脂质体介导外源基因体外转染精子的研究
作者：黄伟民 赖良学 乔桂林 岳军明 安靓 王凯 付殿国 殷震 李进
单位：黄伟民(广州军区157医院肿瘤科)；赖良学(解放军农牧大学军事医学研究所基因工程研究室，吉林 长春 130062)；乔桂林(解放军农牧大学军事医学研究所基因工程研究室，吉林 长春 130062)；岳军明(解放军农牧大学军事医学研究所基因工程研究室，吉林 长春 130062)
关键词：脂质体；精子；转基因动物；胚胎细胞
第一军医大学学报000308 摘要：目的 为探索精子作为外源基因的载体建立转基因小鼠的可行性。 方法 我们从性成熟小鼠的输精管及部分附睾管中取出精子，与阳离子脂质体包裹的DNA混合孵育之后将其注入超排卵小鼠的阴道内，48 h后收集II细胞期胚胎细胞。结果 (1) 精子可转染上外源DNA，转染率达53%；(2) 转染有外源DNA的精子可使II细胞期胚胎携带上外源基因，携带率为11.5%。结论 小鼠输精管及附睾管内的精子可被脂质体包裹的外源DNA转染并可作为载体将此外源DNA带入早期胚胎。
, http://www.100md.com
中图分类号: Q571；Q461 文献标识码：A 文章编号：1000-2588 (2000)-03-0216-03
Transfection of mouse sperms in vitro with foreign gene mediated by liposome
HUANG Wei-min1, LAI Liang-xue2, QIAO Gui-lin2, YUE Jun-ming1, AN Jing2, WANG Kai2, FU Dian-guo2, YIN Zhen2, LI Jin1
(1Department of Histology and Embryology, First Military Medical University, Guangzhou 510510, China; 2Department of Genetic Engineering, Institute of Military Medicine, University of Agriculture and Animal Sciences of PLA, Changchun 130062, China)
, 百拇医药
Abstract: Objective To explore the feasibility of sperms used as carriers of foreign gene for generating transgenic mice. Methods The sperms were taken from the vas deferens and ductus epididymidis of mature mice, incubated with foreign plasmid DNA covered by liposome and injected into the vagina of super-ovulated female mice. Forty hours later the 2-cell embryos were collected for test. Results The results showed that: (1) The sperms could be transfected by foreign DNA and the ratio of transfection was 53%; (2) The 2-cell embryos could carry foreign DNA from the sperms transfected and the frequency of carrying was 11.5%. Conclusion Sperms from mouse vas deferens and ductus epididymidis can be transfected by foreign DNA covered by liposome and can be used as the vehicle to carry the foreign DNA into early embryo.
, http://www.100md.com
Key words: liposomes; sperm; transgenic animals; embryo
