端粒酶的医学应用前景与局限性
作者：童坦君 张宗玉
单位：(北京医科大学生物化学与分子生物学系 100083)
关键词：
中华医学杂志000303 端粒酶(又称端聚酶)是近年国内外医学界研究热点,对肿瘤防治、诊断、延缓衰老都有密切关系,其应用前景与局限性令人关注,对其作出客观而恰当的评价,对促进和指导端粒酶的应用研究具有重要意义。
染色体端区(telomere)，又称端粒。端区消失可能是人类细胞丧失复制能力的原因之一。端区是真核生物染色体末端的特殊结构。人类染色体末端普遍存在端区结构。各类细胞端区长度互有差异，体细胞的端区比生殖细胞短。人类染色体端区由进化上高度保守的DNA重复序列TTAGGG组成，由端粒酶合成。端区可保护染色体，防止染色体降解或端间融合。人类体细胞的端区随年龄增高而缩短, 导致染色体稳定性下降, 肿瘤发病率增高。
, http://www.100md.com
端粒酶是一种自带RNA引物的逆转录酶。生殖细胞、造血干细胞和肿瘤细胞含有较高的端粒酶活性。其活性可用聚合酶链反应(PCR)技术扩增其酶促反应产物(即TRAP法),然后辅以银染法测定之。端粒酶的存在使染色体末端得以完全复制。人类端粒酶催化亚基(hTRT)与RNA (hTR)皆已克隆成功,由此可用反义核酸或核酶(ribozyme)技术抑制其活性,诱导肿瘤细胞分化与凋亡[1]。
1.端粒酶活性能否作为肿瘤诊断和预后的依据？人类多种肿瘤细胞系有较强的端粒酶活性[2]，85%以上的原发性肿瘤有端粒酶活性。测定端粒酶活性能否用以鉴别肿瘤的良性和恶性，能否作为预后指标，这是医学界普遍关注的问题。由于一部分恶性肿瘤无端粒酶活性，所以测不到端粒酶活性并不意味着是良性。目前认为，用端粒酶活性与hTRT的mRNA水平难以衡量肿瘤的恶性度, 难以由此作出恰当预后[3]。除干细胞外,体细胞端粒酶活性极低。妊娠16周,人胚大多数组织的端粒酶即呈抑制状态。所以,不含造血细胞与生殖细胞的组织,如能测得端粒酶活性,则应高度怀疑其为恶性。可见端粒酶阴性虽难作为判断肿瘤良、恶性和预后的依据，但端粒酶阳性对恶性肿瘤的诊断仍有重要参考价值。
, 百拇医药
2.抑制端粒酶活性能否彻底抑制肿瘤? 由于绝大多数肿瘤细胞都具有端粒酶活性。因此，以抑制端粒酶活性为手段的基因疗法,对肿瘤有很强的广谱性和针对性。在理论上抑制端粒酶对正常体细胞基本无害，这是其突出优点。与此相关，不少学者甚至设想,不久可将端粒酶抑制剂列入抗肿瘤新药。但与肿瘤治疗的绝大多数策略相似,利用端粒酶的策略也有其弱点。
我室采用端粒酶反义核酸策略,将hTR反义重组病毒感染MCF-7乳腺癌细胞, 尽管该细胞存在原癌基因c-Ha-ras、c-erbB-2及抑癌基因Rb等异常，hTR反义重组病毒感染仍取得了明显抑癌效果,部分逆转了其恶性表型[4]。但值得注意的是,目前国内外的类似研究并未能完全抑制肿瘤,究其原因可能为：人类有些肿瘤并无端粒酶活性,其端区亦不缩短。Blasco等人揭示, 有些肿瘤并无端粒酶活性,是因为有另一延长端区机制(alternative mechanism for lengthening telomeres, ALT)的存在。小鼠细胞的永生化,恶性转化及肿瘤形成不需端粒酶参与,即是有ALT的缘故。所以要彻底抑制肿瘤,既要抑制端粒酶,还要抑制ALT。ALT机制可能是通过端区-端区重组方式进行的。这条端区延长的旁路究竟是如何形成的？这将是今后研究的重点。
, http://www.100md.com
此外，抑制端粒酶的策略用于肿瘤治疗,难免影响生殖细胞与造血干细胞。因为端粒酶对它们是必需的。有人认为小鼠体内端区延长主要依靠ALT机制，所以不太依赖端粒酶。然而用基因打靶术消除端粒酶基因后, 小鼠胚胎干细胞分裂次数仍大为下降。可见抑制端粒酶活性,对干细胞有不良影响。因此,在实施抑制端粒酶的策略时,宜提高对肿瘤的靶向性,以免损及生殖细胞与造血干细胞。在构建端粒酶反义重组载体时引入肿瘤组织特异启动子，或为减少其副作用的良策之一。
