糖原合成酶和脂蛋白脂酶基因多态性与糖尿病及其心血管并发症的关系
作者：王成 白悦心 欧阳安
单位：王成(广东省东莞市东华医院内分泌科 523000)；白悦心 欧阳安(河南医科大学第一附属医院内分泌科)
关键词：
中华医学杂志000306 我们应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术，研究了中国人非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)患者糖原合成酶(GS)基因Xba Ⅰ酶切多态性和LPL基因Hind Ⅲ酶切多态性，旨在探讨中国人NIDDM发生与GS基因是否关联、LPL基因变异与NIDDM脂代谢紊乱及心血管并发症的关系。
一、对象与方法
1.对象：选择NIDDM患者216例，其中男112例，女104例，年龄49±14岁，其中并发高血压44例，冠心病54例。正常健康体检人群106例作为对照，男57例，女49例，年龄42±13岁。均为无血缘关系的河南省汉族人。
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2.方法 ：(1) 基因组DNA的提取： 外周静脉血5 ml，EDTA抗凝，经典酚-氯仿法提取基因组DNA；(2) GS基因XbaI酶切多态性的检测：根据Schalin-Jantti等[1]方法改进，引物由瑞典Marju Orho教授惠赠，其顺序如下：GS1：5′-CTCCTTCCTCTACAGTTTCGT-3′，GS2：5′-GTGAGTCTCCTCTTT-GGCCA-3′。PCR产物经氯仿抽提后加XbaI 20 U 37℃消化3 h，1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测结果；(3) LPL基因HindⅢ酶切多态性的检测：根据Ahn YI等[2]方法改进，引物顺序如下：LPL1：5′-TTTAGGCCTGAAGTTTCCAC-3′，LPL2：5′-CTCCCTAGA-ACAGAAGATC-3′。PCR产物经氯仿抽提后加HindⅢ 20 U 37℃消化3 h，2%琼脂糖凝胶电泳检测结果；(4)临床指标的检测： 空腹取静脉血测总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，糖化血红蛋白(HbA1c)，体重指数(BMI)用公式BMI=体重(kg)/身高(M)2计算得出。
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3.统计学处理：各组基因频率和基因型频率差异比较用χ2检验，不同基因型与临床特征相关性分析计量资料用两样本均数比较的t检验，计数资料用χ2检验。
二、结果
1.正常人与NIDDM患者GS基因XbaI酶切多态性： GS基因PCR产物为600 bp，存在XbaI酶切位点者酶切后显示500 bp和100 bp两条片段，称为A2等位基因，缺乏该酶切位点者仅一条600 bp片段，称为A1等位基因(图1)。中国汉族人群中存在这2种多态性等位基因，18例(8.3%)NIDDM患者携带A2等位基因，10例(9.4%)正常人携带A2等位基因，2组基因频率分布差异无显著性(P>0.05)。
M.pGEM DNA marker；1.A1A1基因型；2.A1A2基因型；3.A2A2基因型
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图1 GS基因PCR/XbaI酶解电泳图谱
2.NIDDM患者临床特征与GS基因型关系 ：携带A2等位基因的NIDDM患者和非携带者在DM家族史、高血压发生率、血脂水平、体重指数上均无明显差别(表1)。
表1 NIDDM患者临床特征与GS基因型关系(
±s)
组别
例数
DM家
族史
(%)
高血压
, 百拇医药
发生率
(%)
BMI
(kg/m2)
TC
(mmol/L)
TG
(mmol/L)
HDL-C
(mmol/L)
带A2
18
33.3
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(6)
22.2
(4)
23.2±
2.7
4.7±
1.8
1.8±
0.7
1.2±
0.3
不带A2
198
, http://www.100md.com
29.8
(59)
20.2
(40)
23.3±
3.3
4.9±
1.3
1.9±
0.9
1.3±
0.4
注：括号内为例数
, 百拇医药
3.正常人与NIDDM患者LPL基因HindⅢ酶切多态性：LPL基因PCR产物为1 300 bp，存在HindⅢ 酶切位点者酶切后显示700 bp和600 bp 2条片段，称为H+等位基因，缺乏该酶切位点者仅1条1 300 bp片段，称为H-等位基因，由此得到H+H+，H+H-，H-H-3种基因型(图2)。中国汉族人群LPL基因Hind Ⅲ酶切后显示2种多态性等位基因，H+等位基因频率在NIDDM和正常人群中分别为0.706和0.736, H+H+基因型频率在2组中分别为0.468和0.519。2组基因型频率和等位基因频率分布差异无显著意义。