随着分子生物学与胚胎技术的不断发展，将基因导入早期胚胎培育转基因动物已经由可能变为现实。目前建立转基因动物最常用的方法仍然是经典的受精卵显微注射法[1]，但这一方法存在诸多不足之处，如所需的仪器设备昂贵、技术要求高、成功率低等。因此，人们试图找到一种简单、有效和广泛适用的方法，用于将外源基因导入任意种类动物的基因组中。长期以来脂质体都被用来向活细胞内转染各类分子[2]，但很少用于转染核酸。20世纪80年代末出现了新一代的脂质体，这类脂质体主要由阳离子脂类构成[3,4] 。阳离子脂类与带负电荷的核酸分子相互作用，将核酸包裹在内部，而被覆的脂类外表层含阳性电荷，可与带阴性电荷的细胞膜融合并释放出内裹的核酸分子。这类新型脂质体已被证明在转染DNA上是十分有效的。我们利用这种新型脂质体包裹质粒DNA转染小鼠精子后通过人工受精，收获II细胞期胚胎，检测II细胞期胚胎携带外源DNA的情况，以验证脂质体在转染外源DNA方面的作用，为今后进一步以此方法生产转基因动物打下基础。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 昆明纯系小鼠，雌雄各10只。
1.1.2 外源基因 t-PA cDNA的PCR扩增产物(地高辛随机引物法标记，长约300 bp)。
1.1.3 试剂 脂质体 Lipofectin(美国Life Technologies 公司生产)、地高辛抗体-碱性磷酸酶复合物(1:50 000)、 显色液：10 ml 缓冲液Ⅲ(Tris-HCl 100 mmol/L；NaCl 100 mmol/L；MgCl2 50 mmol/L； pH 9.5，20℃)中，加入45 μl NBT，35 μl X-磷酸盐溶液、缓冲液Ⅰ：Tris-HCl 100 mmol/L；NaCl 150 mmol/L；pH 7.5(20℃)、缓冲液Ⅳ：Tris-Hcl 10 mmol/L；EDTA 1 mmol/L；pH 8.0 (20℃)、DMEM培养液
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 转染液配制 外源基因 1 μl (1.7 g/L)、DMEM 10 μl、脂质体1 μl。室温静置30 min。
1.2.2 小鼠精子的采集及转染 取性成熟有授精能力的小鼠，单独饲养3 d以上。将小鼠断颈处死，局部消毒，腹下正中切开，拉出睾丸、附睾及输精管，在输精管近膀胱端处剪断，挤出输精管及附睾管内的精液，每侧约能挤出10～20 μl。与转染液混合作用30 min。
1.2.3 精子活力评估 取与转染液作用前及作用后的精液各2 μl，各用20 μl 生理盐水稀释后，血球计数板上计数不活动精子数。
1.2.4 小鼠人工受精 取人工超排卵母鼠，846合剂(解放军农牧大学生产)腹腔注射0.05～0.1 μl，麻醉后备用；用200 μl 加样头吸起与转染液作用的精液，注入上述母鼠的阴道内，将母鼠倒悬30 min。
, 百拇医药
1.2.5 小鼠胚胎细胞的获得 48 h后将人工受精母鼠断颈处死，剪取输卵管解剖，显微镜下将固定在微量注射器上的毛细玻璃管插入输卵管伞，推动微量注射器内的DMEM液，冲出胚胎细胞。
1.2.6转染精子的地高辛标记物染色 取与转染液作用后的精液2 μl，PBS 200倍稀释后，500 r/min离心5 min，弃上清，重复3次。DNase I酶37℃作用30 min，再重复上述洗涤后，用PBS调精子浓度达1×106个/mm3，滴片，空气干燥，4%多聚甲醛固定10 min； SSC，10 min 洗片2次；缓冲液Ⅰ冲洗5 min；0.5%鲑鱼精蛋白封阻剂(w/w)封闭30 min； 缓冲液Ⅰ洗片15 min；滴加地高辛单抗-碱性磷酸酶复合物，室温作用30 min；缓冲液Ⅰ洗片15 min×2；缓冲液Ⅲ中平衡2 min；显色液中显色20 min～1 h；缓冲液Ⅳ中终止反应5 min；蒸馏水冲洗，空气干燥，甘油明胶封片。
, 百拇医药
1.2.7 胚胎细胞的地高辛标记物染色 在显微操作仪上，用毛细玻璃管将胚胎细胞在PBS 中反复吹吸冲洗数遍后，吸起胚胎细胞，滴于涂有15%乳白胶的载玻片上，空气干燥；4%多聚甲醛/PBS (pH 7.0)固定；余下操作同1.2.6。
2 结果
2.1 精子转染前后的活力
用血球计数板计数精子转染前后的不活动精子数，计数500个精子，以评估精子的活力。精子细胞转染前的不活动精子数为11.5%；精子细胞转染后的不活动精子数为12.5%；两者相差不显著。结果显示：本方法采集的精子具有良好的活力；转染液对精子的活力不造成明显影响。