3.在人类体细胞引入端粒酶能否使细胞长生不老? 细胞衰老是老年病发病的基础。细胞衰老引起的细胞增殖能力下降是器官衰老、萎缩、机能减退的根本原因之一。 细胞是生物体的基本单位。神经、内分泌、免疫系统虽与生物整体的衰老密切相关,但单细胞生物,如酵母尚未分化形成以上系统,它们亦会衰老。可见细胞不仅是构成生物体的基本单位,也是生物衰老的基本单位。老年病的表现各异,但莫不以其相关细胞的衰老为基础。因而,延缓细胞衰老可为推迟老年带病期, 防治老年病带来新机遇。
, 百拇医药
体外培养的正常体细胞可传代数有限,可传代数与该种生物寿限和供体年龄有关。国际上常用成纤维细胞作为衰老研究模型,体外培养的正常人成纤维细胞最大增殖次数称为Hayflick极限，又称最大分裂次数。细胞供体年龄越大，可传代数越少;反之,肿瘤细胞属永生化细胞,在理论上可无限传代。
正常人二倍体成纤维细胞在体外培养时随代数的增加，细胞中的端区以一定速率缩短，DNA每复制一次，端区就缩短一段。人体中血细胞与皮肤细胞端区长度也随增龄而缩短。每增一岁,中国人外周血淋巴细胞端区长度平均缩短35 bp[5]，与国外资料 (33 bp)相近。男女略有差别，男性略快。人胚肺二倍体成纤维细胞，每增加一代龄，端区长度约缩短49 bp[6](国外资料为50 bp)。人二倍体成纤维细胞端区的TTAGGG重复顺序长约4 kb，衰老时其端区长度可降至2 kb，此时细胞出现传代培养(hayflick)极限，不再分裂。因此，人染色体端区长度与细胞衰老相关联，有可能是决定细胞增殖能力的计时器。
, http://www.100md.com
端区缩短为什么是人类细胞丧失复制能力的原因, 引起了细胞生长阻滞? 有人认为，人衰老细胞端区的缩短,恰似DNA损伤,引起了与DNA损伤相似的分子事件,导致细胞生长阻滞。衰老细胞常有染色体畸变现象，端区缩短或是其原因之一。
Bodnar等将人端粒酶催化亚单位cDNA转染人视网膜色素上皮细胞或成纤维细胞后,衰老速率减慢,体外倍增代数延长了约20代。所以，人类体细胞引入端粒酶似能“延年益寿”,但不能使细胞长生不老。Kiyone 等报道,使人上皮细胞永生化,既需引入端粒酶,还要使Rb和p16INK4等抑癌基因失活。可见有端粒酶活性只是人类体细胞长生不老的条件之一,如使其永生化,还应辅以其他条件。 此外,还应警惕引入端粒酶有促进癌变的可能性。
4.由端粒酶维持染色体端区长度,需要端锚酶。 防止末端融合, 维持染色体稳定,除端粒酶外,还需要端区结合蛋白。端区结合蛋白(TRF)有2种。TRF1与DNA双链结合,调节端区长度; TRF2与端区末端DNA单链结合, 保护单链末端。TRF1与端区结合, 使端粒酶难以接触染色体末端,妨碍其作用。所以必须有一种使TRF1从端区脱落的酶, 端粒酶才能修复或延伸端区。Smith等用酵母双杂交筛选法获得编码此酶的cDNA,该cDNA编码的蛋白质,由1 327个氨基酸组成,分子量142 000, 结构上与锚蛋白有关,因而称为端锚酶(tankyrase),该酶是一种ADP核糖聚合酶。它具有24个锚蛋白(ankyrin)重复顺序,可与TRF1结合; 羧基端的催化区可催化TRF1的多ADP核糖基化,使TRF1从端区脱落。
, http://www.100md.com
5.端区长度与人类细胞衰老相关。鼠类的端区较人类的长5～10倍，平均寿命却比人类短得多[7], 其端区不因增龄而缩短。所以端区长度与鼠类等动物细胞的衰老不相关。衰老的端区学说在生物界的普遍意义虽有存疑,但端区长度仍可作为人类体细胞衰老标志之一。
综上所述，端粒酶在医学生物学中极为重要。抑制端粒酶在抗癌方面,激活端粒酶在延缓人类体细胞衰老方面各有应用价值。目前对其期望值较高,但亦应了解其局限性,明确该酶生物学作用的两重性与端区延长机制的复杂性。扩大视野,注意端粒酶对端锚酶的依赖关系与ALT机制的存在, 避免重复性研究,提高研究效益。
基金项目：国家自然科学基金重点资助项目(39930170)
参考文献：
1 Kondo S,Tamaka Y,Kondo Y. et al.Antisense telomerase treatment induction of two distinct pathways, apoptosis and differentiation. FASEB J 1998,12 : 801-11.
