黑色素与新生隐球菌性脑膜炎的关系
作者：陈江汉 温海 赵瑾 徐红 廖万清
单位：陈江汉(第二军医大学长征医院皮肤科，上海 200003)；温海(第二军医大学长征医院皮肤科，上海 200003)；赵瑾(第二军医大学长征医院皮肤科，上海 200003)；赵瑾(第二军医大学长征医院皮肤科，上海 200003)；徐红(第二军医大学长征医院皮肤科，上海 200003)
关键词：黑色素；新生隐球菌
第二军医大学学报000325 【摘要】 目的：分析新生隐球菌黑色素生成的影响因素，初步探讨黑色素与新生隐球菌脑膜炎的相互关系。方法： 在含左旋多巴的液体培养液中孵育各种血清型新生隐球菌，分光光度计测定不同条件下液体的D值。结果： 新生隐球菌黑色素的产生受多种因素的影响，其中以氮源、葡萄糖和温度的影响最为明显。结论：脑组织中富含黑色素的底物儿茶酚胺类物质，新生隐球菌侵犯脑膜和脑组织似与黑色素无关。
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【中图分类号】 R 512.3 【文献标识码】 A 【文章编号】 0258-879X(2000)03-0278-03
Relationship between melanin and cereospinal menigitis of Cryptococcus neoformans
CHEN Jiang-Han WEN Hai ZHAO Jin XU Hong LIAO Wan-Qing
(Department of Dermatology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003， China)
【ABSTRACT】 Objective: To analyze the factors which affected the synthesis of melanin of of Cryptococcus neoformans and the mechanism of C. neoformans preferentially grew in the brains of human and experimental animals. Methods： In the DOPA liquid medium, C. neoformans of all serotype strains including capsule-deficient strain were incubated and the D value were monitored under various conditions with a Bausch and Lomb spectronic 20. Results： The production of C. neoformans melanin was affected by various factors, in which nitrogen source and glucose affected it obviously. Conclusion： The C. neoformans growth preferentially in brains of human and experimental animal is not because of catecholamines riched in brains.
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【KEY WORDS】 melanin; Cryptococcus neoformans▲
[Acad J Sec Mil Med Univ, 2000, 21(3): 278-280]
新生隐球菌容易侵犯脑膜和脑组织，长期以来一直认为与其能产生黑色素有关。因为脑中富含儿茶酚氨类物质，它们能被新生隐球菌催化生成黑色素，以此抵抗机体炎症细胞释放的氧化剂对菌体的破坏。本实验观察影响新生隐球菌黑色素生成的各种因素，初步探讨黑色素与新生隐球菌脑膜炎的相互关系。
1 材料和方法
1.1 菌株和试剂 菌株均来自中国医学真菌保藏管理中心隐球菌专业实验室，包括B93(血清A型)、B50(B型)、B40(C型)、B30(D型)，荚膜缺陷株及白念珠菌则均由E.S.Jacobson提供。所用试剂为左旋多巴(Sigma公司)、天冬氨酸(上海试剂三厂)、甘氨酸(上海试剂一厂)、KH2PO4，MgSO4.7H2O(上海试剂三厂)、葡萄糖、琼脂(Sigma公司)、(NH4)2SO4、酵母粉(Sigma公司)、肌酐(Sigma公司)和酪氨酸(Sigma公司)等。
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1.2 方法 从沙堡氏培养基斜面上挑取1环新生隐球菌株接种于10 ml YEG液体培养液中(2%葡萄糖, 2%酵母粉)，30℃孵育24 h，离心沉淀，100 ml N-培养液悬浮。N-培养液所含葡萄糖及氮源的浓度各不相同，其葡萄糖的浓度分别为0.05%，0.1%，0.2%，0.3%，0.5%；氮源及其浓度分别为(NH4)2SO4:0.5%；甘氨酸:0.7%；L-谷氨酸:0.1%；天冬氨酸:0.1%；设氮源为空白对照。培养液滤过消毒，4℃冰箱保存，1周内使用。培养物振荡培养(200 r/min)，30℃ 48 h，取5 ml离心沉淀，以0.5 ml 0.03 mol/L 柠檬酸缓冲液(pH 6.0)悬浮菌体，加2.7 ml左旋多巴溶液(以100 ml双蒸水溶解0.2 g左旋多巴，冰箱中避光保存)，再加0.8 ml 0.5 mol/L柠檬酸缓冲液(pH 6.0)，再加0.03 mol/L柠檬酸缓冲液至终体积4 ml。475 nm调整菌浓度，其合适的起始浓度为0.3左右，对照组包括2种，即只含缓冲液和底物或只含缓冲液和反应物，振荡培养，温度分别为25，30，37℃，间隔15 min测定菌浓度(475 nm)，绘制反应曲线。