2.2 脂质体介导的外源基因在精子的转染效果
转染液作用后的精子经反复洗涤、DNase I酶消化后，洗脱掉表面附着的外源DNA，经地高辛标记物染色，计数500个精子，阳性染色为53%。阴性对照为精子与不加外源DNA的转染液作用，地高辛标记物染色，阳性染色为1.5%，属非特异染色。
, 百拇医药
2.3 细胞期胚胎细胞携带外源DNA的检测
从3只经人工受精的母鼠身上获得98个胚胎细胞，其中II细胞期胚胎细胞为78个，单个细胞(未受精卵细胞)8个，畸形胚胎细胞12个。地高辛标记物染色78个II细胞期胚胎中有9个呈现阳性颗粒。从1只经超排卵后与正常公鼠交配后24 h的母鼠中获得32个胚胎细胞，其中II细胞期胚胎细胞为30个，另有2个畸形细胞。地高辛标记物染色未见阳性颗粒。结果显示：本方法可以使胚胎细胞携带上外源基因，携带率为11.5%(9/78)。
3 讨论
本实验结果表明，通过脂质体将外源DNA转染入精子后，精子可作为载体将外源基因导入胚胎细胞，Daniel 等人[5] 在体外用脂质体处理小鼠附睾内的精子后，在共聚焦显微镜下，他们发现有80%的精子头部携带有外源基因，并且部分是在精子核内或在精子核周围。在我们的实验中也显示有53%的精子携带有外源DNA。Niknishi等[6] 报道，用脂质体包裹的外源基因处理鸡的精子后，在精子的整个头部区域可检测到外源基因的存在，阳性率达51.6%，并且这些精子表现出正常的受精能力，受精率可达67%。Rottmann等人[7]研究发现，在没有脂质体介导的情况下，鸡精子与外源基因共孵育后，经Southern印迹杂交检测，精子不含外源DNA。Danial 等人也发现，精子单纯地与外源基因共孵育后，绝大部分的外源基因仅仅是附于精子细胞的膜上，经DNA酶作用后绝大部分脱失。
, 百拇医药
本实验的目的是为了证实精子作为载体，是否可将外源DNA转染入胚胎细胞。为了便于检测，我们直接用目的基因(tPA)的PCR扩增产物(约300 bp)，以随机引物法标记地高辛作为外源基因，因此在样本的检测时，就可以省去探针与外源基因杂交等的一些操作步骤，而直接用地高辛标记物显色即可。
我们使用的脂质体(lipofectin)由2, 3- 二油酰氧丙基- 1- 溴化三甲铵(DOTMA)与二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)按1:1(w/w)溶于除菌过滤水中而成。其核心成份DOTMA中含带正电荷的4价铵，可与带负电荷的DNA结合成复合物。DOPE为中性磷脂，它并不与DNA结合，但可包围在阳离子脂质- DNA复合物外形成微团或脂质体，一方面能稳定阳离子脂质双分子层，另一方面可通过降低内体(endosome)膜的稳定性促进DNA由内体转入细胞质[8～10] ，因此DOPE是最佳转染所不可缺少的。关于阳离子脂质体与细胞的相互作用，目前认为有3种模式：(1)脂质体与细胞的融合或内体的去稳定；(2)脂质体与质膜的直接融合；(3)脂质- DNA复合物穿过细胞膜进入细胞质，然后迁移进入细胞核[11] 。然而目前尚无证据支持任何一种模式。
, 百拇医药
综上所述，我们的实验结果提示：(1)用阳离子脂质体-DNA复合物处理小鼠精子后可使其转染上外源基因；(2)转染后的精子通过人工受精可以使II细胞期胚胎携带外源基因。这一实验的成功将为我们进一步用此方法生产转基因小鼠打下基础。
国家863资助项目(Z21-04-04)
黄伟民(1960-)，男，山东莱阳人，1999年毕业于第一军医大学，博士，讲师
作者单位:安靓(第一军医大学组胚教研室，广东 广州 510515)
王凯(解放军农牧大学军事医学研究所基因工程研究室，吉林 长春 130062)
付殿国(解放军农牧大学军事医学研究所基因工程研究室，吉林 长春 130062)
殷震(解放军农牧大学军事医学研究所基因工程研究室，吉林 长春 130062)
, 百拇医药
李进(第一军医大学组胚教研室，广东 广州 510515)
参考文献
[1] Hogan B, Costantini F, Lacy E. “ Nanipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual.” 1stedition[M]. New York:Cold Spring Harbor Laboratory, 1986, 153～9.
