人可溶性TRAIL蛋白诱导多种肿瘤细胞的凋亡
作者：郑晓勇 官孝群 林芷英 宋后燕 汤钊猷
单位：郑晓勇 林芷英 汤钊猷(上海医科大学肝癌研究所 200032)；官孝群 宋后燕(上海医科大学分子遗传研究室)
关键词：
中华医学杂志000310 摘 要：目的 探讨原核表达的凋亡激活因子——人可溶性TRAIL蛋白诱导多种肿瘤、尤其实体瘤细胞凋亡的作用及与p53突变的关系。方法 PCR扩增人TRAIL密码子114-281，JFl125大肠杆菌表达，复性并纯化该可溶性片段。电镜观察与荧光活化细胞分类器(FACS)定量分析纯化产物对多种恶性肿瘤细胞的诱导凋亡作用。免疫组织化学(ABC法)分析各细胞株p53的突变。结果 人可溶性TRAIL蛋白经多步纯化后纯度达90%以上，蛋白可溶性好。在人乳腺癌MCF-7细胞，宫颈癌Hela细胞，肝细胞肝癌SMMC7721、BEL7402、7405BEL细胞，肺巨细胞癌95C细胞中观察到人可溶性TRAIL蛋白的诱导凋亡作用。上述细胞株p53免疫组织化学检测均呈阳性。结论 原核表达产物与真核表达产物一样具有明显诱导多种肿瘤细胞凋亡的活性。
, 百拇医药
关键词：肿瘤； 脱噬作用； 基因，p53
Induction of apoptosis in various cancer cell lines by human soluble TRAIL expressed in Escherichia coli
ZHENG Xiaoyong GUAN Xiaoqun LIN Zhiying, et al.
(Liver Cancer Institute, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China)
Abstract：Objective To investigate the induction of apoptosis by human soluble TRAIL expressed in Escherichia coli and analyze its relationship with p53 in various cancer cell lines, especially the solid tumor. Methods TRAIL codons 114～281 were amplified by polymerase chain reaction. The soluble segment was expressed in Escherichia coli JF1125, refolded and purified. Induction of apoptosis was assessed by examination of morphological changes under electron microscope and quantified by FACS analysis. The mutation of p53 in employed cell lines was detected by immunohistochemistry. Results By multi-step purification, the purity of human soluble TRAIL exceeded 90%. Induction of apoptosis by the product exhibited a marked increase in human breast cancer cell line MCF-7, HeLa cervical carcinoma cells and hepatocellular carcinoma cell lines SMMC7721, BEL7402, and BEL7405. The mutation of p53 in employed cell lines was positive in aforementioned cell lines. Conclusion The human soluble TRAIL expressed in Escherichia coli has similar activity to that generated in cells to induce apoptosis in various cancer cell lines, and acts independently of p53.