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2 结 果
2.1 葡萄糖浓度与黑色素产量 我们挑选了新生隐球菌4种血清型A，B，C，D及荚膜缺陷的5株新生隐球菌作为代表株，不能产生黑色素的白念珠菌作为对照，并以天冬氨酸作为氮源，左旋多巴作为底物。因为在定性试验中，在25℃、葡萄糖浓度为0.05%时，天冬氨酸可以为绝大多数新生隐球菌包括荚膜缺陷株所利用而产生黑色素，而与咖啡酸等底物相比，新生隐球菌利用左旋多巴产生的黑色素更为明显，同时左旋多巴也是新生隐球菌合成黑色素的中间体。
所有受试菌株黑色素的产生均受葡萄糖浓度的调节，浓度越高，黑色素的产生越少，反之亦然，这与Wang等[1]的报道一致。荚膜缺陷菌株也是如此，而其中以B，C较为明显，对照菌株--白念珠菌则无黑色素的产生，最快者在加入左旋多巴液后1 min内即可见棕红色色素产生，后逐渐变黑，至60 min时达到最大，见图1。
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图1 葡萄糖浓度与黑色素产量的关系
Fig 1 Relationship between concentration of
glucose and production of melanin
Glucose concentration ○: 0.05%; ●: 0.1%;
□: 0.2%; ■: 0.3%; △: 0.5%
2.2 温度与黑色素产量 温度也会影响黑色素的产生，在以多巴为底物，天门冬氨酸为氮源，葡萄糖浓度为0.05%，pH为6.0的条件下，以25℃时产生的黑色素最多，30℃次之，37℃最少，受试菌株间无明显差别，见图2。尽管谷氨酸、硫酸铵等只能为某些血清型的隐球菌利用，如硫酸铵只能作为血清A型菌株的氮源，谷氨酸只能作为血清B型菌株的氮源等，但黑色素的产量与温度、葡萄糖浓度等有关并符合上述规律。黑色素的产生与氮源能否作为新生隐球菌的营养物无关，如肌酐可以作为新生隐球菌4种血清型的氮源，却不能促进其生长，而酪氨酸和甘氨酸既可作为产生黑色素的氮源，又可作为新生隐球菌的营养物。然而，即使在25℃，0.05%葡萄糖及提供合适氮源的条件下，如果缺乏左旋多巴等底物，各种血清型菌株及荚膜缺陷株均不能产生黑色素。
, 百拇医药
图2 温度与黑色素产量的关系
Fig 2 Relation between the melanin production of
C. neoformans and temperature
○: 25℃; ●: 30℃; □:37℃
3 讨 论
长期以来普遍认为新生隐球菌之所以容易侵犯脑膜和脑组织[3]，重要的原因是因为它能利用脑组织中富含的多巴胺等神经介质合成黑色素。因为新生隐球菌主要的毒性因素之一黑色素被认为有抗氧化剂的作用[1,6]，它能够中和炎症细胞释放的氧化剂，因而对菌株本身具有保护作用。而本文的体外实验并不支持该观点，新生隐球菌容易侵犯脑膜和脑组织可能存在有其他重要的机制，其依据如下：(1) 左旋多巴并非是新生隐球菌合成黑色素唯一的物质，还必须有天冬氨酸、酪氨酸等提供氮源，而脑组织中尽管富含多巴胺等神经递质，但不能为其提供丰富的氮源。(2) 该实验表明黑色素产量随温度的升高而降低，据此推断新生隐球菌在37℃时毒力应较弱，因此脑组织中新生隐球菌黑色素的产生将受到抑制，而37℃生长良好是新生隐球菌重要的毒性因子之一[2]。(3) 在浓度较高的葡萄糖环境里，新生隐球菌可以利用葡萄糖合成其荚膜，提高新生隐球菌毒性，然而所有受试菌株在高浓度葡萄糖条件下，黑色素的产生均受到抑制，又削弱了新生隐球菌的毒性。(4) 进一步的实验表明酪氨酸等尽管是新生隐球菌生长的营养物，但仍有不少菌株不能利用其合成黑色素，而肌酐等可以作为新生隐球菌合成黑色素的氮源，但不能成为其营养素，因此，在脑组织中生长良好的新生隐球菌可能并非是由于大脑中含有丰富的氮源，相反，不能在大脑中生长或生长不良的新生隐球菌[6]也并非是由于大脑中无法提供足够的氮源[5]。该实验中荚膜缺陷株能产生黑色素，不但验证了酚氧化酶存在于细胞膜上[4]，而且也说明荚膜缺陷株不能在脑组织中生长存在有其他的机制。■
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870658)
作者简介：陈江汉(1964-)，男(汉族)，主治医师，讲师
廖万清(第二军医大学长征医院皮肤科，上海 200003)
【参 考 文 献】
[1] Wang Y, Casadevall A. Susceptibility of melanizied and nonmelanizied Cryptococcus neoformans to nitrogen- and oxygen-derived oxidants[J]. Infect Immun，1994, 62(7)：3004-3007.