[2] Gregoriadis G, Allison AC. Liposome in Biologic Systems[M]. New York:John Wiley and Sons, 1980, 45～8.
[3] Felgner P L, Gadek T R, Holm N et al. Lipofection: A highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 87:7413～4.
, 百拇医药
[4] Behr J P, Demeneix B. Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86: 6982～6.
[5] Bachiller D, Schellander K, Peli J et al. Liposome-mediated DNA uptake by sperm cells[J]. Mol Reprod and Dev, 1991, 30:194～200.
[6] Nakanishi A, Iritani A. Gene transfer in the chicken by sperm-mediated methods[J]. Mol Reprod Dev, 1993, 36(2): 258～61.
, 百拇医药
[7] Rottmann OJ, Antes R, Hoefer P et al. Liposome mediated gene transfer via spermatozoa into avian egg cells[J]. Anim Bread Genet, 1992, 109:64～7.
[8] Nabel G J, Chang AE, Nabel EG et al. Immunotherapy for cancer by di-rect gene transfer into tumors[J].Hum Gene Ther, 1994, 5(1): 57～77.
[9] Farhood H, Gerbina N, Huang L. The role of dioleoyl phosphatidy letha-nolamine in cationic liposome mediated gene transfer[J].Biochim Biophys Acta. 1995, 1235(2): 289～95.
, 百拇医药
[10] Wrobel I, Collins D. Fusion of cationic liposomes with mammalian cells occurs after endocytosis[J]. Biochim Biophys Acta. 1995,1235(2): 296～304.
[11] Felgner J H, KumarR, Sridhar CN et al. Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formula-tions[J]. J Biol Chem, 1994, 269(4): 2550～61.
1999-06-14, http://www.100md.com
单位：黄伟民(广州军区157医院肿瘤科)；赖良学(解放军农牧大学军事医学研究所基因工程研究室，吉林 长春 130062)；乔桂林(解放军农牧大学军事医学研究所基因工程研究室，吉林 长春 130062)；岳军明(解放军农牧大学军事医学研究所基因工程研究室，吉林 长春 130062)
关键词：脂质体；精子；转基因动物；胚胎细胞
第一军医大学学报000308 摘要：目的 为探索精子作为外源基因的载体建立转基因小鼠的可行性。 方法 我们从性成熟小鼠的输精管及部分附睾管中取出精子，与阳离子脂质体包裹的DNA混合孵育之后将其注入超排卵小鼠的阴道内，48 h后收集II细胞期胚胎细胞。结果 (1) 精子可转染上外源DNA，转染率达53%；(2) 转染有外源DNA的精子可使II细胞期胚胎携带上外源基因，携带率为11.5%。结论 小鼠输精管及附睾管内的精子可被脂质体包裹的外源DNA转染并可作为载体将此外源DNA带入早期胚胎。
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中图分类号: Q571；Q461 文献标识码：A 文章编号：1000-2588 (2000)-03-0216-03
Transfection of mouse sperms in vitro with foreign gene mediated by liposome
HUANG Wei-min1, LAI Liang-xue2, QIAO Gui-lin2, YUE Jun-ming1, AN Jing2, WANG Kai2, FU Dian-guo2, YIN Zhen2, LI Jin1
(1Department of Histology and Embryology, First Military Medical University, Guangzhou 510510, China; 2Department of Genetic Engineering, Institute of Military Medicine, University of Agriculture and Animal Sciences of PLA, Changchun 130062, China)
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Abstract: Objective To explore the feasibility of sperms used as carriers of foreign gene for generating transgenic mice. Methods The sperms were taken from the vas deferens and ductus epididymidis of mature mice, incubated with foreign plasmid DNA covered by liposome and injected into the vagina of super-ovulated female mice. Forty hours later the 2-cell embryos were collected for test. Results The results showed that: (1) The sperms could be transfected by foreign DNA and the ratio of transfection was 53%; (2) The 2-cell embryos could carry foreign DNA from the sperms transfected and the frequency of carrying was 11.5%. Conclusion Sperms from mouse vas deferens and ductus epididymidis can be transfected by foreign DNA covered by liposome and can be used as the vehicle to carry the foreign DNA into early embryo.
