脱氢表雄酮诱导多囊卵巢综合征动物模型的研究
作者：张晓薇 邝健全 曾爱群 刘慧姝
单位：张晓薇(广州医学院第一附属医院 妇产科，广州 510120)；邝健全(中山医科大学孙逸仙纪念医院 妇产科)；曾爱群(广州医学院第一附属医院 妇产科，广州 510120)；刘慧姝(广州医学院第一附属医院 妇产科，广州 510120)
关键词：脱氢表雄酮；多囊卵巢综合征；动物模型
广州医学院学报000305
提要 目的：研究脱氢表雄酮(DHEA)诱导SD幼年雌性大鼠多囊卵巢综合征(PCOS)动物模型的卵巢形态学及性激素变化，同时探讨其与胰岛素抵抗方面的关系。方法：以DHEA皮下注射23日龄SDⅡ级雌性大鼠,分别观察卵巢体重、光镜(HE染色)及透视电镜改变，测定糖耐量、血清胰岛素、E2、T、P、PRL、FSH、LH水平以及卵巢颗粒细胞在体外不同刺激状态下(空白、FSH、IGF-1及FSH+IGF-1)培养液中E2的含量。结果：卵巢重量实验组显著高于对照组(P<0.05)。实验组卵巢呈多囊样改变，有 70%(14/20)的卵巢未见黄体形成，而对照组仅占15%(3/20)。卵泡直径显微测量实验组闭锁卵泡平均直径明显大于对照组(P<0.05)。实验组血清T、E2和空腹血糖水平明显高于对照组(P值分别为<0.001、<0.05、<0.05)。空腹及服糖后2h血胰岛素水平非常显著高于对照组(P<0.001)。空腹血胰岛素与空腹血糖乘积的倒数(1/FINS×FGC)非常显著高于对照组(P<0.001)。卵巢颗粒细胞体外培养，其基础E2分泌量实验组明显大于对照组(P<0.05)，两组颗粒细胞分别按不同组别加入FSH、IGF-1及FSH+IGF-1 后，其E2分泌量均非常显著大于空白组(P<0.001)。结论：DHEA诱导SD幼年雌性大鼠PCOS动物模型卵巢病理改变及血内分泌改变与PCOS病人相似，并存在胰岛素抵抗现象，是较理想的PCOS模型。
, http://www.100md.com
中图分类号 文献标识码：A 文章编号：1008-1836(2000)03-0014-05
The Study of Rat Polycystic Ovarian Syndrome (PCOS)
Model Induced by Dehydroeplandrosterone (DHEA)
Zhang Xiaowei,Kuang Jianquan,Zheng Aiqun,Liu Huizhu
(Department of Obstetrics and Gynecology,The First Affiliated Hospital
of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510120)
, http://www.100md.com
Objective: To investigate the morphologic and hormonal changes in the ovarium of polycystic ovarian syndrome (PCOS) rat model induced by dehydroeplandrosterone(DHEA),and the relationship between PCOS and insulin resistance. Methods: 23-day-old female SD rats were randomly divided into two groups. The rats in group 1 were injected daily (s.c) with DHEA for up to 20 days and the rats in group 2 injected with oil at the same time. Ovarian weight, serum insulin levels and sex hormon levels in rat blood of both groups were determined . Oral glucose tolerance tests,light microscopic and electronic microscopic examine were performed. The contents of estradiol granulosa cell in culture medium under the condition with or without FSH or/and insulin growth factor-Ⅰ (IGF-Ⅰ) were measured. Results : The ovarian weight in group 1 was higher than that in group 2(P<0.05). The ovaria in group 1 showed multiple follicular cysts ，and the ratio of follicular cysts to normal follicle was significantly increased .70%(14/20) of the ovaria in group 1 had no corpus luteum,compared to 15%(3/20) in group 2. The diameter of atretic follicles determined under microscopy in group 1 was greater than that in group 2(P<0.05).The serum testeosterone and etrasdiol concentration were significantly higher in group 1 than those in group 2 (P<0.001 and P<0.05 respectively),so as the fasting serum glucose (P<0.05)and fasting serum insulin (P<0.001).The value of 1/FINS×FGC was significantly higher in group 1 than that in group 2 (P<0.001).The basic estradiol levels were higher in the granulosa cell culture medium of group 1 than those in group 2 (P<0.05), and the estradiol levels were significantly increased under the stimulation by FSH or /and IGF-Ⅰ in two groups. Conclusion: the morphologic and hormonal changes of the ovarium in the dehydroeplandrosterone (DHEA)-induced rat PCOS model were similar to those of the patients with PCOS,and the insulin resistance was observed. It was proved to be a ideal PCOS amimal model.
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Key words DHEA;PCOS; Animal model.