, 百拇医药
Key words：Cancer; Apoptosis; Gene, p53
凋亡是细胞自杀的过程，它使多细胞生物在组织中控制一定细胞数并消除个别威胁生物生存的细胞。细胞在严重DNA损伤后凋亡启动失败而导致恶性肿瘤的发生[1]。某些细胞表面具独特传感器，被称为死亡受体，它能探测细胞外的死亡信号(凋亡激活因子)，并能迅速启动细胞的内在凋亡过程[2]。近期研究发现了一种凋亡激活因子 -TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)蛋白，是一Ⅱ型膜蛋白。真核表达的全长膜蛋白TRAIL和pmol可溶性TRAIL能迅速诱导多种肿瘤细胞凋亡[3，4]。我们分析了采用基因工程技术原核表达的人可溶性TRAIL诱导多种肿瘤，尤其实体瘤细胞凋亡的作用及与p53突变的关系。
材料与方法
1.人可溶性TRAIL的表达及纯化：以人全长TRAIL质粒[3](由美国Genetech公司Avi Ashkenazi教授惠赠)为模板， PCR扩增TRAIL密码子114-281，产物亚克隆至PLY-4质粒构成hrTRAIL-PLY-4并转化受体菌JFl125大肠杆菌。筛选高表达克隆于5L发酵罐(美国NBS公司)经温度诱导表达，高压匀浆泵破碎细菌后离心收集沉淀，洗涤沉淀3次后用6 mol/L盐酸胍充分溶解，4℃ 20 000 r/min离心30 min。上清用空气氧化法复性，即1：100稀释于复性缓冲液中，离心后上清超滤[NMWL (nominal molecular weight limit ) =1 kd]，上Q-Sepharose FF阴离子交换柱纯化。收集目的产物透析脱盐，冷冻干燥，-20℃保存备用。
, 百拇医药
2.细胞株：人乳腺癌MCF-7细胞，宫颈癌Hela细胞，肝细胞肝癌SMMC7721、BEL7402、BEL7404细胞，肺巨细胞癌95C细胞，均采用含质量分数为10%的小牛血清、300 μg/ml L-谷胺酰胺、100 IU/ml青霉素和25 μg/ml链霉素的 RPMI 1640培养。
3.细胞杀伤率分析：按文献[4]方法所有细胞按2×104(100 μl)/孔培养于96孔板，培养8 h后去上清加含不同浓度纯化产物或PBS的培养基100 μl。18 h后用结晶紫50 μl染色，A570检测。同法研究其他细胞株量-效关系，采用合适浓度进行FACS分析，确定杀伤是否由于凋亡所致。
4.凋亡分析：2.5 ml培养液含4×106细胞培养于6孔板，加纯化的TRAIL，作用12 h，收集细胞电镜观察形态学改变[5]；按文献[3]方法采用PI(propidium iodide)和annexin V荧光染色、FACS定量分析诱凋亡活性，碘化丙啶(PI)和annexin V均阴性为活细胞，PI阴性、annexin V阳性为早期凋亡细胞, PI和annexin V均阳性为晚期凋亡细胞。分析软件为美国Phoenix公司的multicycle软件。
, 百拇医药
5.p53突变分析：上述各细胞株涂片采用抗p53抗体免疫组化(ABC法)分析p53突变。
结果
1.测序证实重组体hrTRAIL-PLY-4序列无误，在大肠杆菌中人可溶性TRAIL形成了包涵体，复性、超滤和离子交换树脂纯化后纯度达90%以上，蛋白可溶性好(图1)。
M. 蛋白分子量标准；1.复性超滤后上清；2.离子交换纯化后上清
图1 SDS-PAGE分析纯化人可溶性TRAIL上清
2.人可溶性TRAIL对SMMC7721肝癌细胞杀伤的量-效关系示0.5 μg/ml TRAIL即具有杀伤活性，10 μg/ml TRAIL可达65%(图2)，其他细胞株也见类似结果。
, 百拇医药
图2 TRAIL杀伤的量效关系
3. 1 μg/ml TRAIL作用于培养SMMC7721细胞8 h。电镜观察到细胞凋亡的形态学特征，细胞染色体固缩致密化，边缘化，出现凋亡小体，细胞膜保持完整(图3，4)。作用12 h后FACS分析观察到其明显的诱导凋亡活性(图5)。
图3 正常对照细胞×4 000
图4 可溶性TRAIL，细胞染色体固缩致密化，边缘化，出现凋亡小体，细胞膜保持完整 ×6 000
图5 FACS分析其诱导凋亡活性