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Key words: liposomes; sperm; transgenic animals; embryo
随着分子生物学与胚胎技术的不断发展，将基因导入早期胚胎培育转基因动物已经由可能变为现实。目前建立转基因动物最常用的方法仍然是经典的受精卵显微注射法[1]，但这一方法存在诸多不足之处，如所需的仪器设备昂贵、技术要求高、成功率低等。因此，人们试图找到一种简单、有效和广泛适用的方法，用于将外源基因导入任意种类动物的基因组中。长期以来脂质体都被用来向活细胞内转染各类分子[2]，但很少用于转染核酸。20世纪80年代末出现了新一代的脂质体，这类脂质体主要由阳离子脂类构成[3,4] 。阳离子脂类与带负电荷的核酸分子相互作用，将核酸包裹在内部，而被覆的脂类外表层含阳性电荷，可与带阴性电荷的细胞膜融合并释放出内裹的核酸分子。这类新型脂质体已被证明在转染DNA上是十分有效的。我们利用这种新型脂质体包裹质粒DNA转染小鼠精子后通过人工受精，收获II细胞期胚胎，检测II细胞期胚胎携带外源DNA的情况，以验证脂质体在转染外源DNA方面的作用，为今后进一步以此方法生产转基因动物打下基础。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 昆明纯系小鼠，雌雄各10只。
1.1.2 外源基因 t-PA cDNA的PCR扩增产物(地高辛随机引物法标记，长约300 bp)。
1.1.3 试剂 脂质体 Lipofectin(美国Life Technologies 公司生产)、地高辛抗体-碱性磷酸酶复合物(1:50 000)、 显色液：10 ml 缓冲液Ⅲ(Tris-HCl 100 mmol/L；NaCl 100 mmol/L；MgCl2 50 mmol/L； pH 9.5，20℃)中，加入45 μl NBT，35 μl X-磷酸盐溶液、缓冲液Ⅰ：Tris-HCl 100 mmol/L；NaCl 150 mmol/L；pH 7.5(20℃)、缓冲液Ⅳ：Tris-Hcl 10 mmol/L；EDTA 1 mmol/L；pH 8.0 (20℃)、DMEM培养液
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1.2 方法
1.2.1 转染液配制 外源基因 1 μl (1.7 g/L)、DMEM 10 μl、脂质体1 μl。室温静置30 min。
1.2.2 小鼠精子的采集及转染 取性成熟有授精能力的小鼠，单独饲养3 d以上。将小鼠断颈处死，局部消毒，腹下正中切开，拉出睾丸、附睾及输精管，在输精管近膀胱端处剪断，挤出输精管及附睾管内的精液，每侧约能挤出10～20 μl。与转染液混合作用30 min。
1.2.3 精子活力评估 取与转染液作用前及作用后的精液各2 μl，各用20 μl 生理盐水稀释后，血球计数板上计数不活动精子数。
1.2.4 小鼠人工受精 取人工超排卵母鼠，846合剂(解放军农牧大学生产)腹腔注射0.05～0.1 μl，麻醉后备用；用200 μl 加样头吸起与转染液作用的精液，注入上述母鼠的阴道内，将母鼠倒悬30 min。
, 百拇医药
1.2.5 小鼠胚胎细胞的获得 48 h后将人工受精母鼠断颈处死，剪取输卵管解剖，显微镜下将固定在微量注射器上的毛细玻璃管插入输卵管伞，推动微量注射器内的DMEM液，冲出胚胎细胞。
1.2.6转染精子的地高辛标记物染色 取与转染液作用后的精液2 μl，PBS 200倍稀释后，500 r/min离心5 min，弃上清，重复3次。DNase I酶37℃作用30 min，再重复上述洗涤后，用PBS调精子浓度达1×106个/mm3，滴片，空气干燥，4%多聚甲醛固定10 min； SSC，10 min 洗片2次；缓冲液Ⅰ冲洗5 min；0.5%鲑鱼精蛋白封阻剂(w/w)封闭30 min； 缓冲液Ⅰ洗片15 min；滴加地高辛单抗-碱性磷酸酶复合物，室温作用30 min；缓冲液Ⅰ洗片15 min×2；缓冲液Ⅲ中平衡2 min；显色液中显色20 min～1 h；缓冲液Ⅳ中终止反应5 min；蒸馏水冲洗，空气干燥，甘油明胶封片。
