriptase PCR assay:means to distinguish candidate vaccine from wildtype strains of respiratory syncytial virus[J].J Clin Microbi,1996,34(2):334-337.
[3] 陈杭薇，李继成，付丽萍，等.呼吸道合胞病毒在成人呼吸道感染患者中的分布[J].中华结核和呼吸杂志， 1990， 13(6)：348.
, http://www.100md.com
[4] 陈杭薇，陈佩兰，李继成，等.成人呼吸道合胞病毒的电镜和免疫电镜研究[J].中华结核和呼吸杂志， 1993， 16(5)：281-283.
[5] Montagne J R L. RSV pneumonia, a communityacquired in fection in adults[J]. Lancet,1997,349(9046)：149-150.
[6] 吴秉铨，孙毓恺，郑 杰，等.裸鼠体内建立的人类高转移癌系[J].中华肿瘤杂志，1985，7(5)：324-328.
[7] 杜 平， 朱关福， 刘湘云 主编.现代临床病毒学[M].北京：人民军医出版社，1991.311-321.
[8] 赖建平.病毒病的实验诊断[A].见：向近敏，郑志明，赵利淦 主编. 医学病毒学[M]. 上海： 上海科学技术出版社，1986.233-247.
[9] 笪冀平， 胡益云， 陈乐真， 等. 肺癌人乳头瘤病毒感染与p53基因突变的研究[J]. 中华肿瘤杂志， 1996， 18(1)：27-29.
收稿日期：1999-09-05；修回日期：2000-01-12, 百拇医药
单位：陈杭薇(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)；钱桂生(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)；邬光惠(北京军区总医院，北京 100700)；李继成(北京军区总医院，北京 100700)
关键词：呼吸道合胞病毒；肿瘤细胞；p53基因；聚合酶链反应；单链构象多态性分析
第三军医大学学报000304
提 要 目的：探讨呼吸道合胞病毒(RSV)感染对体外培养人肺腺癌细胞系PAa的影响。方法：应用RSV体外感染PAa细胞，观察PAa细胞的变化；聚合酶链反应(PCR)结合单链构象多态性分析(SSCP)检测PAa细胞p53基因突变情况。结果：RSV感染PAa细胞24 h后，细胞出现融合病变，形成巨融合细胞；病变细胞p53第5、6、7、8、9外显子突变热点区域未见单链多态性变化。结论：RSV对PAa细胞形态影响明显，对PAa细胞基因水平的改变有待深入研究。
, http://www.100md.com
中图法分类号 R373.1;R730.261 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(2000)03-0213-03
Effects of respiratory syncytial virus on human lung adenocarcinoma cell line PAa and p53 gene mutation
CHEN Hang-wei, QIAN Gui-sheng, WU Guang-hui, LI Ji-cheng
(Research Institute of Respiratory Disease, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China)
, 百拇医药
Abstract Objective: To study the effects of respiratory syncytial virus (RSV) on the morphology of human lung adenocarcinoma cell line PAa and the mutation of p53. Methods： PAa cells were infected with RSV and the mutation of p53 in PAa cells was observed with polymerase chain reactionsingle strand conformation polymorphism (PCRSSCP). Results: 24 hours after RSV infection, huge fused PAa cells were formed. PCRSSCP revealed no change of exon 5, 6, 7, 8 and 9 of p53 gene in the fused PAa cells. Conclusion: RSV infection affects significantly the morphology of PAa cells but its effects on the changes of genes in PAa cells needs further investigation.