[2] Marion L, Woods II, Damon PE， et al. HIV combination therapy: partial immune restitution unmasking latent cryptococcal infection[J]. AIDS，1998, 12(12)：1491-1498.
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[3] Polacheck I, Platt Y, Aronovitch J. Catecholamines and verulence of Cryptococcus neoformans[J]. Infect Immun，1990, 58(9)：2919-2922.
[4] Emery H, Shelburne CP，Bowman JP, et al. Genetic study of oxygen resistance and melanization in Cryptococcus neoformans[J]. Infect Immun，1994, 62(12)：5694-5697.
[5] Wang Y, Casadevall A. Susceptibility of melanized and nonmelanized Cryptococcus neoformans to the melanin-binding compounds trifluoperazine and chloroquine[J]. Antimicrob Agents Chemother, 1996,40(3)：541-546.
[6] Nosanchuk JD, Casadevall A. Cellular charge of Cryptococcus neoformans ：contributions from the capsular polysaccharide, melanin, and monoclonal antibody binding[J]. Infect Immun，1997, 65(5)：1836-1841.
【收稿日期】 1999-09-25
【修回日期】 2000-01-10, 百拇医药
单位：陈江汉(第二军医大学长征医院皮肤科，上海 200003)；温海(第二军医大学长征医院皮肤科，上海 200003)；赵瑾(第二军医大学长征医院皮肤科，上海 200003)；赵瑾(第二军医大学长征医院皮肤科，上海 200003)；徐红(第二军医大学长征医院皮肤科，上海 200003)
关键词：黑色素；新生隐球菌
第二军医大学学报000325 【摘要】 目的：分析新生隐球菌黑色素生成的影响因素，初步探讨黑色素与新生隐球菌脑膜炎的相互关系。方法： 在含左旋多巴的液体培养液中孵育各种血清型新生隐球菌，分光光度计测定不同条件下液体的D值。结果： 新生隐球菌黑色素的产生受多种因素的影响，其中以氮源、葡萄糖和温度的影响最为明显。结论：脑组织中富含黑色素的底物儿茶酚胺类物质，新生隐球菌侵犯脑膜和脑组织似与黑色素无关。
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【中图分类号】 R 512.3 【文献标识码】 A 【文章编号】 0258-879X(2000)03-0278-03
Relationship between melanin and cereospinal menigitis of Cryptococcus neoformans
CHEN Jiang-Han WEN Hai ZHAO Jin XU Hong LIAO Wan-Qing
(Department of Dermatology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003， China)
【ABSTRACT】 Objective: To analyze the factors which affected the synthesis of melanin of of Cryptococcus neoformans and the mechanism of C. neoformans preferentially grew in the brains of human and experimental animals. Methods： In the DOPA liquid medium, C. neoformans of all serotype strains including capsule-deficient strain were incubated and the D value were monitored under various conditions with a Bausch and Lomb spectronic 20. Results： The production of C. neoformans melanin was affected by various factors, in which nitrogen source and glucose affected it obviously. Conclusion： The C. neoformans growth preferentially in brains of human and experimental animal is not because of catecholamines riched in brains.