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1.2.7 胚胎细胞的地高辛标记物染色 在显微操作仪上，用毛细玻璃管将胚胎细胞在PBS 中反复吹吸冲洗数遍后，吸起胚胎细胞，滴于涂有15%乳白胶的载玻片上，空气干燥；4%多聚甲醛/PBS (pH 7.0)固定；余下操作同1.2.6。
2 结果
2.1 精子转染前后的活力
用血球计数板计数精子转染前后的不活动精子数，计数500个精子，以评估精子的活力。精子细胞转染前的不活动精子数为11.5%；精子细胞转染后的不活动精子数为12.5%；两者相差不显著。结果显示：本方法采集的精子具有良好的活力；转染液对精子的活力不造成明显影响。
2.2 脂质体介导的外源基因在精子的转染效果
转染液作用后的精子经反复洗涤、DNase I酶消化后，洗脱掉表面附着的外源DNA，经地高辛标记物染色，计数500个精子，阳性染色为53%。阴性对照为精子与不加外源DNA的转染液作用，地高辛标记物染色，阳性染色为1.5%，属非特异染色。
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2.3 细胞期胚胎细胞携带外源DNA的检测
从3只经人工受精的母鼠身上获得98个胚胎细胞，其中II细胞期胚胎细胞为78个，单个细胞(未受精卵细胞)8个，畸形胚胎细胞12个。地高辛标记物染色78个II细胞期胚胎中有9个呈现阳性颗粒。从1只经超排卵后与正常公鼠交配后24 h的母鼠中获得32个胚胎细胞，其中II细胞期胚胎细胞为30个，另有2个畸形细胞。地高辛标记物染色未见阳性颗粒。结果显示：本方法可以使胚胎细胞携带上外源基因，携带率为11.5%(9/78)。
3 讨论
本实验结果表明，通过脂质体将外源DNA转染入精子后，精子可作为载体将外源基因导入胚胎细胞，Daniel 等人[5] 在体外用脂质体处理小鼠附睾内的精子后，在共聚焦显微镜下，他们发现有80%的精子头部携带有外源基因，并且部分是在精子核内或在精子核周围。在我们的实验中也显示有53%的精子携带有外源DNA。Niknishi等[6] 报道，用脂质体包裹的外源基因处理鸡的精子后，在精子的整个头部区域可检测到外源基因的存在，阳性率达51.6%，并且这些精子表现出正常的受精能力，受精率可达67%。Rottmann等人[7]研究发现，在没有脂质体介导的情况下，鸡精子与外源基因共孵育后，经Southern印迹杂交检测，精子不含外源DNA。Danial 等人也发现，精子单纯地与外源基因共孵育后，绝大部分的外源基因仅仅是附于精子细胞的膜上，经DNA酶作用后绝大部分脱失。
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本实验的目的是为了证实精子作为载体，是否可将外源DNA转染入胚胎细胞。为了便于检测，我们直接用目的基因(tPA)的PCR扩增产物(约300 bp)，以随机引物法标记地高辛作为外源基因，因此在样本的检测时，就可以省去探针与外源基因杂交等的一些操作步骤，而直接用地高辛标记物显色即可。
我们使用的脂质体(lipofectin)由2, 3- 二油酰氧丙基- 1- 溴化三甲铵(DOTMA)与二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)按1:1(w/w)溶于除菌过滤水中而成。其核心成份DOTMA中含带正电荷的4价铵，可与带负电荷的DNA结合成复合物。DOPE为中性磷脂，它并不与DNA结合，但可包围在阳离子脂质- DNA复合物外形成微团或脂质体，一方面能稳定阳离子脂质双分子层，另一方面可通过降低内体(endosome)膜的稳定性促进DNA由内体转入细胞质[8～10] ，因此DOPE是最佳转染所不可缺少的。关于阳离子脂质体与细胞的相互作用，目前认为有3种模式：(1)脂质体与细胞的融合或内体的去稳定；(2)脂质体与质膜的直接融合；(3)脂质- DNA复合物穿过细胞膜进入细胞质，然后迁移进入细胞核[11] 。然而目前尚无证据支持任何一种模式。