, 百拇医药
4. 1 μg/ml人可溶性TRAIL作用于人乳腺癌MCF-7细胞，宫颈癌Hela细胞，肝细胞肝癌SMMC7721、BEL7402、BEL7405细胞，肺巨细胞癌95C细胞与各自对照(溶解TRAIL缓冲液)，FACS观察到实验组凋亡细胞数明显高于对照组(表1)。
表1 肿瘤细胞株中凋亡的诱导结果 细胞株
凋亡细胞(%)
对照
TRAIL
BEL7402
14.2
50.2
BEL7405
, 百拇医药
10.3
48.6
SMMC7721
15.1
53.0
MCF-7
3.9
20.8
95C
13.7
58.4
HeLa
6.1
, 百拇医药
25.7
注：经χ2检验，所有各组差异均有显著意义，P<0.05
5.上述各细胞株p53免疫组织化学均呈阳性。
讨论
药物化疗和放射治疗是临床上用来诱导肿瘤细胞凋亡最为普遍的治疗方法。在DNA被药物或X线损伤后p53能激活胞内的自杀机制。在约半数的肿瘤里，由于p53的突变，部分顽固的细胞系即使遭受化疗和放疗的打击后经常并不死亡[6]。这给临床肿瘤的治疗带来了极大的困难。诸多诱导凋亡物质，如TNF、FasL与其他化疗药物一样，因其非选择性杀伤或其他副作用而难于进入临床应用。
由于全长TRAIL为膜蛋白，且从其一级结构推测其空间结构与TNF相似。根据TNF的结构与活性关系分析，为便于原核表达，参照其他学者真核表达的工作[3]，我们构建了人TRAIL密码子114-281以使产物成为可溶性蛋白。也有真核表达构建密码子95-281的报道[4]。FACS定量分析观察到：对人乳腺癌MCF-7细胞，宫颈癌Hela细胞，肝细胞肝癌SMMC7721、BEL7402、BEL7405细胞，肺巨细胞癌95C细胞等多种恶性肿瘤细胞，实验组凋亡细胞数明显高于对照组，表明该表达产物与真核表达产物一样具明显的诱导肿瘤细胞凋亡活性。其他学者证实了其对人多种恶性淋巴瘤细胞、急慢性白血病细胞、EB病毒转化的B 淋巴细胞等的诱凋亡作用，说明了TRAIL与CD95L一样具有诱凋亡作用的广谱性。
, 百拇医药
我们在检测TRAIL的凋亡诱导活性中所使用的细胞株均检测到了p53的突变，示TRAIL杀伤瘤细胞与其家族其它因子一样不依赖于p53，这样可以更有效地杀伤一些p53发生突变了的细胞。
TRAIL在许多组织有表达，近期陆续发现了其4种受体[2]：DR5、DR4、DcR1(TRID)和DcR2，它们均不与其他细胞毒配体如TNF-α结合。正常和肿瘤组织均表达DR5、DR4[7]，并介导TRAIL的凋亡作用。而DcR1和DcR2在正常组织(含肝组织)中高表达，在胚胎(含胎肝)及肿瘤组织中低表达。尤为重要的是， DcR1和DcR2不能传递死亡信号，为具保护性作用的“诱饵”受体，使得正常细胞免于被杀伤。转染实验已证实这一保护性作用[9，10]。根据TRAIL及其多种受体的表达推测正常组织对其诱导凋亡作用不敏感。故可溶性TRAIL可望成为一种选择性杀伤肿瘤的治疗药物。但TRAIL的生理作用及其对荷瘤模型的杀伤作用尚待进一步研究。原核表达纯化大量获得该活性蛋白，为进一步研究奠定了基础。
, 百拇医药
志谢 上海医科大学电镜室钟慈声教授协助电镜片制作及结果判定，肿瘤医院流式细胞室协助FACS分析
基金项目：上海市卫生局医学领先专业科研基金资助项目(983001)
参考文献：
1 Evan G, Littlewood. A matter of lilfe and cell death. Science, 1998,281:1317-1321.
2 Ashkenazi A, Dixit VM. Death receptor: signaling and modulation. Science. 1998,281:1305-1308.
3 Pitti RM, Marsters SA, Ruppert S, et al. Induction of apoptosis by APO-2 ligand, a new member of the tumor necrosis factor cytokine family. J Biol Chem. 1996,271:12687-12690.
