22℃和－80℃保存血小板磷脂的改变
作者：成小玲 尤忠义 林武存 黎汝青 任德惠 曾杰 王凤君
单位：成小玲(第三军医大学附属西南医院 输血科)；林武存(第三军医大学附属西南医院 输血科)；黎汝青(第三军医大学附属西南医院 输血科)；任德惠(第三军医大学附属西南医院 输血科)；王凤君(第三军医大学附属西南医院 输血科)
关键词：血小板贮存损伤；磷脂；高效液相色谱分析；血小板聚集功能
第三军医大学学报000338
中图法分类号 R318.52;R331.143 文献标识码 B
文章编号：1000-5404(2000)03-0252-01
Changes of platelet phospholipid in course of the storage at 22℃ and -80℃
, 百拇医药
采用HPLC-UV分析在22℃和-80℃保存条件下血小板的4种主要磷脂PC、PE、PS、PI的变化情况，并就血小板磷脂改变对血小板聚集功能的影响和在血小板贮存损伤(Platelet storage lesion,PSL)发展过程中的作用进行探讨。
1 材料与方法
1.1 浓缩血小板的制备
20位健康献血者，按血库操作规程采血，每人捐献400 ml全血；经二次离心制成浓缩血小板悬液20单位(从400 ml全血中提取的血小板为1单位)。血袋为ACDB三联袋(上海血液中心产品)。
1.2 分组
将每单位浓缩血小板分装成两份，分别编为甲，乙两组，每组20个样本。采血当天的新鲜血小板为对照组。甲组于22℃水平振摇保存(XHZ-1型血小板恒温振荡保存箱，60次/min，苏州产)，分别在第3天、第5天取样检测，与对照组比较作动态观察。乙组用二甲亚砜(DMSO)作为防冻剂，终浓度为5%，-80℃冰箱(Scien Temp Model 85-6.8，美国产)保存，分别在1月，3月，6月取样测定，与对照组比较进行动态观察，用前在37℃水浴快速融化。
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1.3 实验方法
1.3.1 提取脂质 按文献[1]报道，将血小板悬液用冷生理盐水(4℃)洗涤，直到完全去除血浆。再用冷生理盐水将血小板调至400×109/L，白细胞和红细胞污染数量少于1/4 000血小板。将洗涤后的血小板在冰水浴中匀浆。取3 ml血小板匀浆液+2倍的氯仿-甲醇提取液(2∶1，v/v)，离心去上层液；再加入甲醇水提取液，离心去上层液；取1 ml氯仿液，用氮气吹干，-20℃保存备用[2]。
1.3.2 试剂 4种磷脂标准品：磷脂酰胆碱(Phosphatidylchuline ,PC)， 磷脂酰乙醇胺 (Phosphatidylethanol-amine,PE)，磷脂酰丝氨酸(Phosphalidylserine,PS)，磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol,PI)均为Sigma公司产品；乙腈、甲醇为HPLC(色谱)纯级，上海吴泾化工厂生产；其它试剂均为分析纯。
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1.3.3 仪器与色谱条件 高效液相色谱系统(法国Gilson公司)；色谱工作数据站(中科院大连化物所)。色谱柱：μPorasil silica,300×4.0 mm，粒径10 μm；流动相：乙腈-甲醇-磷酸(90∶3∶1，v/v)；流速：0.8 ml/min；进样量：20μl；紫外检测波长203 nm；时间25 min；柱温：室温；色谱数据：工作站进行数据处理。
1.4 血小板聚集功能测定
诱导剂：ADP，浓度分别为0.2,0.1,0.05 mmol/L；测定5 min，记录血小板最大聚集率(PAG)；仪器：TYXN-91型血液凝集仪(上海产)。
2 结果
新鲜血小板4种主要磷脂的总量为71.4 μg/ml，各自含量依次为PC >PE >PS >PI。22℃水平振摇保存3 d、5 d，4种磷脂的总量分别下降5.8%，31.8%；保存5 d PC，PE，PS，PI的下降具有统计学意义(P< 0.01)。