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【KEY WORDS】 melanin; Cryptococcus neoformans▲
[Acad J Sec Mil Med Univ, 2000, 21(3): 278-280]
新生隐球菌容易侵犯脑膜和脑组织，长期以来一直认为与其能产生黑色素有关。因为脑中富含儿茶酚氨类物质，它们能被新生隐球菌催化生成黑色素，以此抵抗机体炎症细胞释放的氧化剂对菌体的破坏。本实验观察影响新生隐球菌黑色素生成的各种因素，初步探讨黑色素与新生隐球菌脑膜炎的相互关系。
1 材料和方法
1.1 菌株和试剂 菌株均来自中国医学真菌保藏管理中心隐球菌专业实验室，包括B93(血清A型)、B50(B型)、B40(C型)、B30(D型)，荚膜缺陷株及白念珠菌则均由E.S.Jacobson提供。所用试剂为左旋多巴(Sigma公司)、天冬氨酸(上海试剂三厂)、甘氨酸(上海试剂一厂)、KH2PO4，MgSO4.7H2O(上海试剂三厂)、葡萄糖、琼脂(Sigma公司)、(NH4)2SO4、酵母粉(Sigma公司)、肌酐(Sigma公司)和酪氨酸(Sigma公司)等。
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1.2 方法 从沙堡氏培养基斜面上挑取1环新生隐球菌株接种于10 ml YEG液体培养液中(2%葡萄糖, 2%酵母粉)，30℃孵育24 h，离心沉淀，100 ml N-培养液悬浮。N-培养液所含葡萄糖及氮源的浓度各不相同，其葡萄糖的浓度分别为0.05%，0.1%，0.2%，0.3%，0.5%；氮源及其浓度分别为(NH4)2SO4:0.5%；甘氨酸:0.7%；L-谷氨酸:0.1%；天冬氨酸:0.1%；设氮源为空白对照。培养液滤过消毒，4℃冰箱保存，1周内使用。培养物振荡培养(200 r/min)，30℃ 48 h，取5 ml离心沉淀，以0.5 ml 0.03 mol/L 柠檬酸缓冲液(pH 6.0)悬浮菌体，加2.7 ml左旋多巴溶液(以100 ml双蒸水溶解0.2 g左旋多巴，冰箱中避光保存)，再加0.8 ml 0.5 mol/L柠檬酸缓冲液(pH 6.0)，再加0.03 mol/L柠檬酸缓冲液至终体积4 ml。475 nm调整菌浓度，其合适的起始浓度为0.3左右，对照组包括2种，即只含缓冲液和底物或只含缓冲液和反应物，振荡培养，温度分别为25，30，37℃，间隔15 min测定菌浓度(475 nm)，绘制反应曲线。
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2 结 果
2.1 葡萄糖浓度与黑色素产量 我们挑选了新生隐球菌4种血清型A，B，C，D及荚膜缺陷的5株新生隐球菌作为代表株，不能产生黑色素的白念珠菌作为对照，并以天冬氨酸作为氮源，左旋多巴作为底物。因为在定性试验中，在25℃、葡萄糖浓度为0.05%时，天冬氨酸可以为绝大多数新生隐球菌包括荚膜缺陷株所利用而产生黑色素，而与咖啡酸等底物相比，新生隐球菌利用左旋多巴产生的黑色素更为明显，同时左旋多巴也是新生隐球菌合成黑色素的中间体。
所有受试菌株黑色素的产生均受葡萄糖浓度的调节，浓度越高，黑色素的产生越少，反之亦然，这与Wang等[1]的报道一致。荚膜缺陷菌株也是如此，而其中以B，C较为明显，对照菌株--白念珠菌则无黑色素的产生，最快者在加入左旋多巴液后1 min内即可见棕红色色素产生，后逐渐变黑，至60 min时达到最大，见图1。
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图1 葡萄糖浓度与黑色素产量的关系
Fig 1 Relationship between concentration of
glucose and production of melanin
Glucose concentration ○: 0.05%; ●: 0.1%;
□: 0.2%; ■: 0.3%; △: 0.5%
2.2 温度与黑色素产量 温度也会影响黑色素的产生，在以多巴为底物，天门冬氨酸为氮源，葡萄糖浓度为0.05%，pH为6.0的条件下，以25℃时产生的黑色素最多，30℃次之，37℃最少，受试菌株间无明显差别，见图2。尽管谷氨酸、硫酸铵等只能为某些血清型的隐球菌利用，如硫酸铵只能作为血清A型菌株的氮源，谷氨酸只能作为血清B型菌株的氮源等，但黑色素的产量与温度、葡萄糖浓度等有关并符合上述规律。黑色素的产生与氮源能否作为新生隐球菌的营养物无关，如肌酐可以作为新生隐球菌4种血清型的氮源，却不能促进其生长，而酪氨酸和甘氨酸既可作为产生黑色素的氮源，又可作为新生隐球菌的营养物。然而，即使在25℃，0.05%葡萄糖及提供合适氮源的条件下，如果缺乏左旋多巴等底物，各种血清型菌株及荚膜缺陷株均不能产生黑色素。