, http://www.100md.com
4 Wiley SR, Schooley K, smolak PJ, et al. Identification and characterization of a new member of the TNF family. Immunity, 1995,3:673-682.
5 丁舰，俞彰，钟慈声. 兔血小板被A23178、凝血酶、ADP激活时其超微结构和颗粒数的变化. 上海医科大学学报,1996,23:434.
6 Gura T. How TRAIL kills cancer cells, but not normal cells. Science, 1997, 277: 768.
7 Pan G, O'Rourke K, Chinnaiyan AM, et al. The receptor for cytotoxic ligand TRAIL. Science, 1997,276:111-113.
, http://www.100md.com
8 Pan G, Ni J, Wei YF, et al. Anew member of the TRAIL receptor family that antagonizes TRAIL signalling. FEBS Lett, 1998,424:41-45
9 Sheridan JP, Marster SA, Pitti RM, et al. Control of TRAIL-induced apotosis by a family of signaling and decoy receptors. Science, 1997,277:818-821.
10 Pan G, Ni J, Wei YF, et al. An antagonist decoy receptor and a death domain-containing receptor for TRAIL. Science, 1997,277:815-818.
收稿日期：1999-02-24, 百拇医药
单位：郑晓勇 林芷英 汤钊猷(上海医科大学肝癌研究所 200032)；官孝群 宋后燕(上海医科大学分子遗传研究室)
关键词：
中华医学杂志000310 摘 要：目的 探讨原核表达的凋亡激活因子——人可溶性TRAIL蛋白诱导多种肿瘤、尤其实体瘤细胞凋亡的作用及与p53突变的关系。方法 PCR扩增人TRAIL密码子114-281，JFl125大肠杆菌表达，复性并纯化该可溶性片段。电镜观察与荧光活化细胞分类器(FACS)定量分析纯化产物对多种恶性肿瘤细胞的诱导凋亡作用。免疫组织化学(ABC法)分析各细胞株p53的突变。结果 人可溶性TRAIL蛋白经多步纯化后纯度达90%以上，蛋白可溶性好。在人乳腺癌MCF-7细胞，宫颈癌Hela细胞，肝细胞肝癌SMMC7721、BEL7402、7405BEL细胞，肺巨细胞癌95C细胞中观察到人可溶性TRAIL蛋白的诱导凋亡作用。上述细胞株p53免疫组织化学检测均呈阳性。结论 原核表达产物与真核表达产物一样具有明显诱导多种肿瘤细胞凋亡的活性。
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关键词：肿瘤； 脱噬作用； 基因，p53
Induction of apoptosis in various cancer cell lines by human soluble TRAIL expressed in Escherichia coli
ZHENG Xiaoyong GUAN Xiaoqun LIN Zhiying, et al.
(Liver Cancer Institute, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China)
Abstract：Objective To investigate the induction of apoptosis by human soluble TRAIL expressed in Escherichia coli and analyze its relationship with p53 in various cancer cell lines, especially the solid tumor. Methods TRAIL codons 114～281 were amplified by polymerase chain reaction. The soluble segment was expressed in Escherichia coli JF1125, refolded and purified. Induction of apoptosis was assessed by examination of morphological changes under electron microscope and quantified by FACS analysis. The mutation of p53 in employed cell lines was detected by immunohistochemistry. Results By multi-step purification, the purity of human soluble TRAIL exceeded 90%. Induction of apoptosis by the product exhibited a marked increase in human breast cancer cell line MCF-7, HeLa cervical carcinoma cells and hepatocellular carcinoma cell lines SMMC7721, BEL7402, and BEL7405. The mutation of p53 in employed cell lines was positive in aforementioned cell lines. Conclusion The human soluble TRAIL expressed in Escherichia coli has similar activity to that generated in cells to induce apoptosis in various cancer cell lines, and acts independently of p53.