多囊卵巢综合征(PCOS)是引起年轻妇女月经稀少及闭经最常见的原因。目前病因不甚清楚。建立PCOS动物模型对其病因的基础研究以及指导临床的诊断和治疗有深远的意义。由于大部分PCOS患者在青春期出现症状，而且在青春期前就出现血脱氢表雄酮(DHEA)和脱氢表雄酮硫酸盐(DHEAS)的升高。所以，推测DHEA升高可能是导致PCOS的一个主要原因。Anderson.E.Lee.GY.[1,2]等以DHEA 皮下注射诱导SD雌性大鼠PCOS动物模型的研究，表现为双侧卵巢多囊样改变，血性激素改变与PCOS病人相似。但该模型与胰岛素抵抗的关系尚未清楚。本课题对DHEA诱导SD幼年雌性大鼠PCOS动物模型进行系统的研究，同时探讨其与胰岛素抵抗方面的关系。
1 材料和方法
1.1 动物模型的建立
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选择23日龄幼年SD清洁雌性大鼠，每窝平均分为两组, 实验组及对照组各20只,均在21日龄断奶，喂以颗粒饲料。实验组皮下注射DHEA 6mg/100g体重/天+0.2ml注射用油剂，连续注射20天，建立DHEA诱导的大鼠PCOS模型。对照组在同期皮下注射0.2ml/天注射用油剂。
1.2 血清激素水平测定
两组大鼠均于注药后20天次晨称体重，抽取眼眶静脉血，放射免疫测定(RIA)法测定血E2、T、P、PRL、FSH、LH。药盒由天津德普公司提供。
1.3 葡萄糖耐量试验(OGTT)和胰岛素测定
在注药第20d的晚上8时开始禁食，次日上午8时按3g葡萄糖/kg体重的剂量灌服50%葡萄糖液，在灌糖后分别在0、30、60、120min鼠尾尖取血，测定血清胰岛素及血糖，血糖测定采用GOP-POD终点法，在M10自动分析仪中测定。胰岛素RIA药盒由天津德普分司提供。
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1.4 卵巢颗粒细胞培养
两组大鼠缺血致死，消毒下解剖双侧卵巢，在解剖显微镜下去除卵巢表面的脂肪组织及包膜，称量卵巢重量，并用8号针灸针在解剖显微镜下刺破小卵泡，用DMEM/F12培养液(由GIBCO分司提供)洗涤颗粒细胞 2次，离心条件800r/min离心10min，培养液为DMEM/F12培养液+10%胎牛血清100U/ml青霉素、100ug/ml硫酸链霉素。将颗粒细胞调整至1×105/ml,台盼蓝试验观察细胞活性,要求活细胞达95%。将颗粒细胞接种于96孔培养板中，每孔200μl(2×104细胞/well)，置37℃、5%CO2培养箱培养， 培养24h后观察细胞贴壁后,改为无血清培养，并加入睾酮1nmol/ml(由美国Sigma公司提供)为合成雌二醇底物,每组大鼠的颗粒细胞分为4小组,(1)空白组(无刺激剂);(2)FSH组:加入FSH 30ng/ml(由Serono公司提供)；(3)IGF-1组：加入IGF-1 50ng/ml(由Gibco分司提供)；(4)FSH+IGF-1组：加入FSH 30ng/ml及IGF-1 50ng/ml，置37℃、5%CO2箱培养24h后收集培养液，置-20℃待测E2含量。该实验重复7次。
, 百拇医药
1.5 卵巢形态学观察
观察两组大鼠双侧卵巢大体解剖及光镜(HE染色)改变，每只大鼠一侧卵巢各进行发育卵泡、闭锁卵泡及囊状卵泡直径的显微测量(测量各卵泡中两个最大垂直直径，取平均值则为该卵泡直径)。各类型卵泡的镜下诊断参照James等[3]诊断标准。部分卵巢作透视电镜检查。
1.6 数据处理
OGTT中血糖反应曲线下总面积及胰岛素敏感性参照杜敏联等[4]计算，计量资料均以
±s表示,按t检验分析。计数资料按χ2检验。
2 结果
2.1 卵巢及子宫形态学观察
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2.1.1 卵巢大体解剖学改变：卵巢重量实验组为0.033±0.009 g/卵巢，显著高于对照组(0.027±0.008 g/卵巢)，P<0.05。对照组卵巢色泽红，实验组卵巢表面较苍白，体积增大，见较多囊状扩张的卵泡。
2.1.2 卵巢光镜检查：对照组卵巢镜下见多个黄体及不同发育阶段的卵泡，卵泡内颗粒细胞呈多层，多为8～9层。实验组卵巢见囊性扩张的卵泡增多，其卵泡内卵母细胞或放射冠消失，颗粒细胞层数减少至2～3层。囊状扩张卵泡比例明显增加(实验组为44/168, 26.19%；对照组为5/122 ,4.10%；P<0.05)。卵泡膜层增厚,( 平均卵泡膜层厚为 0.023±0.007μm ;对照组为0.015±0.009μm,P<0.05 ), 卵巢闭锁及囊状扩张卵泡内外泡膜细胞层分层明显。有 70%(14/20)的卵巢未见黄体形成，而对照组仅占15%(3/20)。见图1、2(见封三)。两组卵泡直径比较，发育卵泡平均直径两组间无显著差异，实验组闭锁卵泡平均直径明显大于对照组，P<0.05(见表1)。
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表1 两组大鼠卵泡显微测量卵泡平均直径比较 分组
总卵泡数
发育卵泡平均直径(μm)
(±s)
闭锁卵泡平均直径(μm)
(±s)
实验组
168
0.182±0.066
0.265±0.177*
, 百拇医药