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图2 温度与黑色素产量的关系
Fig 2 Relation between the melanin production of
C. neoformans and temperature
○: 25℃; ●: 30℃; □:37℃
3 讨 论
长期以来普遍认为新生隐球菌之所以容易侵犯脑膜和脑组织[3]，重要的原因是因为它能利用脑组织中富含的多巴胺等神经介质合成黑色素。因为新生隐球菌主要的毒性因素之一黑色素被认为有抗氧化剂的作用[1,6]，它能够中和炎症细胞释放的氧化剂，因而对菌株本身具有保护作用。而本文的体外实验并不支持该观点，新生隐球菌容易侵犯脑膜和脑组织可能存在有其他重要的机制，其依据如下：(1) 左旋多巴并非是新生隐球菌合成黑色素唯一的物质，还必须有天冬氨酸、酪氨酸等提供氮源，而脑组织中尽管富含多巴胺等神经递质，但不能为其提供丰富的氮源。(2) 该实验表明黑色素产量随温度的升高而降低，据此推断新生隐球菌在37℃时毒力应较弱，因此脑组织中新生隐球菌黑色素的产生将受到抑制，而37℃生长良好是新生隐球菌重要的毒性因子之一[2]。(3) 在浓度较高的葡萄糖环境里，新生隐球菌可以利用葡萄糖合成其荚膜，提高新生隐球菌毒性，然而所有受试菌株在高浓度葡萄糖条件下，黑色素的产生均受到抑制，又削弱了新生隐球菌的毒性。(4) 进一步的实验表明酪氨酸等尽管是新生隐球菌生长的营养物，但仍有不少菌株不能利用其合成黑色素，而肌酐等可以作为新生隐球菌合成黑色素的氮源，但不能成为其营养素，因此，在脑组织中生长良好的新生隐球菌可能并非是由于大脑中含有丰富的氮源，相反，不能在大脑中生长或生长不良的新生隐球菌[6]也并非是由于大脑中无法提供足够的氮源[5]。该实验中荚膜缺陷株能产生黑色素，不但验证了酚氧化酶存在于细胞膜上[4]，而且也说明荚膜缺陷株不能在脑组织中生长存在有其他的机制。■
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870658)
作者简介：陈江汉(1964-)，男(汉族)，主治医师，讲师
廖万清(第二军医大学长征医院皮肤科，上海 200003)
【参 考 文 献】
[1] Wang Y, Casadevall A. Susceptibility of melanizied and nonmelanizied Cryptococcus neoformans to nitrogen- and oxygen-derived oxidants[J]. Infect Immun，1994, 62(7)：3004-3007.
[2] Marion L, Woods II, Damon PE， et al. HIV combination therapy: partial immune restitution unmasking latent cryptococcal infection[J]. AIDS，1998, 12(12)：1491-1498.
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[3] Polacheck I, Platt Y, Aronovitch J. Catecholamines and verulence of Cryptococcus neoformans[J]. Infect Immun，1990, 58(9)：2919-2922.
[4] Emery H, Shelburne CP，Bowman JP, et al. Genetic study of oxygen resistance and melanization in Cryptococcus neoformans[J]. Infect Immun，1994, 62(12)：5694-5697.
[5] Wang Y, Casadevall A. Susceptibility of melanized and nonmelanized Cryptococcus neoformans to the melanin-binding compounds trifluoperazine and chloroquine[J]. Antimicrob Agents Chemother, 1996,40(3)：541-546.
[6] Nosanchuk JD, Casadevall A. Cellular charge of Cryptococcus neoformans ：contributions from the capsular polysaccharide, melanin, and monoclonal antibody binding[J]. Infect Immun，1997, 65(5)：1836-1841.
【收稿日期】 1999-09-25
【修回日期】 2000-01-10, 百拇医药