, http://www.100md.com
2 范新青,张宗玉,童坦君. HeLa 细胞中端区与端粒酶的实验研究. 北京医科大学学报 1996,28:265-267.
3 Yan P, Coindre JM, Benbattar J, et al. Telomerase activity and human telomerase reverse transcriptase mRNA expression in soft tissue tumors. Cancer Res,1999,59:3166-3170.
4 张晓伟,廖海妮,童坦君. 端粒酶反义cDNA对乳腺癌细胞端区长度的影响. 生物化学与生物物理学报,1999,31:527-530.
5 张宗玉,范新青,童坦君. 中国人外周血白细胞端区长度随增龄缩短. 生物化学杂志 1997,13:605-607.
6 张宗玉,范新青,童坦君. 人胚肺二倍体成纤维细胞端区长度的代龄变化. 生物化学杂志 , 1997,13:43-45.
7 童坦君,张宗玉. 医学老年学-衰老与长寿. 北京: 人民卫生出版.1995;104-105.
收稿日期：1999-05-20, 百拇医药
单位：(北京医科大学生物化学与分子生物学系 100083)
关键词：
中华医学杂志000303 端粒酶(又称端聚酶)是近年国内外医学界研究热点,对肿瘤防治、诊断、延缓衰老都有密切关系,其应用前景与局限性令人关注,对其作出客观而恰当的评价,对促进和指导端粒酶的应用研究具有重要意义。
染色体端区(telomere)，又称端粒。端区消失可能是人类细胞丧失复制能力的原因之一。端区是真核生物染色体末端的特殊结构。人类染色体末端普遍存在端区结构。各类细胞端区长度互有差异，体细胞的端区比生殖细胞短。人类染色体端区由进化上高度保守的DNA重复序列TTAGGG组成，由端粒酶合成。端区可保护染色体，防止染色体降解或端间融合。人类体细胞的端区随年龄增高而缩短, 导致染色体稳定性下降, 肿瘤发病率增高。
, http://www.100md.com
端粒酶是一种自带RNA引物的逆转录酶。生殖细胞、造血干细胞和肿瘤细胞含有较高的端粒酶活性。其活性可用聚合酶链反应(PCR)技术扩增其酶促反应产物(即TRAP法),然后辅以银染法测定之。端粒酶的存在使染色体末端得以完全复制。人类端粒酶催化亚基(hTRT)与RNA (hTR)皆已克隆成功,由此可用反义核酸或核酶(ribozyme)技术抑制其活性,诱导肿瘤细胞分化与凋亡[1]。
1.端粒酶活性能否作为肿瘤诊断和预后的依据？人类多种肿瘤细胞系有较强的端粒酶活性[2]，85%以上的原发性肿瘤有端粒酶活性。测定端粒酶活性能否用以鉴别肿瘤的良性和恶性，能否作为预后指标，这是医学界普遍关注的问题。由于一部分恶性肿瘤无端粒酶活性，所以测不到端粒酶活性并不意味着是良性。目前认为，用端粒酶活性与hTRT的mRNA水平难以衡量肿瘤的恶性度, 难以由此作出恰当预后[3]。除干细胞外,体细胞端粒酶活性极低。妊娠16周,人胚大多数组织的端粒酶即呈抑制状态。所以,不含造血细胞与生殖细胞的组织,如能测得端粒酶活性,则应高度怀疑其为恶性。可见端粒酶阴性虽难作为判断肿瘤良、恶性和预后的依据，但端粒酶阳性对恶性肿瘤的诊断仍有重要参考价值。
, 百拇医药
2.抑制端粒酶活性能否彻底抑制肿瘤? 由于绝大多数肿瘤细胞都具有端粒酶活性。因此，以抑制端粒酶活性为手段的基因疗法,对肿瘤有很强的广谱性和针对性。在理论上抑制端粒酶对正常体细胞基本无害，这是其突出优点。与此相关，不少学者甚至设想,不久可将端粒酶抑制剂列入抗肿瘤新药。但与肿瘤治疗的绝大多数策略相似,利用端粒酶的策略也有其弱点。