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血小板-80℃保存1、3、6月，4种磷脂总量比新鲜血小板分别减少了33.3%、34.6%、36.3%，P<0.01；3者之间相比较，磷脂改变差异不显著(P>0.05)[3]。
血小板聚集功能改变：22℃保存24 h，血小板PAG下降约50%；保存72 h，PAG降至10%以下；保存96 h的血小板对ADP诱导无明显的聚集反应。与对照组相比较，-80℃保存的血小板融化后PAG显著下降(P< 0.01)，即使增加ADP浓度也不能提高PAG，血小板在-80℃冰冻保存1、3、6月，PAG分别为9.2%、9.7%、10.9%，3者之间差异不显著(P >0.05)。
3 讨论
保存期间血小板膜脂质结构发生了变化，血小板活化和细胞溶解使磷脂释放到血浆中。实验显示，22℃保存血小板，随保存时间延长，磷脂丢失呈持续状态，血小板聚集功能亦表现为持续下降。-80℃冰冻保存血小板，冻融后磷脂减少约1/3，但是随着保存时间延长，磷脂的丧失却没有增加，而是保持在一相对稳定的水平，同时反映血小板功能的PAG的变化趋势与磷脂的改变极为相似。提示：①血小板磷脂丧失与血小板功能下降有密切关系。②-80℃冰冻保存血小板，其损伤主要来自冻融过程，与保存时间长短无明显关系。
, 百拇医药
贮存期间血小板磷脂丧失的机制目前还不完全明确，有以下几种可能：①提前消耗。某些非生理性刺激，如采集技术、贮存容器、保存介质、保存温度等影响，引起血小板活化，释放颗粒，进而聚集，脂质被提前消耗。②酶的作用。如血小板释放磷脂酶、脂质酶或受白细胞污染等使血小板膜脂质消耗或丢失。③脂质过氧化作用。在贮存期间血小板内源性抗氧化物(如谷胱甘肽)逐渐耗尽，使得氧分子能够对无保护功能的脂质进行过氧化反应，最终导致脂链破碎。由于维持血小板生理功能的花生四烯酸前体缺乏，以及能破坏生物膜的脂肪酰基醛生成，使血小板膜脂质双层稳定性下降，磷脂丧失[4]，最终导致血小板止血功能下降，存活时间缩短。血小板的活化使磷脂PS、PE在脂质膜外侧暴露形成血小板第三因子(PF3)。PF3能大大加快凝血酶产生的速度，引起血小板广泛聚集。
防止PSL发生已成为输血工作亟待解决的问题。据报道，使用抗氧化剂如维生素E和硒蛋氨酸，能抑制脂质过氧化作用，延长血小板的保存时间[5]。在制备中减少白细胞污染有助于提高血小板贮存质量。
, 百拇医药
作者简介：成小玲(1954.12)，女，山西省兴县人，主任技师， 主要从 事血液成分制备与保存方面的研究，发表论文14篇。
作者单位：尤忠义(第三军医大学附属西南医院 烧伤研究所；重庆 400038)
曾杰(第三军医大学附属西南医院 烧伤研究所；重庆 400038)
参考文献
[1] Kawasaki T, Kambayashi J, Mori T, et al. Analysis of platelet phospholipids by high performance liquid chromatography[J]. Thrombosis Research,1984,36(4):335-338.
[2] 王凤君，赵 云，谢尔凡，等.高效液相色谱法测定生物样品中磷脂含量[J].第三军医大学学报，1996，18(1)：67-68.
, 百拇医药
[3] 成小玲，林武存，黎汝青，等.储存损伤对血小板超微结构和聚集功能的影响[J].重庆医学，2000，29(2)：106-110.
[4] Seghatchian J M J, Krailadsiri P. The platelet storage lesion[J]. Transfusion Medicine Reviews,1997，11(2):130-134.
[5] Klinger M H F. The storage lesion of platelets:ultrastructural and functional aspects[J]. Ann Hematol,1996，73(2):103-106.