对照组
122
0.221±0.12
0.206±0.092
*与对照组比较P<0.05
2.1.3 卵巢电镜检查 对照组卵巢卵泡颗粒细胞内含中量的线粒体、微管、粗面及滑面内质网和脂滴。实验组靠卵泡壁的颗粒细胞呈柱状排列，卵泡腔内颗粒细胞和间质细胞胞浆内有丰富的滑面内质网、线粒体和大量脂滴。泡膜细胞含有丰富的表面内质网、脂肪颗粒和线粒体。
2.1.4 血清性激素测定 实验组及对照组血清性激素水平比较：实验组血清T浓度非常显著地高于对照组(P<0.001)；血清E2浓度显著高于对照组(P<0.05)。血清FSH、LH和PRL浓度与对照组比较均值偏低，无显著差异。P浓度均值稍升高，与对照组比较无显著差异(见表2)。
, 百拇医药
表2 实验组及对照组血清性激素水平比较 组别
n
T(mol/L)
E2(mol/L)
FSH(iu/L)
LH(iu/L)
PRL(mol/L)
P(mol/L)
实验组
19
3.507 ±1.770※
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0.156±0.168
1.065±0.69
1.560±1.178
7.243±4.267
对照组
19
0.092± 0.037
37.495±32.308
0.182±0.162
1.471±1.424
, 百拇医药
1.775±1.431
6.540±3.749
*P<0.001；※※P<0.052.1.5 OGTT及胰岛素水平测定结果
实验组空腹血糖明显高于对照组,P<0.05。实验组空腹及服糖后2h血胰岛素水平非常显著高于对照组，P<0.001。空腹及服糖后2h胰岛素敏感率(血胰岛素与血糖比值INS/GC)非常显著高于对照组，P<0.001。(见表3、表4)
表3 两组OGTT结果比较 组别
n
血糖(mmol/L)
空腹
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1h
2h
实验组
15
4.542±0.586※
7.820±1.170
6.619±1.021
对照组
15
4.029 ±0.360
7.441±2.096
6.053±1.369
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※P<0.001；※※P<0.05表4 两组血胰岛素水平比较 组别
n
血胰岛素(mU/L)
INS/GC
空腹
2h
空腹
2h
实验组
15
22.055±7.993※※
, 百拇医药
28.506±10.220※※
4.898±1.649※
4.364±1.622
对照组
15
12.697±8.005
11.121±4.433
3.129±1.938
1.912±0.855
※P<0.001；※※P<0.052.1.6 IGF-1与FSH对两组卵巢颗粒细胞分泌E2的影响
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卵巢颗粒细胞基础E2分泌量实验组明显高于对照组(P<0.05)，两组颗粒细胞分别加入FSH及FSH+IGF-1 后，其E2分泌量均非常显著大于空白组(P<0.001);加入IGF-1后E2分泌量显著大于空白组(P<0.05),而同一种刺激剂下，实验组与对照组卵巢颗粒细胞E2分泌量无显著差异，见表5。
表5 FSH、IGF-1对两组大鼠卵巢颗粒细胞E2生成的影响
n
空白对照(ng/ml)
FSH(ng/ml)
IGF-1(ng/ml)
FSH+IGF-1(ng/ml)
实验组
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7
120.83±35.99※
3446.02±1664.24▲▲
249.25±46.85▲
3622.56±1429.50▲▲
对照组
7
63.19±24.85
4655.01±984.892▲▲
194.07±93.78▲
, 百拇医药
4667.29±982.80▲▲
※与对照组比较:P<0.05,▲▲与空白对照比较:P<0.001, ▲与空白对照比较:P<0.053 讨论
3.1 PCOS病人的发病机制目前尚不清楚。Anderson等[2]通过动态观察其超微结构改变发现DHEA首先引起卵母细胞及透明带的消失，随后囊状卵泡形成。本研究发现经DHEA皮下注射20天后大鼠卵巢重量明显增加，囊性扩张的卵泡比例也明显增大，其卵泡内卵母细胞或放射冠消失，颗粒细胞层数减少至2-3层，卵泡直径显微测量,实验组发育卵泡平均直径与对照组无显著差异；闭锁卵泡平均直径明显大于对照组，P<0.05。说明DHEA诱发卵巢卵泡发生闭锁及囊状扩张卵泡改变，与PCOS病人卵巢病理改变相似。DHEA在卵泡膜细胞内可能经△5途径促进睾酮的合成，使血睾酮水平升高[2]。本研究发现实验组卵巢闭锁及囊状扩张卵泡内外卵泡膜细胞层分层明显且明显增厚，电镜下见泡膜细胞的超微结构含有丰富的表面内质网、脂肪颗粒和线粒体，形成典型的产生类固醇激素的细胞。这种病理改变是与外周血T、E2浓度的升高是相平衡的。说明高雄激素血症可能是诱导卵巢多囊样病理改变的直接原因。