1、7.PCR marker；2.PCR产物(1 300 bp)；3.H+H-基因型；4.H-H-基因型；5.阴性对照；6.H+H+基因型
, 百拇医药
图2 LPL基因PCR/HindⅢ酶解电泳图谱
4.NIDDM患者临床特征与LPL基因型关系：在NIDDM中按基因型分组，H+H+基因型与非H+H+基因型2组在年龄、性别、DM病程、糖尿病控制程度(HbA1c)等方面具有可比性，H+H+基因型患者血清TG水平显著高于非H+H+基因型患者，HDL-C水平显著低于非H+H+基因型患者，其他血脂水平比较差异无显著意义。H+H+基因型NIDDM患者CHD发病率显著高于非H+H+基因型患者,其优势比为2.41(95%可信限1.29～4.50)。2组的体重指数、高血压发生率相比差异无显著意义(表2)。
表2 NIDDM患者临床特征与LPL基因型关系(±s) 组别
, 百拇医药
例数
冠心病
发生率
(%)
高血压
发生率
(%)
BMI
(kg/m2)
TC
(mmol/L)
TG
(mmol/L)
, 百拇医药
HDL-C
(mmol/L)
H+H+
98
33.7
(34)*
23.8
(24)
23±
3
4.9±
1.2
, http://www.100md.com
2.0±
0.9*
1.2±
0.4*
非H+H+
118
17.4
(20)
17.4
(20)
23±
3
, http://www.100md.com
4.6±
1.4
1.6±
0.9
1.3±
0.4
注：与非H+H+基因型患者比较，*P<0.01
三、讨论
Groop等[3]发现，GS基因XbaI酶切位点多态性与NIDDM相关联，携带XbaI酶切位点的A2等位基因的DM患者被认为是一个有DM家族史、高血压高发倾向的一个NIDDM亚群。本研究表明，A2等位基因频率在中国人群NIDDM患者和正常人群中差异无显著意义，携带A2等位基因的NIDDM患者其DM家族史发生率，高血压发生率并不高于不携带A2等位基因的NIDDM患者。由此认为，GS基因XbaI酶切位点多态性与中国人NIDDM无关联。这说明NIDDM病因的遗传异质性种族差异，不同种族NIDDM遗传基因可能不一样，GS基因变异在中国人NIDDM发病中不起主要作用。
, 百拇医药
LPL是催化甘油三酯降解的关键酶，LPL基因被认为高脂血症的易感侯选基因。我们在中国汉族人群研究LPL基因HindⅢ酶切位点多态性结果显示，在NIDDM患者中H+H+基因型的血清TG水平显著升高，而HDL-C水平显著降低，这与国外多数研究结果一致[1]，表明LPL基因HindⅢ酶切位点多态性与中国人NIDDM脂代谢紊乱有关联。LPL能催化乳糜微粒和极低密度脂蛋白中TG降解，并能促进HDL的成熟，LPL基因变异可能影响其活性，从而使TG降解减少，HDL-C水平下降。但HindⅢ酶切多态位点位于LPL基因第8号内含子，内含子变化一般并不直接影响LPL基因结构和功能，推测可能与LPL功能基因或影响基因表达的调节基因的变异发生连锁不平衡[1]。本研究发现，H+H+基因型NIDDM患者冠心病发病率显著高于非H+H+基因型患者，其优势比为2.41，提示H+H+基因型NIDDM个体可能具有较高的冠心病易感性，是NIDDM中一个易患CHD并发症的亚群。由于我们观察到H+H+基因型NIDDM并冠心病患者TG水平较高，HDL-C较低，推测其冠心病易感性升高可能部分由于脂代谢紊乱。动物实验发现，DM鼠心肌细胞LPL活性下降，可能由于LPL基因变异导致LPL活性改变，通过影响脂质代谢，增加个体对冠心病易感性。
, 百拇医药
参考文献：
1 Schalin-Jantti C, Nikula-Ijas P, Huang X, et al. Polymorphism of the glycogen synthase gene in hypertensive and normotensive subjects. Hypertension, 1996, 27: 67-71.
2 Ahn YI, Hamman RF, Ferrell RE, et al. Association of lipoprotein lipase gene variation with the physiological components of the insulin-resistance syndrome in the population of the San Luis Valley,Colorado. Diabetes Care, 1993, 16: 1502-1506.
3 Groop LC,Kankuri M,Schalin-Jantti C,et al. Association between polymorphism of the glycogen synthase gene and non-insulin-dependent diabetes mellitus. N Engl J Med,1993,328:10-14.
