从人肝细胞文库中克隆Fas cDNA
作者：杨宗琪 赵明才 冯莉 任碧轩 敬保迁 李仁
单位：川北医学院分子生物学研究所，四川南充 637007
关键词：Fas cDNA；探针；基因克隆技术；杂交
川北医学院学报000303 摘 要：为获取人Fas cDNA，以探索Fas的功能作用，本文采用高滴度D ig- Fas cDNA探针噬菌斑影印杂交筛选技术，从人肝细胞cDNA文库(HL-cDNA)中获得多个F as cDNA克隆。
中图分类号：R392.12 文献标识码 ：A 文章编号：1005-3697(2000)03-0006-02
Cloning of fas cDNA from human liver cDNA library
, 百拇医药
YANG Zhong-qi,ZHAO Ming-cai,FONG Li,REN Bi-xuan,JING Bao-qian,LI Ren
(Department of Molecular Biology,North Sichuan Medical College，Nanchong,Sichuan,637007,China)
Abstract:To get the Human Fas cDNA and investigate the functi on of Fas (CD95), the higt titer dig-Fas cDNA probes and phage plaques hybridiza tion technique were used to get a few Fas cDNA clones, from human liver cDNA lib rary.
Key words:fas cDNA;probe;gene;cloning;hybridization
, 百拇医药
凋亡是受基因控制的，不同于细胞坏死的自主性生理性细胞死亡 过程。其在维持机体自身稳定过程中起着非常重要的负调节作用。参与了胚胎发生、组织塑 型、造血调控、发育、衰老等重要生理过程。被称作“死亡分子”或“自 身基因”的Fas分子是与凋亡相关的细胞表面重要蛋白分子，其可通过与Fas配体(Fasl)结 合，启动细胞凋亡信号，导致细胞自杀。有研究表明Fas表达异常(减少、缺失、增高或出 现可溶性Fas分子等)见于肿瘤、AIDS、自身免疫性疾病中。为了进一步研究Fas分子及其Fa sl，并为制备抗Fas McAb准备Fas Ag，我们克隆了Fas cDNA。[1-4]
1 材料与方法
1.1 材料：人肝细胞cDNA-λTriplEX溶解物与XL1-blue购于Clontech，Taq和10×PC R缓冲液购于华西医科大学利康实业公司生物技术部，地高辛化学连结和查见试剂盒(Dig-C hem-Link Labeling and detection set cat.No 1836463)、dNTP和尼龙膜是BEHRINGer Ma nnheim产品，Fas特异性引物由Cybersyn公司合成，LB培养基、底层琼脂、顶层琼脂以及各 种杂交试剂及DIg标记和查见按人肝cDNA文库试剂盒说明和文献[5]配制。
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1.2 方 法
1.2.1 制备dig-Fas探针：PCR从HL-cDNA中扩增Fas cDNA，用T- easy vector克隆Fas cDNA PCR扩增产物，转染JM109，经耐药性标记和Lacz基因插入失活筛选，快速细胞裂解法、E C ORI酶切片段分析和PCR扩增鉴定获阳性转化子，纯化后用地高辛化学连结法标记Fas - cDNA ，制备dig-Fas探针[6]。
1.2.2 克隆Fas cDNA
1.2.2.1 扩增XL1-blue宿主菌：从LB平板上取1个XL1-blue菌落接种于含10 mMol MgSO4， 0.2%麦芽糖，150μg/ml四环素(TC)水溶解的LB培养液中，于37 ℃摇床振荡培养过夜，20 00转/min离心15min，弃上清，按1/2的量加入10 mMol MgSO4液混悬菌液(OD600=2.0)。
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1.2.2.2 铺板：取200μl此菌液加入用1×人噬菌体稀释缓冲液(0.1M Nacl，0.01%明胶， 0.01M MgSO4.7H2O，0.035M Tris-HCL PH7.5)稀释至3×102/μl的HL- cDNA溶解物1μl， 混匀，39℃孵育20min，加入已溶解并于51℃保温的顶层琼脂3ml(含3μl TC)中，翻转混 匀，立即铺于39℃预温的底层琼脂平板上，旋转铺平，待冷却后置37℃培养过夜。
1.2.2.3 用影印法将噬菌斑转移至尼龙膜上：待平板上出现明显噬菌斑后，置4℃孵育1h ，取出将已用紫外线消毒的尼龙膜贴于平板表面，2min后取出，贴第二张尼龙膜，4min 后取出 (两张尼龙膜均做相同的定位标记)，于变性液中作用5min，中和液中作用5min ，2×SSC洗涤5min，紫外线交联固定3min。