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3.2 PCOS病人中有40-50%同时存在着高胰岛素血症和OGTT异常，称为胰岛素抵抗。目前已公认胰岛素抵抗与PCOS的发病相关。本研究发现DHEA诱导SD雌性幼年大鼠PCOS动物模型存在明显的高胰岛素血症，与PCOS病人相似，但胰岛素抵抗与高雄激素血症之间的因果关系尚未清楚。Wu XK 等报导：PCOS病人经卵巢楔形切除术后血雄激素降低，结果胰岛素抵抗状态有改善。说明血雄激素水平的升高与胰岛素抵抗的程度相关[5]。本实验发现：实验组血雄激素水平升高，同时伴有高胰岛素血症及空腹血糖升高。说明高雄激素血症可能是导致胰岛素抵抗的一个直接原因。
3.3 尽管PCOS病人卵泡内存在高浓度的雄烯二酮和具有生物活性的FSH，但卵泡内的雌激素生物合成仍是低的。Zhaoping Yan 等[6]PCOS病人卵巢颗粒细胞体外培养发现其分泌E2功能正常，且对FSH的刺激反应正常。推测卵泡液中可能存在着抑制FSH功能的因子，这些抑制因子阻碍了FSH对卵巢颗粒细胞的刺激作用[7]。本研究发现两组卵巢颗粒细胞在FSH与IGF-1刺激后，E2分泌水平均无显著差异。表明该动物模型卵巢颗粒细胞E2分泌功能正常，且对FSH与IGF-1的刺激反应正常。但实验组卵巢颗粒细胞E2基础分泌水平升高的原因可能是：(1)DHEA刺激早卵泡期卵巢颗粒细胞黄素化[2]，使E2分泌量增高；(2)DHEA诱导SD雌性幼年大鼠PCOS动物模型中血胰岛素水平升高，高水平的胰岛素刺激颗粒细胞生成E2。其机制仍待进一步探讨。
, 百拇医药
综上所述，DHEA诱导SD幼年雌性大鼠PCOS动物模型卵巢病理改变及血内分泌改变与PCOS病人相似，并存在着明显的高胰岛素血症，是较理想的PCOS动物模型。
图1 正常对照组大鼠卵巢病理切片
图2 多囊卵巢综合征大鼠模型卵巢病理切片
基金项目：广东省医学科研项目(A1999236)。
作者简介：张晓薇，女(1956.6-)，硕士，副教授。研究方向：妇科内分泌。
参考文献
[1] Lee.MT, Anderson.E and Lee GY. Changes in ovarian morphology and serum hormones in the rat after treatment with dehydroepiandrosterone [J]. Anat.Rec. 1991;231:185～192.
, http://www.100md.com
[2]Anderson.E, Lee.GY, O`brien.K.Polycystic ovarian condition in the dehydroepiandrosterone-treated rat model: hyperandrogenism and the resumption of meiosis are major initial events associated with cystogenesis of antral follicles[J].Anat.Rec, 1997;249:44～53.
[3]杜敏联，胡少眉. 单纯性肥胖儿童胰岛素抵抗与血脂及血压间的相关性[J]. 中华内分泌代谢杂志.1996;12(1):48～49
[4]James R,Brawer , Michael munoz,et al. Development of the polycystic ovarian condition in the estradiol valerate-treated rat[J]. Biology of reproduction,1986;35:647～655.
, http://www.100md.com
[5]Wu XK,Su , YH,Xhang. Wedge resection to impove insulin resistance in polycystic ovary syndrome :a study among Chinese women[J]. Br J Obstet Gynecol， 1996,103:822～825.
[6]Zhaoping Yan, Gloria YL ,et al. Influence of dehydroepiandrosterone on the expression of insulin-like growth factor-1during cystogenesis in polycystic rat ovaries and in cultured rat granulosa cells[J].Biology of reproduction， 1997;57:1509～1516
[7]Nestle JE, Jakubowicz DJ, Vargas AF, et al .Insulin stimulates testosterone Biosynthesis by human thecal cells from women with polycystic ovary syndrome by activating its own receptor and using inositolglycan mediators as the signal transduction system.[J]J Clin Endocrinol Metab, 1998；83:2001～2005.