我室采用端粒酶反义核酸策略,将hTR反义重组病毒感染MCF-7乳腺癌细胞, 尽管该细胞存在原癌基因c-Ha-ras、c-erbB-2及抑癌基因Rb等异常，hTR反义重组病毒感染仍取得了明显抑癌效果,部分逆转了其恶性表型[4]。但值得注意的是,目前国内外的类似研究并未能完全抑制肿瘤,究其原因可能为：人类有些肿瘤并无端粒酶活性,其端区亦不缩短。Blasco等人揭示, 有些肿瘤并无端粒酶活性,是因为有另一延长端区机制(alternative mechanism for lengthening telomeres, ALT)的存在。小鼠细胞的永生化,恶性转化及肿瘤形成不需端粒酶参与,即是有ALT的缘故。所以要彻底抑制肿瘤,既要抑制端粒酶,还要抑制ALT。ALT机制可能是通过端区-端区重组方式进行的。这条端区延长的旁路究竟是如何形成的？这将是今后研究的重点。
, http://www.100md.com
此外，抑制端粒酶的策略用于肿瘤治疗,难免影响生殖细胞与造血干细胞。因为端粒酶对它们是必需的。有人认为小鼠体内端区延长主要依靠ALT机制，所以不太依赖端粒酶。然而用基因打靶术消除端粒酶基因后, 小鼠胚胎干细胞分裂次数仍大为下降。可见抑制端粒酶活性,对干细胞有不良影响。因此,在实施抑制端粒酶的策略时,宜提高对肿瘤的靶向性,以免损及生殖细胞与造血干细胞。在构建端粒酶反义重组载体时引入肿瘤组织特异启动子，或为减少其副作用的良策之一。
3.在人类体细胞引入端粒酶能否使细胞长生不老? 细胞衰老是老年病发病的基础。细胞衰老引起的细胞增殖能力下降是器官衰老、萎缩、机能减退的根本原因之一。 细胞是生物体的基本单位。神经、内分泌、免疫系统虽与生物整体的衰老密切相关,但单细胞生物,如酵母尚未分化形成以上系统,它们亦会衰老。可见细胞不仅是构成生物体的基本单位,也是生物衰老的基本单位。老年病的表现各异,但莫不以其相关细胞的衰老为基础。因而,延缓细胞衰老可为推迟老年带病期, 防治老年病带来新机遇。
, 百拇医药
体外培养的正常体细胞可传代数有限,可传代数与该种生物寿限和供体年龄有关。国际上常用成纤维细胞作为衰老研究模型,体外培养的正常人成纤维细胞最大增殖次数称为Hayflick极限，又称最大分裂次数。细胞供体年龄越大，可传代数越少;反之,肿瘤细胞属永生化细胞,在理论上可无限传代。
正常人二倍体成纤维细胞在体外培养时随代数的增加，细胞中的端区以一定速率缩短，DNA每复制一次，端区就缩短一段。人体中血细胞与皮肤细胞端区长度也随增龄而缩短。每增一岁,中国人外周血淋巴细胞端区长度平均缩短35 bp[5]，与国外资料 (33 bp)相近。男女略有差别，男性略快。人胚肺二倍体成纤维细胞，每增加一代龄，端区长度约缩短49 bp[6](国外资料为50 bp)。人二倍体成纤维细胞端区的TTAGGG重复顺序长约4 kb，衰老时其端区长度可降至2 kb，此时细胞出现传代培养(hayflick)极限，不再分裂。因此，人染色体端区长度与细胞衰老相关联，有可能是决定细胞增殖能力的计时器。
, http://www.100md.com
端区缩短为什么是人类细胞丧失复制能力的原因, 引起了细胞生长阻滞? 有人认为，人衰老细胞端区的缩短,恰似DNA损伤,引起了与DNA损伤相似的分子事件,导致细胞生长阻滞。衰老细胞常有染色体畸变现象，端区缩短或是其原因之一。