收稿日期：1999-03-15, 百拇医药
单位：王成(广东省东莞市东华医院内分泌科 523000)；白悦心 欧阳安(河南医科大学第一附属医院内分泌科)
关键词：
中华医学杂志000306 我们应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术，研究了中国人非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)患者糖原合成酶(GS)基因Xba Ⅰ酶切多态性和LPL基因Hind Ⅲ酶切多态性，旨在探讨中国人NIDDM发生与GS基因是否关联、LPL基因变异与NIDDM脂代谢紊乱及心血管并发症的关系。
一、对象与方法
1.对象：选择NIDDM患者216例，其中男112例，女104例，年龄49±14岁，其中并发高血压44例，冠心病54例。正常健康体检人群106例作为对照，男57例，女49例，年龄42±13岁。均为无血缘关系的河南省汉族人。
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2.方法 ：(1) 基因组DNA的提取： 外周静脉血5 ml，EDTA抗凝，经典酚-氯仿法提取基因组DNA；(2) GS基因XbaI酶切多态性的检测：根据Schalin-Jantti等[1]方法改进，引物由瑞典Marju Orho教授惠赠，其顺序如下：GS1：5′-CTCCTTCCTCTACAGTTTCGT-3′，GS2：5′-GTGAGTCTCCTCTTT-GGCCA-3′。PCR产物经氯仿抽提后加XbaI 20 U 37℃消化3 h，1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测结果；(3) LPL基因HindⅢ酶切多态性的检测：根据Ahn YI等[2]方法改进，引物顺序如下：LPL1：5′-TTTAGGCCTGAAGTTTCCAC-3′，LPL2：5′-CTCCCTAGA-ACAGAAGATC-3′。PCR产物经氯仿抽提后加HindⅢ 20 U 37℃消化3 h，2%琼脂糖凝胶电泳检测结果；(4)临床指标的检测： 空腹取静脉血测总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，糖化血红蛋白(HbA1c)，体重指数(BMI)用公式BMI=体重(kg)/身高(M)2计算得出。
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3.统计学处理：各组基因频率和基因型频率差异比较用χ2检验，不同基因型与临床特征相关性分析计量资料用两样本均数比较的t检验，计数资料用χ2检验。
二、结果
1.正常人与NIDDM患者GS基因XbaI酶切多态性： GS基因PCR产物为600 bp，存在XbaI酶切位点者酶切后显示500 bp和100 bp两条片段，称为A2等位基因，缺乏该酶切位点者仅一条600 bp片段，称为A1等位基因(图1)。中国汉族人群中存在这2种多态性等位基因，18例(8.3%)NIDDM患者携带A2等位基因，10例(9.4%)正常人携带A2等位基因，2组基因频率分布差异无显著性(P>0.05)。
M.pGEM DNA marker；1.A1A1基因型；2.A1A2基因型；3.A2A2基因型
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图1 GS基因PCR/XbaI酶解电泳图谱
2.NIDDM患者临床特征与GS基因型关系 ：携带A2等位基因的NIDDM患者和非携带者在DM家族史、高血压发生率、血脂水平、体重指数上均无明显差别(表1)。
表1 NIDDM患者临床特征与GS基因型关系(
±s)组别
例数
DM家
族史
(%)
高血压
, 百拇医药
发生率
(%)
BMI
(kg/m2)
TC
(mmol/L)
TG
(mmol/L)
HDL-C
(mmol/L)
带A2
18
33.3
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(6)
22.2
(4)
23.2±
2.7
4.7±
1.8
1.8±
0.7
1.2±
0.3
不带A2
198
, http://www.100md.com
29.8
(59)
20.2
(40)
23.3±
3.3
4.9±
1.3
1.9±
0.9
1.3±
0.4
注：括号内为例数
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3.正常人与NIDDM患者LPL基因HindⅢ酶切多态性：LPL基因PCR产物为1 300 bp，存在HindⅢ 酶切位点者酶切后显示700 bp和600 bp 2条片段，称为H+等位基因，缺乏该酶切位点者仅1条1 300 bp片段，称为H-等位基因，由此得到H+H+，H+H-，H-H-3种基因型(图2)。中国汉族人群LPL基因Hind Ⅲ酶切后显示2种多态性等位基因，H+等位基因频率在NIDDM和正常人群中分别为0.706和0.736, H+H+基因型频率在2组中分别为0.468和0.519。2组基因型频率和等位基因频率分布差异无显著意义。
1、7.PCR marker；2.PCR产物(1 300 bp)；3.H+H-基因型；4.H-H-基因型；5.阴性对照；6.H+H+基因型