1.2.2.4 杂交：将两张膜放入杂交管内，加TE浸湿后加标准杂交液5～10ml置56℃杂交仪内 预杂交3h，分别于各管内加入5 -10μl加热变性的dig-Fas(大)与dig-Fas(小)cDNA探 针(5 -25ng)，于56℃继续杂交过夜。取出膜，用2×SSC 0.1% SDS于室温洗两次，每次15 min，0.1×SSC 0.1% SDS 60℃摇床洗两次,每次15min,用缓冲液I平衡1min，放入缓冲液 Ⅱ中于室温封闭50min，再置含抗Dig-AP(1：5000稀释)缓冲液Ⅱ中孵育40min(室温) 。取出膜，用含0.3% Tween20的缓冲液Ⅰ洗涤两次，每次15min，缓冲液Ⅲ平衡2min，加 显色液(缓冲液Ⅲ 9.8ml+NBT/BCIP 200μl)于室温避光显色30min至3h，用水冲洗杂 交膜终止反应，观察结果。
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1.2.3 Fas cDNA克隆初步鉴定
1.2.3.1 DNA凝胶电泳鉴定Fas cDNA：按试剂盒说明扩增经反复克隆筛选出的单个阳 性噬斑，裂解、提取DNA，作琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。
1.2.3.2 PCR扩增试验鉴定Fas cDNA：以反复克隆筛选出的单个阳性噬斑为模板， 用F as特异性引物，按文献[5]的方法作PCR鉴定。
2 结 果
2.1 dig-Fas探针的制备及鉴定结果见文献[6]，已获得两种分子大小不同 的高滴度dig-Fas cDNA 探针，分别命名为dig-Fas(大)与dig-Fas(小)。
2.2 Fas cDNA克隆结果(图1)：用两种Fas探针与噬菌斑经反复5次影印杂交、筛选，获 得典型阳性噬斑，作为待鉴定Fas cDNA。图1中a：第一次影印杂交结果，出现数个阳性噬斑 ；b：第三次影印杂交结果，出现较多阳性噬斑；c：第五次影印杂交结果，出现大量强阳性 噬斑。
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2.3 Fas cDNA克隆鉴定结果：
2.3.1 DNA电泳结果(如图2)：可观察到第5、9、10泳道出现单一条带。
2.1 PCR鉴定结果(如图3)：可观测到第3泳道出现一分子大小为1.0Kb阳性条带，表明 已获Fas cDNA阳性克隆。
图1 影印杂交图
图2 DNA凝胶电冰图
图3 PCR扩增图
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3 讨 论
不能正常进行细胞凋亡过程的个体，常伴发癌症、自身免疫性疾病和病毒感染性 疾病。Fas与Fasl结合及其诱导传导，在诱发细胞凋亡、维持自身稳定和保持内环境 平衡方 面起着重要作用，对Fas/Fasl的深入研究必将对肿瘤等疾病的机理、防治起推动作用[ 7.8]。Fas cDNA的克隆，既有助于对Fas/Fasl的进一步研究，又为制备抗Fas McAb提供 了材料。 dig-Fas探针的制备也为Fas/Fasl与疾病关系的研究奠定了物质基础，Fas cDNA的克隆也为 进一步探索其在细胞内的表达及作用奠定了物质基础。
基金项目：四川省卫生厅科研基金资助，960007号。
作者简介：杨宗琪(1953—)，男，南充市人，讲师，主要从事免疫学、 微生物学与分子生物学研究。
参考文献：
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[1] 陈俊，郭坤元，王金锐.APO - 1/Fas(CD95)分子研究进展[J ].国外医学免疫学分册，1996，19(2)：61
[2] 文希良，朱锡华.Fasl与TNF引起凋亡的研究进展[J].国外医学免疫学 分册，1999，22(5)：241
[3] 张华，蔡德鸿.Fas/Fasl与移植免疫[J].国外医学免疫学分册，1998， 21(3)：130
[4] Marx C，Wolkersdorfer WG，Bornstein RS，A New View on Immune -Adre nal Interactions：Role for Fas and Fas Ligands，Neuroimmunodulation，1998；5：5[5] 李永明，赵玉琪，等.实用分子生物学方法手册[M].第 1版，北京：科学出版社，1998，P72
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[6] 唐恩洁，杨宗琪，赵明才，等.用人肝细胞cDNA文库制备dig-Fas探针[J ].川北医学院学报，2000，15(3)：1.
[7] 张兴明，蒋明，郑德生.细胞凋亡与系统性红斑狼疮[J].国外医学免疫 学分册，1998，21(3)：148.