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综上所述，我们的实验结果提示：(1)用阳离子脂质体-DNA复合物处理小鼠精子后可使其转染上外源基因；(2)转染后的精子通过人工受精可以使II细胞期胚胎携带外源基因。这一实验的成功将为我们进一步用此方法生产转基因小鼠打下基础。
国家863资助项目(Z21-04-04)
黄伟民(1960-)，男，山东莱阳人，1999年毕业于第一军医大学，博士，讲师
作者单位:安靓(第一军医大学组胚教研室，广东 广州 510515)
王凯(解放军农牧大学军事医学研究所基因工程研究室，吉林 长春 130062)
付殿国(解放军农牧大学军事医学研究所基因工程研究室，吉林 长春 130062)
殷震(解放军农牧大学军事医学研究所基因工程研究室，吉林 长春 130062)
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李进(第一军医大学组胚教研室，广东 广州 510515)
参考文献
[1] Hogan B, Costantini F, Lacy E. “ Nanipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual.” 1stedition[M]. New York:Cold Spring Harbor Laboratory, 1986, 153～9.
[2] Gregoriadis G, Allison AC. Liposome in Biologic Systems[M]. New York:John Wiley and Sons, 1980, 45～8.
[3] Felgner P L, Gadek T R, Holm N et al. Lipofection: A highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 87:7413～4.
, 百拇医药
[4] Behr J P, Demeneix B. Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86: 6982～6.
[5] Bachiller D, Schellander K, Peli J et al. Liposome-mediated DNA uptake by sperm cells[J]. Mol Reprod and Dev, 1991, 30:194～200.
[6] Nakanishi A, Iritani A. Gene transfer in the chicken by sperm-mediated methods[J]. Mol Reprod Dev, 1993, 36(2): 258～61.
, 百拇医药
[7] Rottmann OJ, Antes R, Hoefer P et al. Liposome mediated gene transfer via spermatozoa into avian egg cells[J]. Anim Bread Genet, 1992, 109:64～7.
[8] Nabel G J, Chang AE, Nabel EG et al. Immunotherapy for cancer by di-rect gene transfer into tumors[J].Hum Gene Ther, 1994, 5(1): 57～77.
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, 百拇医药
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