(收稿：2000-01-23), 百拇医药
单位：张晓薇(广州医学院第一附属医院 妇产科，广州 510120)；邝健全(中山医科大学孙逸仙纪念医院 妇产科)；曾爱群(广州医学院第一附属医院 妇产科，广州 510120)；刘慧姝(广州医学院第一附属医院 妇产科，广州 510120)
关键词：脱氢表雄酮；多囊卵巢综合征；动物模型
广州医学院学报000305
提要 目的：研究脱氢表雄酮(DHEA)诱导SD幼年雌性大鼠多囊卵巢综合征(PCOS)动物模型的卵巢形态学及性激素变化，同时探讨其与胰岛素抵抗方面的关系。方法：以DHEA皮下注射23日龄SDⅡ级雌性大鼠,分别观察卵巢体重、光镜(HE染色)及透视电镜改变，测定糖耐量、血清胰岛素、E2、T、P、PRL、FSH、LH水平以及卵巢颗粒细胞在体外不同刺激状态下(空白、FSH、IGF-1及FSH+IGF-1)培养液中E2的含量。结果：卵巢重量实验组显著高于对照组(P<0.05)。实验组卵巢呈多囊样改变，有 70%(14/20)的卵巢未见黄体形成，而对照组仅占15%(3/20)。卵泡直径显微测量实验组闭锁卵泡平均直径明显大于对照组(P<0.05)。实验组血清T、E2和空腹血糖水平明显高于对照组(P值分别为<0.001、<0.05、<0.05)。空腹及服糖后2h血胰岛素水平非常显著高于对照组(P<0.001)。空腹血胰岛素与空腹血糖乘积的倒数(1/FINS×FGC)非常显著高于对照组(P<0.001)。卵巢颗粒细胞体外培养，其基础E2分泌量实验组明显大于对照组(P<0.05)，两组颗粒细胞分别按不同组别加入FSH、IGF-1及FSH+IGF-1 后，其E2分泌量均非常显著大于空白组(P<0.001)。结论：DHEA诱导SD幼年雌性大鼠PCOS动物模型卵巢病理改变及血内分泌改变与PCOS病人相似，并存在胰岛素抵抗现象，是较理想的PCOS模型。
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中图分类号 文献标识码：A 文章编号：1008-1836(2000)03-0014-05
The Study of Rat Polycystic Ovarian Syndrome (PCOS)
Model Induced by Dehydroeplandrosterone (DHEA)
Zhang Xiaowei,Kuang Jianquan,Zheng Aiqun,Liu Huizhu
(Department of Obstetrics and Gynecology,The First Affiliated Hospital
of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510120)
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Objective: To investigate the morphologic and hormonal changes in the ovarium of polycystic ovarian syndrome (PCOS) rat model induced by dehydroeplandrosterone(DHEA),and the relationship between PCOS and insulin resistance. Methods: 23-day-old female SD rats were randomly divided into two groups. The rats in group 1 were injected daily (s.c) with DHEA for up to 20 days and the rats in group 2 injected with oil at the same time. Ovarian weight, serum insulin levels and sex hormon levels in rat blood of both groups were determined . Oral glucose tolerance tests,light microscopic and electronic microscopic examine were performed. The contents of estradiol granulosa cell in culture medium under the condition with or without FSH or/and insulin growth factor-Ⅰ (IGF-Ⅰ) were measured. Results : The ovarian weight in group 1 was higher than that in group 2(P<0.05). The ovaria in group 1 showed multiple follicular cysts ，and the ratio of follicular cysts to normal follicle was significantly increased .70%(14/20) of the ovaria in group 1 had no corpus luteum,compared to 15%(3/20) in group 2. The diameter of atretic follicles determined under microscopy in group 1 was greater than that in group 2(P<0.05).The serum testeosterone and etrasdiol concentration were significantly higher in group 1 than those in group 2 (P<0.001 and P<0.05 respectively),so as the fasting serum glucose (P<0.05)and fasting serum insulin (P<0.001).The value of 1/FINS×FGC was significantly higher in group 1 than that in group 2 (P<0.001).The basic estradiol levels were higher in the granulosa cell culture medium of group 1 than those in group 2 (P<0.05), and the estradiol levels were significantly increased under the stimulation by FSH or /and IGF-Ⅰ in two groups. Conclusion: the morphologic and hormonal changes of the ovarium in the dehydroeplandrosterone (DHEA)-induced rat PCOS model were similar to those of the patients with PCOS,and the insulin resistance was observed. It was proved to be a ideal PCOS amimal model.
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Key words DHEA;PCOS; Animal model.