, 百拇医药
Key words respiratory syncytial virus; tumor cell; p53 gene; PCR; SSCP
呼吸道合胞病毒(RSV)是有包膜的单股负链RNA病毒，属副粘病毒科肺炎病毒属[1]。它广泛流行于世界各地人群中，不仅是婴幼儿急性下呼吸道感染的重要病因[2]，也是引起成人许多严重疾病的重要感染原[3～5]。本研究于体外应用RSV感染人肺腺癌细胞系PAa，观察培养过程中细胞形态变化，并应用聚合酶链反应(PCR)结合单链构象多态性分析(SSCP)，从基因水平观察被感染的PAa细胞抑癌基因p53是否突变，探讨RSV感染对PAa细胞的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
PAa细胞为人肺腺癌细胞系[6]，由北京医科大学病理学系购入。培养液为RPMI1640，含10%热灭活小牛血清。于37°C、5%CO2孵育箱内培养。
, 百拇医药
1.2 RSV感染
收获对数生长期PAa细胞，接种于96孔细胞培养板，培养24 h，待其贴壁后加入实验培育的RSV Long株病毒液(毒力TCID50，10-5/ml)0.15 ml/孔，33°C吸附2 h后，转入37°C、5%CO2孵育箱内培养，分别于24、48、72、96 h和120 h观察细胞改变。设不加病毒的PAa细胞作对照。RSV标准Long株由首都儿科研究所病毒室提供。
1.3 提取PAa细胞DNA
胰酶消化收获PAa细胞，用生理盐水洗涤3次，重新悬浮后，常规酚/氯仿抽提DNA。
1.4 PCR扩增p53基因第5、6、7、8和9外显子
试剂盒由北京师范大学京师生物工程公司提供。第5外显子(181 bp)，引物1：5′TACTCCCCTGCCCTCAACAAGA3′；引物2：5′CGCTACCTGAGCAGCGCTCAT 3′；第6外显子(201 bp)，引物1：5′ACGACAGGGCTGGTTGCCCA3′；引物2：5′CTCCCAGAGACCCCAGTTGC3′；第7外显子(171 bp)，引物1：5′GGCCTCATCTTGGGCCTGTG3′；引物2：5′CAGTGTGCAGGGTGGCAAGT3′；第8外显子(204 bp)，引物1：5′CTGCCTCTTGCTTCTCTTTT3′；引物2：5′TCTCCTCCACCGCTTCTTGT3′；第9外显子(185 bp)，引物1：5′GCAGTTATGCCTCAGATTCA3′；引物2：5′CTGGCATTTTGAGTGTTAGA3′。扩增采用常规标准反应体系，模板(变性DNA)5 μl，10×Taq酶缓冲液2.5 μl,4 mmol/L dNTP 1 μl，引物1，2各1 μl,Taq酶2 U，补双蒸水至25 μl混匀，石蜡油封液面。94°C 45 s，50°C 45 s，72°C 45 s，35次循环。72°C再延伸5 min，反应完毕后取10 μl扩增产物进行琼脂糖电泳，确认目标DNA区带。
, 百拇医药
1.5 SSCP电泳
取5 μl PCR产物，加等量变性上样缓冲液，95°C变性5 min后上样于制备好的10%聚丙烯酰胺凝胶上，40 V 8°C条件下电泳15 h。取下凝胶固定：30%乙醇10%乙酸液30 min×2，蒸馏水10 min×2。银染色：0.1%AgNO3避光浸泡30 min，蒸馏水 冲洗。显色：2.5%Na2CO3加0.02%甲醛液浸泡至条带清晰，1%乙酸终止反应，判断结果。同时设置未突变型作对照。
2 结果
2.1 RSV感染PAa细胞
PAa细胞接种96孔培养板，细胞浓度4×105/ml，每孔50～100 μl，贴壁后加入RSV病毒液，24 h后即可观察到细胞发生融合病变，见图1，逐渐形成巨融合细胞，见图2，而未加病毒液的PAa细胞对照组则无此改变，见图3。
, 百拇医药
图1 RSV液(毒力TCID50 10-5)感染24 h，PAa腺癌
细胞出现融合病变 (×250)
Fig 1 24 hours after RSV treatment,the PAa cells were
fused (TCID50 10-5×250)
图2 RSV液(毒力TCID50 10-5)感染120 h，PAa腺癌
细胞出现融合病变，形成巨融合细胞 (×250)
, http://www.100md.com
Fig 2 120 hours after RSV treatment, the PAa cells
were fused and formed a huge fusion cell