收稿日期：1999-05-23；修回日期：1999-12-28, 百拇医药
单位：成小玲(第三军医大学附属西南医院 输血科)；林武存(第三军医大学附属西南医院 输血科)；黎汝青(第三军医大学附属西南医院 输血科)；任德惠(第三军医大学附属西南医院 输血科)；王凤君(第三军医大学附属西南医院 输血科)
关键词：血小板贮存损伤；磷脂；高效液相色谱分析；血小板聚集功能
第三军医大学学报000338
中图法分类号 R318.52;R331.143 文献标识码 B
文章编号：1000-5404(2000)03-0252-01
Changes of platelet phospholipid in course of the storage at 22℃ and -80℃
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采用HPLC-UV分析在22℃和-80℃保存条件下血小板的4种主要磷脂PC、PE、PS、PI的变化情况，并就血小板磷脂改变对血小板聚集功能的影响和在血小板贮存损伤(Platelet storage lesion,PSL)发展过程中的作用进行探讨。
1 材料与方法
1.1 浓缩血小板的制备
20位健康献血者，按血库操作规程采血，每人捐献400 ml全血；经二次离心制成浓缩血小板悬液20单位(从400 ml全血中提取的血小板为1单位)。血袋为ACDB三联袋(上海血液中心产品)。
1.2 分组
将每单位浓缩血小板分装成两份，分别编为甲，乙两组，每组20个样本。采血当天的新鲜血小板为对照组。甲组于22℃水平振摇保存(XHZ-1型血小板恒温振荡保存箱，60次/min，苏州产)，分别在第3天、第5天取样检测，与对照组比较作动态观察。乙组用二甲亚砜(DMSO)作为防冻剂，终浓度为5%，-80℃冰箱(Scien Temp Model 85-6.8，美国产)保存，分别在1月，3月，6月取样测定，与对照组比较进行动态观察，用前在37℃水浴快速融化。
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1.3 实验方法
1.3.1 提取脂质 按文献[1]报道，将血小板悬液用冷生理盐水(4℃)洗涤，直到完全去除血浆。再用冷生理盐水将血小板调至400×109/L，白细胞和红细胞污染数量少于1/4 000血小板。将洗涤后的血小板在冰水浴中匀浆。取3 ml血小板匀浆液+2倍的氯仿-甲醇提取液(2∶1，v/v)，离心去上层液；再加入甲醇水提取液，离心去上层液；取1 ml氯仿液，用氮气吹干，-20℃保存备用[2]。
1.3.2 试剂 4种磷脂标准品：磷脂酰胆碱(Phosphatidylchuline ,PC)， 磷脂酰乙醇胺 (Phosphatidylethanol-amine,PE)，磷脂酰丝氨酸(Phosphalidylserine,PS)，磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol,PI)均为Sigma公司产品；乙腈、甲醇为HPLC(色谱)纯级，上海吴泾化工厂生产；其它试剂均为分析纯。
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1.3.3 仪器与色谱条件 高效液相色谱系统(法国Gilson公司)；色谱工作数据站(中科院大连化物所)。色谱柱：μPorasil silica,300×4.0 mm，粒径10 μm；流动相：乙腈-甲醇-磷酸(90∶3∶1，v/v)；流速：0.8 ml/min；进样量：20μl；紫外检测波长203 nm；时间25 min；柱温：室温；色谱数据：工作站进行数据处理。
1.4 血小板聚集功能测定
诱导剂：ADP，浓度分别为0.2,0.1,0.05 mmol/L；测定5 min，记录血小板最大聚集率(PAG)；仪器：TYXN-91型血液凝集仪(上海产)。
2 结果
新鲜血小板4种主要磷脂的总量为71.4 μg/ml，各自含量依次为PC >PE >PS >PI。22℃水平振摇保存3 d、5 d，4种磷脂的总量分别下降5.8%，31.8%；保存5 d PC，PE，PS，PI的下降具有统计学意义(P< 0.01)。