多囊卵巢综合征(PCOS)是引起年轻妇女月经稀少及闭经最常见的原因。目前病因不甚清楚。建立PCOS动物模型对其病因的基础研究以及指导临床的诊断和治疗有深远的意义。由于大部分PCOS患者在青春期出现症状，而且在青春期前就出现血脱氢表雄酮(DHEA)和脱氢表雄酮硫酸盐(DHEAS)的升高。所以，推测DHEA升高可能是导致PCOS的一个主要原因。Anderson.E.Lee.GY.[1,2]等以DHEA 皮下注射诱导SD雌性大鼠PCOS动物模型的研究，表现为双侧卵巢多囊样改变，血性激素改变与PCOS病人相似。但该模型与胰岛素抵抗的关系尚未清楚。本课题对DHEA诱导SD幼年雌性大鼠PCOS动物模型进行系统的研究，同时探讨其与胰岛素抵抗方面的关系。
1 材料和方法
1.1 动物模型的建立
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选择23日龄幼年SD清洁雌性大鼠，每窝平均分为两组, 实验组及对照组各20只,均在21日龄断奶，喂以颗粒饲料。实验组皮下注射DHEA 6mg/100g体重/天+0.2ml注射用油剂，连续注射20天，建立DHEA诱导的大鼠PCOS模型。对照组在同期皮下注射0.2ml/天注射用油剂。
1.2 血清激素水平测定
两组大鼠均于注药后20天次晨称体重，抽取眼眶静脉血，放射免疫测定(RIA)法测定血E2、T、P、PRL、FSH、LH。药盒由天津德普公司提供。
1.3 葡萄糖耐量试验(OGTT)和胰岛素测定
在注药第20d的晚上8时开始禁食，次日上午8时按3g葡萄糖/kg体重的剂量灌服50%葡萄糖液，在灌糖后分别在0、30、60、120min鼠尾尖取血，测定血清胰岛素及血糖，血糖测定采用GOP-POD终点法，在M10自动分析仪中测定。胰岛素RIA药盒由天津德普分司提供。
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1.4 卵巢颗粒细胞培养
两组大鼠缺血致死，消毒下解剖双侧卵巢，在解剖显微镜下去除卵巢表面的脂肪组织及包膜，称量卵巢重量，并用8号针灸针在解剖显微镜下刺破小卵泡，用DMEM/F12培养液(由GIBCO分司提供)洗涤颗粒细胞 2次，离心条件800r/min离心10min，培养液为DMEM/F12培养液+10%胎牛血清100U/ml青霉素、100ug/ml硫酸链霉素。将颗粒细胞调整至1×105/ml,台盼蓝试验观察细胞活性,要求活细胞达95%。将颗粒细胞接种于96孔培养板中，每孔200μl(2×104细胞/well)，置37℃、5%CO2培养箱培养， 培养24h后观察细胞贴壁后,改为无血清培养，并加入睾酮1nmol/ml(由美国Sigma公司提供)为合成雌二醇底物,每组大鼠的颗粒细胞分为4小组,(1)空白组(无刺激剂);(2)FSH组:加入FSH 30ng/ml(由Serono公司提供)；(3)IGF-1组：加入IGF-1 50ng/ml(由Gibco分司提供)；(4)FSH+IGF-1组：加入FSH 30ng/ml及IGF-1 50ng/ml，置37℃、5%CO2箱培养24h后收集培养液，置-20℃待测E2含量。该实验重复7次。
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1.5 卵巢形态学观察
观察两组大鼠双侧卵巢大体解剖及光镜(HE染色)改变，每只大鼠一侧卵巢各进行发育卵泡、闭锁卵泡及囊状卵泡直径的显微测量(测量各卵泡中两个最大垂直直径，取平均值则为该卵泡直径)。各类型卵泡的镜下诊断参照James等[3]诊断标准。部分卵巢作透视电镜检查。
1.6 数据处理
OGTT中血糖反应曲线下总面积及胰岛素敏感性参照杜敏联等[4]计算，计量资料均以
±s表示,按t检验分析。计数资料按χ2检验。2 结果
2.1 卵巢及子宫形态学观察
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2.1.1 卵巢大体解剖学改变：卵巢重量实验组为0.033±0.009 g/卵巢，显著高于对照组(0.027±0.008 g/卵巢)，P<0.05。对照组卵巢色泽红，实验组卵巢表面较苍白，体积增大，见较多囊状扩张的卵泡。
2.1.2 卵巢光镜检查：对照组卵巢镜下见多个黄体及不同发育阶段的卵泡，卵泡内颗粒细胞呈多层，多为8～9层。实验组卵巢见囊性扩张的卵泡增多，其卵泡内卵母细胞或放射冠消失，颗粒细胞层数减少至2～3层。囊状扩张卵泡比例明显增加(实验组为44/168, 26.19%；对照组为5/122 ,4.10%；P<0.05)。卵泡膜层增厚,( 平均卵泡膜层厚为 0.023±0.007μm ;对照组为0.015±0.009μm,P<0.05 ), 卵巢闭锁及囊状扩张卵泡内外泡膜细胞层分层明显。有 70%(14/20)的卵巢未见黄体形成，而对照组仅占15%(3/20)。见图1、2(见封三)。两组卵泡直径比较，发育卵泡平均直径两组间无显著差异，实验组闭锁卵泡平均直径明显大于对照组，P<0.05(见表1)。
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表1 两组大鼠卵泡显微测量卵泡平均直径比较 分组
总卵泡数
发育卵泡平均直径(μm)
(
±s)闭锁卵泡平均直径(μm)
(
±s)实验组
168
0.182±0.066
0.265±0.177*
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对照组
122