[8] Whiteside LT ，Rabinowich H，The role of Fas/Fasl in Immunosuppres sion induced by human Tumours cancer，Immunol Immunother，1998；46：175
(收稿日期：2000-06-10), http://www.100md.com
单位：川北医学院分子生物学研究所，四川南充 637007
关键词：Fas cDNA；探针；基因克隆技术；杂交
川北医学院学报000303 摘 要：为获取人Fas cDNA，以探索Fas的功能作用，本文采用高滴度D ig- Fas cDNA探针噬菌斑影印杂交筛选技术，从人肝细胞cDNA文库(HL-cDNA)中获得多个F as cDNA克隆。
中图分类号：R392.12 文献标识码 ：A 文章编号：1005-3697(2000)03-0006-02
Cloning of fas cDNA from human liver cDNA library
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YANG Zhong-qi,ZHAO Ming-cai,FONG Li,REN Bi-xuan,JING Bao-qian,LI Ren
(Department of Molecular Biology,North Sichuan Medical College，Nanchong,Sichuan,637007,China)
Abstract:To get the Human Fas cDNA and investigate the functi on of Fas (CD95), the higt titer dig-Fas cDNA probes and phage plaques hybridiza tion technique were used to get a few Fas cDNA clones, from human liver cDNA lib rary.
Key words:fas cDNA;probe;gene;cloning;hybridization
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凋亡是受基因控制的，不同于细胞坏死的自主性生理性细胞死亡 过程。其在维持机体自身稳定过程中起着非常重要的负调节作用。参与了胚胎发生、组织塑 型、造血调控、发育、衰老等重要生理过程。被称作“死亡分子”或“自 身基因”的Fas分子是与凋亡相关的细胞表面重要蛋白分子，其可通过与Fas配体(Fasl)结 合，启动细胞凋亡信号，导致细胞自杀。有研究表明Fas表达异常(减少、缺失、增高或出 现可溶性Fas分子等)见于肿瘤、AIDS、自身免疫性疾病中。为了进一步研究Fas分子及其Fa sl，并为制备抗Fas McAb准备Fas Ag，我们克隆了Fas cDNA。[1-4]
1 材料与方法
1.1 材料：人肝细胞cDNA-λTriplEX溶解物与XL1-blue购于Clontech，Taq和10×PC R缓冲液购于华西医科大学利康实业公司生物技术部，地高辛化学连结和查见试剂盒(Dig-C hem-Link Labeling and detection set cat.No 1836463)、dNTP和尼龙膜是BEHRINGer Ma nnheim产品，Fas特异性引物由Cybersyn公司合成，LB培养基、底层琼脂、顶层琼脂以及各 种杂交试剂及DIg标记和查见按人肝cDNA文库试剂盒说明和文献[5]配制。
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1.2 方 法
1.2.1 制备dig-Fas探针：PCR从HL-cDNA中扩增Fas cDNA，用T- easy vector克隆Fas cDNA PCR扩增产物，转染JM109，经耐药性标记和Lacz基因插入失活筛选，快速细胞裂解法、E C ORI酶切片段分析和PCR扩增鉴定获阳性转化子，纯化后用地高辛化学连结法标记Fas - cDNA ，制备dig-Fas探针[6]。
1.2.2 克隆Fas cDNA
1.2.2.1 扩增XL1-blue宿主菌：从LB平板上取1个XL1-blue菌落接种于含10 mMol MgSO4， 0.2%麦芽糖，150μg/ml四环素(TC)水溶解的LB培养液中，于37 ℃摇床振荡培养过夜，20 00转/min离心15min，弃上清，按1/2的量加入10 mMol MgSO4液混悬菌液(OD600=2.0)。
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1.2.2.2 铺板：取200μl此菌液加入用1×人噬菌体稀释缓冲液(0.1M Nacl，0.01%明胶， 0.01M MgSO4.7H2O，0.035M Tris-HCL PH7.5)稀释至3×102/μl的HL- cDNA溶解物1μl， 混匀，39℃孵育20min，加入已溶解并于51℃保温的顶层琼脂3ml(含3μl TC)中，翻转混 匀，立即铺于39℃预温的底层琼脂平板上，旋转铺平，待冷却后置37℃培养过夜。
1.2.2.3 用影印法将噬菌斑转移至尼龙膜上：待平板上出现明显噬菌斑后，置4℃孵育1h ，取出将已用紫外线消毒的尼龙膜贴于平板表面，2min后取出，贴第二张尼龙膜，4min 后取出 (两张尼龙膜均做相同的定位标记)，于变性液中作用5min，中和液中作用5min ，2×SSC洗涤5min，紫外线交联固定3min。