(TCID50 10-5×250)
图3 人肺腺癌细胞(PAa)传代后培养24 h，细胞无
融合现象(对照组) (×250)
Fig 3 24 hours after generational culture, the PAa cells
were not fused (Control) (×250)
, 百拇医药
2.2 PAa细胞p53基因PCRSSCP检测
收获RSV感染120 hPAa细胞提取DNA，进行p53第5、6、7、8和9外显子突变热点区域PCR扩增，分别得到了与预计相同的DNA片断(171～204 bp)。经SSCP电泳分析，其单链迁移率与未经RSV感染的PAa细胞比较，未见变化。
3 讨论
RSV适合在Hela及Hep-2传代细胞上生长，对KB细胞和A549(人肺癌细胞株)也比较敏感[7，8]。本实验应用的是人肺腺癌细胞系PAa，既往虽然没有RSV在此细胞系上生长的报道，但从本实验结果看，病毒感染PAa细胞仅24 h，即可观察到细胞融合现象，并逐渐形成巨融合细胞，说明RSV对PAa细胞是敏感的。
从另一个意义上说，一种动物病毒只能在一定范围的宿主细胞内复制。这种细胞应具备病毒吸附的受体或病毒基因表达必须的某种因素。病毒吸附之后浸入细胞才能很好增殖。PAa细胞可能具备以上条件，它可以作为RSV的一种感染细胞，供RSV研究之用。
, http://www.100md.com
抑癌基因p53定位于17号染色体短臂3.1带[9]。人乳头瘤病毒(HPV)可经插入等方式整合到人染色体某一位点，致p53突变。
RSV感染PAa细胞后，PAa细胞形态上出现了融合病变，检测其p53基因第5、6、7、8和9外显子突变热点区域，未发现有变化。高浓度病毒颗粒或病毒外壳蛋白的毒性作用可以诱导细胞形态改变。RSV如果尚未整合到细胞染色体上，对p53基因就不会有影响。从基因水平改变考虑，今后仍需要深入研究。
肺癌患者鼻咽部分泌物的RSV检出阳性率较高，可能与肺癌患者免疫力下降，继发病毒感染有关。RSV感染对肺癌细胞有何影响?从本研究看值得进一步探讨，可能为肺癌的病因和治疗提供新思路。
基金项目：全军“九五”医药卫生科研基金重点资助项目(98Z061)
作者简介：陈杭薇(1952.4)，女，江苏省扬中市人，博士，主任医师，主要从事呼吸道感染方面的研究，发表论文15篇，现在北京军区总医院呼吸内科。
, 百拇医药
参考文献
[1] 陈杭薇，邬光惠，李继成，等.反转录聚合酶链反应在呼吸道合胞病毒感染检测的应用[J]. 军医进修学院学报，1997，18(2)：114-117.
[2] Haoqiang Z, Teresa C T P, Valerie B R, et al. Strainspecific reverse transcriptase PCR assay:means to distinguish candidate vaccine from wildtype strains of respiratory syncytial virus[J].J Clin Microbi,1996,34(2):334-337.
[3] 陈杭薇，李继成，付丽萍，等.呼吸道合胞病毒在成人呼吸道感染患者中的分布[J].中华结核和呼吸杂志， 1990， 13(6)：348.
, http://www.100md.com
[4] 陈杭薇，陈佩兰，李继成，等.成人呼吸道合胞病毒的电镜和免疫电镜研究[J].中华结核和呼吸杂志， 1993， 16(5)：281-283.
[5] Montagne J R L. RSV pneumonia, a communityacquired in fection in adults[J]. Lancet,1997,349(9046)：149-150.
[6] 吴秉铨，孙毓恺，郑 杰，等.裸鼠体内建立的人类高转移癌系[J].中华肿瘤杂志，1985，7(5)：324-328.
[7] 杜 平， 朱关福， 刘湘云 主编.现代临床病毒学[M].北京：人民军医出版社，1991.311-321.
[8] 赖建平.病毒病的实验诊断[A].见：向近敏，郑志明，赵利淦 主编. 医学病毒学[M]. 上海： 上海科学技术出版社，1986.233-247.
[9] 笪冀平， 胡益云， 陈乐真， 等. 肺癌人乳头瘤病毒感染与p53基因突变的研究[J]. 中华肿瘤杂志， 1996， 18(1)：27-29.
收稿日期：1999-09-05；修回日期：2000-01-12, 百拇医药