0.221±0.12
0.206±0.092
*与对照组比较P<0.05
2.1.3 卵巢电镜检查 对照组卵巢卵泡颗粒细胞内含中量的线粒体、微管、粗面及滑面内质网和脂滴。实验组靠卵泡壁的颗粒细胞呈柱状排列，卵泡腔内颗粒细胞和间质细胞胞浆内有丰富的滑面内质网、线粒体和大量脂滴。泡膜细胞含有丰富的表面内质网、脂肪颗粒和线粒体。
2.1.4 血清性激素测定 实验组及对照组血清性激素水平比较：实验组血清T浓度非常显著地高于对照组(P<0.001)；血清E2浓度显著高于对照组(P<0.05)。血清FSH、LH和PRL浓度与对照组比较均值偏低，无显著差异。P浓度均值稍升高，与对照组比较无显著差异(见表2)。
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表2 实验组及对照组血清性激素水平比较 组别
n
T(mol/L)
E2(mol/L)
FSH(iu/L)
LH(iu/L)
PRL(mol/L)
P(mol/L)
实验组
19
3.507 ±1.770※
, http://www.100md.com 80.625±63.538※※
0.156±0.168
1.065±0.69
1.560±1.178
7.243±4.267
对照组
19
0.092± 0.037
37.495±32.308
0.182±0.162
1.471±1.424
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1.775±1.431
6.540±3.749
*P<0.001；※※P<0.052.1.5 OGTT及胰岛素水平测定结果
实验组空腹血糖明显高于对照组,P<0.05。实验组空腹及服糖后2h血胰岛素水平非常显著高于对照组，P<0.001。空腹及服糖后2h胰岛素敏感率(血胰岛素与血糖比值INS/GC)非常显著高于对照组，P<0.001。(见表3、表4)
表3 两组OGTT结果比较 组别
n
血糖(mmol/L)
空腹
, http://www.100md.com
1h
2h
实验组
15
4.542±0.586※
7.820±1.170
6.619±1.021
对照组
15
4.029 ±0.360
7.441±2.096
6.053±1.369
, http://www.100md.com
※P<0.001；※※P<0.05表4 两组血胰岛素水平比较 组别
n
血胰岛素(mU/L)
INS/GC
空腹
2h
空腹
2h
实验组
15
22.055±7.993※※
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28.506±10.220※※
4.898±1.649※
4.364±1.622
对照组
15
12.697±8.005
11.121±4.433
3.129±1.938
1.912±0.855
※P<0.001；※※P<0.052.1.6 IGF-1与FSH对两组卵巢颗粒细胞分泌E2的影响
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卵巢颗粒细胞基础E2分泌量实验组明显高于对照组(P<0.05)，两组颗粒细胞分别加入FSH及FSH+IGF-1 后，其E2分泌量均非常显著大于空白组(P<0.001);加入IGF-1后E2分泌量显著大于空白组(P<0.05),而同一种刺激剂下，实验组与对照组卵巢颗粒细胞E2分泌量无显著差异，见表5。
表5 FSH、IGF-1对两组大鼠卵巢颗粒细胞E2生成的影响
n
空白对照(ng/ml)
FSH(ng/ml)
IGF-1(ng/ml)
FSH+IGF-1(ng/ml)
实验组
, http://www.100md.com
7
120.83±35.99※
3446.02±1664.24▲▲
249.25±46.85▲
3622.56±1429.50▲▲
对照组
7
63.19±24.85
4655.01±984.892▲▲
194.07±93.78▲
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4667.29±982.80▲▲
※与对照组比较:P<0.05,▲▲与空白对照比较:P<0.001, ▲与空白对照比较:P<0.053 讨论
3.1 PCOS病人的发病机制目前尚不清楚。Anderson等[2]通过动态观察其超微结构改变发现DHEA首先引起卵母细胞及透明带的消失，随后囊状卵泡形成。本研究发现经DHEA皮下注射20天后大鼠卵巢重量明显增加，囊性扩张的卵泡比例也明显增大，其卵泡内卵母细胞或放射冠消失，颗粒细胞层数减少至2-3层，卵泡直径显微测量,实验组发育卵泡平均直径与对照组无显著差异；闭锁卵泡平均直径明显大于对照组，P<0.05。说明DHEA诱发卵巢卵泡发生闭锁及囊状扩张卵泡改变，与PCOS病人卵巢病理改变相似。DHEA在卵泡膜细胞内可能经△5途径促进睾酮的合成，使血睾酮水平升高[2]。本研究发现实验组卵巢闭锁及囊状扩张卵泡内外卵泡膜细胞层分层明显且明显增厚，电镜下见泡膜细胞的超微结构含有丰富的表面内质网、脂肪颗粒和线粒体，形成典型的产生类固醇激素的细胞。这种病理改变是与外周血T、E2浓度的升高是相平衡的。说明高雄激素血症可能是诱导卵巢多囊样病理改变的直接原因。