1.2.2.4 杂交：将两张膜放入杂交管内，加TE浸湿后加标准杂交液5～10ml置56℃杂交仪内 预杂交3h，分别于各管内加入5 -10μl加热变性的dig-Fas(大)与dig-Fas(小)cDNA探 针(5 -25ng)，于56℃继续杂交过夜。取出膜，用2×SSC 0.1% SDS于室温洗两次，每次15 min，0.1×SSC 0.1% SDS 60℃摇床洗两次,每次15min,用缓冲液I平衡1min，放入缓冲液 Ⅱ中于室温封闭50min，再置含抗Dig-AP(1：5000稀释)缓冲液Ⅱ中孵育40min(室温) 。取出膜，用含0.3% Tween20的缓冲液Ⅰ洗涤两次，每次15min，缓冲液Ⅲ平衡2min，加 显色液(缓冲液Ⅲ 9.8ml+NBT/BCIP 200μl)于室温避光显色30min至3h，用水冲洗杂 交膜终止反应，观察结果。
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1.2.3 Fas cDNA克隆初步鉴定
1.2.3.1 DNA凝胶电泳鉴定Fas cDNA：按试剂盒说明扩增经反复克隆筛选出的单个阳 性噬斑，裂解、提取DNA，作琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。
1.2.3.2 PCR扩增试验鉴定Fas cDNA：以反复克隆筛选出的单个阳性噬斑为模板， 用F as特异性引物，按文献[5]的方法作PCR鉴定。
2 结 果
2.1 dig-Fas探针的制备及鉴定结果见文献[6]，已获得两种分子大小不同 的高滴度dig-Fas cDNA 探针，分别命名为dig-Fas(大)与dig-Fas(小)。
2.2 Fas cDNA克隆结果(图1)：用两种Fas探针与噬菌斑经反复5次影印杂交、筛选，获 得典型阳性噬斑，作为待鉴定Fas cDNA。图1中a：第一次影印杂交结果，出现数个阳性噬斑 ；b：第三次影印杂交结果，出现较多阳性噬斑；c：第五次影印杂交结果，出现大量强阳性 噬斑。
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2.3 Fas cDNA克隆鉴定结果：
2.3.1 DNA电泳结果(如图2)：可观察到第5、9、10泳道出现单一条带。
2.1 PCR鉴定结果(如图3)：可观测到第3泳道出现一分子大小为1.0Kb阳性条带，表明 已获Fas cDNA阳性克隆。
图1 影印杂交图
图2 DNA凝胶电冰图
图3 PCR扩增图
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3 讨 论
不能正常进行细胞凋亡过程的个体，常伴发癌症、自身免疫性疾病和病毒感染性 疾病。Fas与Fasl结合及其诱导传导，在诱发细胞凋亡、维持自身稳定和保持内环境 平衡方 面起着重要作用，对Fas/Fasl的深入研究必将对肿瘤等疾病的机理、防治起推动作用[ 7.8]。Fas cDNA的克隆，既有助于对Fas/Fasl的进一步研究，又为制备抗Fas McAb提供 了材料。 dig-Fas探针的制备也为Fas/Fasl与疾病关系的研究奠定了物质基础，Fas cDNA的克隆也为 进一步探索其在细胞内的表达及作用奠定了物质基础。
基金项目：四川省卫生厅科研基金资助，960007号。
作者简介：杨宗琪(1953—)，男，南充市人，讲师，主要从事免疫学、 微生物学与分子生物学研究。
参考文献：
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[1] 陈俊，郭坤元，王金锐.APO - 1/Fas(CD95)分子研究进展[J ].国外医学免疫学分册，1996，19(2)：61
[2] 文希良，朱锡华.Fasl与TNF引起凋亡的研究进展[J].国外医学免疫学 分册，1999，22(5)：241
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[4] Marx C，Wolkersdorfer WG，Bornstein RS，A New View on Immune -Adre nal Interactions：Role for Fas and Fas Ligands，Neuroimmunodulation，1998；5：5[5] 李永明，赵玉琪，等.实用分子生物学方法手册[M].第 1版，北京：科学出版社，1998，P72
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[6] 唐恩洁，杨宗琪，赵明才，等.用人肝细胞cDNA文库制备dig-Fas探针[J ].川北医学院学报，2000，15(3)：1.
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[8] Whiteside LT ，Rabinowich H，The role of Fas/Fasl in Immunosuppres sion induced by human Tumours cancer，Immunol Immunother，1998；46：175
(收稿日期：2000-06-10), http://www.100md.com