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图2 LPL基因PCR/HindⅢ酶解电泳图谱
4.NIDDM患者临床特征与LPL基因型关系：在NIDDM中按基因型分组，H+H+基因型与非H+H+基因型2组在年龄、性别、DM病程、糖尿病控制程度(HbA1c)等方面具有可比性，H+H+基因型患者血清TG水平显著高于非H+H+基因型患者，HDL-C水平显著低于非H+H+基因型患者，其他血脂水平比较差异无显著意义。H+H+基因型NIDDM患者CHD发病率显著高于非H+H+基因型患者,其优势比为2.41(95%可信限1.29～4.50)。2组的体重指数、高血压发生率相比差异无显著意义(表2)。
表2 NIDDM患者临床特征与LPL基因型关系(
±s) 组别, 百拇医药
例数
冠心病
发生率
(%)
高血压
发生率
(%)
BMI
(kg/m2)
TC
(mmol/L)
TG
(mmol/L)
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HDL-C
(mmol/L)
H+H+
98
33.7
(34)*
23.8
(24)
23±
3
4.9±
1.2
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2.0±
0.9*
1.2±
0.4*
非H+H+
118
17.4
(20)
17.4
(20)
23±
3
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4.6±
1.4
1.6±
0.9
1.3±
0.4
注：与非H+H+基因型患者比较，*P<0.01
三、讨论
Groop等[3]发现，GS基因XbaI酶切位点多态性与NIDDM相关联，携带XbaI酶切位点的A2等位基因的DM患者被认为是一个有DM家族史、高血压高发倾向的一个NIDDM亚群。本研究表明，A2等位基因频率在中国人群NIDDM患者和正常人群中差异无显著意义，携带A2等位基因的NIDDM患者其DM家族史发生率，高血压发生率并不高于不携带A2等位基因的NIDDM患者。由此认为，GS基因XbaI酶切位点多态性与中国人NIDDM无关联。这说明NIDDM病因的遗传异质性种族差异，不同种族NIDDM遗传基因可能不一样，GS基因变异在中国人NIDDM发病中不起主要作用。
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LPL是催化甘油三酯降解的关键酶，LPL基因被认为高脂血症的易感侯选基因。我们在中国汉族人群研究LPL基因HindⅢ酶切位点多态性结果显示，在NIDDM患者中H+H+基因型的血清TG水平显著升高，而HDL-C水平显著降低，这与国外多数研究结果一致[1]，表明LPL基因HindⅢ酶切位点多态性与中国人NIDDM脂代谢紊乱有关联。LPL能催化乳糜微粒和极低密度脂蛋白中TG降解，并能促进HDL的成熟，LPL基因变异可能影响其活性，从而使TG降解减少，HDL-C水平下降。但HindⅢ酶切多态位点位于LPL基因第8号内含子，内含子变化一般并不直接影响LPL基因结构和功能，推测可能与LPL功能基因或影响基因表达的调节基因的变异发生连锁不平衡[1]。本研究发现，H+H+基因型NIDDM患者冠心病发病率显著高于非H+H+基因型患者，其优势比为2.41，提示H+H+基因型NIDDM个体可能具有较高的冠心病易感性，是NIDDM中一个易患CHD并发症的亚群。由于我们观察到H+H+基因型NIDDM并冠心病患者TG水平较高，HDL-C较低，推测其冠心病易感性升高可能部分由于脂代谢紊乱。动物实验发现，DM鼠心肌细胞LPL活性下降，可能由于LPL基因变异导致LPL活性改变，通过影响脂质代谢，增加个体对冠心病易感性。
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参考文献：
1 Schalin-Jantti C, Nikula-Ijas P, Huang X, et al. Polymorphism of the glycogen synthase gene in hypertensive and normotensive subjects. Hypertension, 1996, 27: 67-71.
2 Ahn YI, Hamman RF, Ferrell RE, et al. Association of lipoprotein lipase gene variation with the physiological components of the insulin-resistance syndrome in the population of the San Luis Valley,Colorado. Diabetes Care, 1993, 16: 1502-1506.
3 Groop LC,Kankuri M,Schalin-Jantti C,et al. Association between polymorphism of the glycogen synthase gene and non-insulin-dependent diabetes mellitus. N Engl J Med,1993,328:10-14.
收稿日期：1999-03-15, 百拇医药