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血小板-80℃保存1、3、6月，4种磷脂总量比新鲜血小板分别减少了33.3%、34.6%、36.3%，P<0.01；3者之间相比较，磷脂改变差异不显著(P>0.05)[3]。
血小板聚集功能改变：22℃保存24 h，血小板PAG下降约50%；保存72 h，PAG降至10%以下；保存96 h的血小板对ADP诱导无明显的聚集反应。与对照组相比较，-80℃保存的血小板融化后PAG显著下降(P< 0.01)，即使增加ADP浓度也不能提高PAG，血小板在-80℃冰冻保存1、3、6月，PAG分别为9.2%、9.7%、10.9%，3者之间差异不显著(P >0.05)。
3 讨论
保存期间血小板膜脂质结构发生了变化，血小板活化和细胞溶解使磷脂释放到血浆中。实验显示，22℃保存血小板，随保存时间延长，磷脂丢失呈持续状态，血小板聚集功能亦表现为持续下降。-80℃冰冻保存血小板，冻融后磷脂减少约1/3，但是随着保存时间延长，磷脂的丧失却没有增加，而是保持在一相对稳定的水平，同时反映血小板功能的PAG的变化趋势与磷脂的改变极为相似。提示：①血小板磷脂丧失与血小板功能下降有密切关系。②-80℃冰冻保存血小板，其损伤主要来自冻融过程，与保存时间长短无明显关系。
, 百拇医药
贮存期间血小板磷脂丧失的机制目前还不完全明确，有以下几种可能：①提前消耗。某些非生理性刺激，如采集技术、贮存容器、保存介质、保存温度等影响，引起血小板活化，释放颗粒，进而聚集，脂质被提前消耗。②酶的作用。如血小板释放磷脂酶、脂质酶或受白细胞污染等使血小板膜脂质消耗或丢失。③脂质过氧化作用。在贮存期间血小板内源性抗氧化物(如谷胱甘肽)逐渐耗尽，使得氧分子能够对无保护功能的脂质进行过氧化反应，最终导致脂链破碎。由于维持血小板生理功能的花生四烯酸前体缺乏，以及能破坏生物膜的脂肪酰基醛生成，使血小板膜脂质双层稳定性下降，磷脂丧失[4]，最终导致血小板止血功能下降，存活时间缩短。血小板的活化使磷脂PS、PE在脂质膜外侧暴露形成血小板第三因子(PF3)。PF3能大大加快凝血酶产生的速度，引起血小板广泛聚集。
防止PSL发生已成为输血工作亟待解决的问题。据报道，使用抗氧化剂如维生素E和硒蛋氨酸，能抑制脂质过氧化作用，延长血小板的保存时间[5]。在制备中减少白细胞污染有助于提高血小板贮存质量。
, 百拇医药
作者简介：成小玲(1954.12)，女，山西省兴县人，主任技师， 主要从 事血液成分制备与保存方面的研究，发表论文14篇。
作者单位：尤忠义(第三军医大学附属西南医院 烧伤研究所；重庆 400038)
曾杰(第三军医大学附属西南医院 烧伤研究所；重庆 400038)
参考文献
[1] Kawasaki T, Kambayashi J, Mori T, et al. Analysis of platelet phospholipids by high performance liquid chromatography[J]. Thrombosis Research,1984,36(4):335-338.
[2] 王凤君，赵 云，谢尔凡，等.高效液相色谱法测定生物样品中磷脂含量[J].第三军医大学学报，1996，18(1)：67-68.
, 百拇医药
[3] 成小玲，林武存，黎汝青，等.储存损伤对血小板超微结构和聚集功能的影响[J].重庆医学，2000，29(2)：106-110.
[4] Seghatchian J M J, Krailadsiri P. The platelet storage lesion[J]. Transfusion Medicine Reviews,1997，11(2):130-134.
[5] Klinger M H F. The storage lesion of platelets:ultrastructural and functional aspects[J]. Ann Hematol,1996，73(2):103-106.
收稿日期：1999-05-23；修回日期：1999-12-28, 百拇医药