Bodnar等将人端粒酶催化亚单位cDNA转染人视网膜色素上皮细胞或成纤维细胞后,衰老速率减慢,体外倍增代数延长了约20代。所以，人类体细胞引入端粒酶似能“延年益寿”,但不能使细胞长生不老。Kiyone 等报道,使人上皮细胞永生化,既需引入端粒酶,还要使Rb和p16INK4等抑癌基因失活。可见有端粒酶活性只是人类体细胞长生不老的条件之一,如使其永生化,还应辅以其他条件。 此外,还应警惕引入端粒酶有促进癌变的可能性。
4.由端粒酶维持染色体端区长度,需要端锚酶。 防止末端融合, 维持染色体稳定,除端粒酶外,还需要端区结合蛋白。端区结合蛋白(TRF)有2种。TRF1与DNA双链结合,调节端区长度; TRF2与端区末端DNA单链结合, 保护单链末端。TRF1与端区结合, 使端粒酶难以接触染色体末端,妨碍其作用。所以必须有一种使TRF1从端区脱落的酶, 端粒酶才能修复或延伸端区。Smith等用酵母双杂交筛选法获得编码此酶的cDNA,该cDNA编码的蛋白质,由1 327个氨基酸组成,分子量142 000, 结构上与锚蛋白有关,因而称为端锚酶(tankyrase),该酶是一种ADP核糖聚合酶。它具有24个锚蛋白(ankyrin)重复顺序,可与TRF1结合; 羧基端的催化区可催化TRF1的多ADP核糖基化,使TRF1从端区脱落。
, http://www.100md.com
5.端区长度与人类细胞衰老相关。鼠类的端区较人类的长5～10倍，平均寿命却比人类短得多[7], 其端区不因增龄而缩短。所以端区长度与鼠类等动物细胞的衰老不相关。衰老的端区学说在生物界的普遍意义虽有存疑,但端区长度仍可作为人类体细胞衰老标志之一。
综上所述，端粒酶在医学生物学中极为重要。抑制端粒酶在抗癌方面,激活端粒酶在延缓人类体细胞衰老方面各有应用价值。目前对其期望值较高,但亦应了解其局限性,明确该酶生物学作用的两重性与端区延长机制的复杂性。扩大视野,注意端粒酶对端锚酶的依赖关系与ALT机制的存在, 避免重复性研究,提高研究效益。
基金项目：国家自然科学基金重点资助项目(39930170)
参考文献：
1 Kondo S,Tamaka Y,Kondo Y. et al.Antisense telomerase treatment induction of two distinct pathways, apoptosis and differentiation. FASEB J 1998,12 : 801-11.
, http://www.100md.com
2 范新青,张宗玉,童坦君. HeLa 细胞中端区与端粒酶的实验研究. 北京医科大学学报 1996,28:265-267.
3 Yan P, Coindre JM, Benbattar J, et al. Telomerase activity and human telomerase reverse transcriptase mRNA expression in soft tissue tumors. Cancer Res,1999,59:3166-3170.
4 张晓伟,廖海妮,童坦君. 端粒酶反义cDNA对乳腺癌细胞端区长度的影响. 生物化学与生物物理学报,1999,31:527-530.
5 张宗玉,范新青,童坦君. 中国人外周血白细胞端区长度随增龄缩短. 生物化学杂志 1997,13:605-607.
6 张宗玉,范新青,童坦君. 人胚肺二倍体成纤维细胞端区长度的代龄变化. 生物化学杂志 , 1997,13:43-45.
7 童坦君,张宗玉. 医学老年学-衰老与长寿. 北京: 人民卫生出版.1995;104-105.
收稿日期：1999-05-20, 百拇医药