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3.2 PCOS病人中有40-50%同时存在着高胰岛素血症和OGTT异常，称为胰岛素抵抗。目前已公认胰岛素抵抗与PCOS的发病相关。本研究发现DHEA诱导SD雌性幼年大鼠PCOS动物模型存在明显的高胰岛素血症，与PCOS病人相似，但胰岛素抵抗与高雄激素血症之间的因果关系尚未清楚。Wu XK 等报导：PCOS病人经卵巢楔形切除术后血雄激素降低，结果胰岛素抵抗状态有改善。说明血雄激素水平的升高与胰岛素抵抗的程度相关[5]。本实验发现：实验组血雄激素水平升高，同时伴有高胰岛素血症及空腹血糖升高。说明高雄激素血症可能是导致胰岛素抵抗的一个直接原因。
3.3 尽管PCOS病人卵泡内存在高浓度的雄烯二酮和具有生物活性的FSH，但卵泡内的雌激素生物合成仍是低的。Zhaoping Yan 等[6]PCOS病人卵巢颗粒细胞体外培养发现其分泌E2功能正常，且对FSH的刺激反应正常。推测卵泡液中可能存在着抑制FSH功能的因子，这些抑制因子阻碍了FSH对卵巢颗粒细胞的刺激作用[7]。本研究发现两组卵巢颗粒细胞在FSH与IGF-1刺激后，E2分泌水平均无显著差异。表明该动物模型卵巢颗粒细胞E2分泌功能正常，且对FSH与IGF-1的刺激反应正常。但实验组卵巢颗粒细胞E2基础分泌水平升高的原因可能是：(1)DHEA刺激早卵泡期卵巢颗粒细胞黄素化[2]，使E2分泌量增高；(2)DHEA诱导SD雌性幼年大鼠PCOS动物模型中血胰岛素水平升高，高水平的胰岛素刺激颗粒细胞生成E2。其机制仍待进一步探讨。
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综上所述，DHEA诱导SD幼年雌性大鼠PCOS动物模型卵巢病理改变及血内分泌改变与PCOS病人相似，并存在着明显的高胰岛素血症，是较理想的PCOS动物模型。
图1 正常对照组大鼠卵巢病理切片
图2 多囊卵巢综合征大鼠模型卵巢病理切片
基金项目：广东省医学科研项目(A1999236)。
作者简介：张晓薇，女(1956.6-)，硕士，副教授。研究方向：妇科内分泌。
参考文献
[1] Lee.MT, Anderson.E and Lee GY. Changes in ovarian morphology and serum hormones in the rat after treatment with dehydroepiandrosterone [J]. Anat.Rec. 1991;231:185～192.
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[2]Anderson.E, Lee.GY, O`brien.K.Polycystic ovarian condition in the dehydroepiandrosterone-treated rat model: hyperandrogenism and the resumption of meiosis are major initial events associated with cystogenesis of antral follicles[J].Anat.Rec, 1997;249:44～53.
[3]杜敏联，胡少眉. 单纯性肥胖儿童胰岛素抵抗与血脂及血压间的相关性[J]. 中华内分泌代谢杂志.1996;12(1):48～49
[4]James R,Brawer , Michael munoz,et al. Development of the polycystic ovarian condition in the estradiol valerate-treated rat[J]. Biology of reproduction,1986;35:647～655.
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[5]Wu XK,Su , YH,Xhang. Wedge resection to impove insulin resistance in polycystic ovary syndrome :a study among Chinese women[J]. Br J Obstet Gynecol， 1996,103:822～825.
[6]Zhaoping Yan, Gloria YL ,et al. Influence of dehydroepiandrosterone on the expression of insulin-like growth factor-1during cystogenesis in polycystic rat ovaries and in cultured rat granulosa cells[J].Biology of reproduction， 1997;57:1509～1516
[7]Nestle JE, Jakubowicz DJ, Vargas AF, et al .Insulin stimulates testosterone Biosynthesis by human thecal cells from women with polycystic ovary syndrome by activating its own receptor and using inositolglycan mediators as the signal transduction system.[J]J Clin Endocrinol Metab, 1998；83:2001～2005.
(收稿：2000-01-23), 百拇医药