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Key words：Cancer; Apoptosis; Gene, p53
凋亡是细胞自杀的过程，它使多细胞生物在组织中控制一定细胞数并消除个别威胁生物生存的细胞。细胞在严重DNA损伤后凋亡启动失败而导致恶性肿瘤的发生[1]。某些细胞表面具独特传感器，被称为死亡受体，它能探测细胞外的死亡信号(凋亡激活因子)，并能迅速启动细胞的内在凋亡过程[2]。近期研究发现了一种凋亡激活因子 -TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)蛋白，是一Ⅱ型膜蛋白。真核表达的全长膜蛋白TRAIL和pmol可溶性TRAIL能迅速诱导多种肿瘤细胞凋亡[3，4]。我们分析了采用基因工程技术原核表达的人可溶性TRAIL诱导多种肿瘤，尤其实体瘤细胞凋亡的作用及与p53突变的关系。
材料与方法
1.人可溶性TRAIL的表达及纯化：以人全长TRAIL质粒[3](由美国Genetech公司Avi Ashkenazi教授惠赠)为模板， PCR扩增TRAIL密码子114-281，产物亚克隆至PLY-4质粒构成hrTRAIL-PLY-4并转化受体菌JFl125大肠杆菌。筛选高表达克隆于5L发酵罐(美国NBS公司)经温度诱导表达，高压匀浆泵破碎细菌后离心收集沉淀，洗涤沉淀3次后用6 mol/L盐酸胍充分溶解，4℃ 20 000 r/min离心30 min。上清用空气氧化法复性，即1：100稀释于复性缓冲液中，离心后上清超滤[NMWL (nominal molecular weight limit ) =1 kd]，上Q-Sepharose FF阴离子交换柱纯化。收集目的产物透析脱盐，冷冻干燥，-20℃保存备用。
, 百拇医药
2.细胞株：人乳腺癌MCF-7细胞，宫颈癌Hela细胞，肝细胞肝癌SMMC7721、BEL7402、BEL7404细胞，肺巨细胞癌95C细胞，均采用含质量分数为10%的小牛血清、300 μg/ml L-谷胺酰胺、100 IU/ml青霉素和25 μg/ml链霉素的 RPMI 1640培养。
3.细胞杀伤率分析：按文献[4]方法所有细胞按2×104(100 μl)/孔培养于96孔板，培养8 h后去上清加含不同浓度纯化产物或PBS的培养基100 μl。18 h后用结晶紫50 μl染色，A570检测。同法研究其他细胞株量-效关系，采用合适浓度进行FACS分析，确定杀伤是否由于凋亡所致。
4.凋亡分析：2.5 ml培养液含4×106细胞培养于6孔板，加纯化的TRAIL，作用12 h，收集细胞电镜观察形态学改变[5]；按文献[3]方法采用PI(propidium iodide)和annexin V荧光染色、FACS定量分析诱凋亡活性，碘化丙啶(PI)和annexin V均阴性为活细胞，PI阴性、annexin V阳性为早期凋亡细胞, PI和annexin V均阳性为晚期凋亡细胞。分析软件为美国Phoenix公司的multicycle软件。
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5.p53突变分析：上述各细胞株涂片采用抗p53抗体免疫组化(ABC法)分析p53突变。
结果
1.测序证实重组体hrTRAIL-PLY-4序列无误，在大肠杆菌中人可溶性TRAIL形成了包涵体，复性、超滤和离子交换树脂纯化后纯度达90%以上，蛋白可溶性好(图1)。
M. 蛋白分子量标准；1.复性超滤后上清；2.离子交换纯化后上清
图1 SDS-PAGE分析纯化人可溶性TRAIL上清
2.人可溶性TRAIL对SMMC7721肝癌细胞杀伤的量-效关系示0.5 μg/ml TRAIL即具有杀伤活性，10 μg/ml TRAIL可达65%(图2)，其他细胞株也见类似结果。
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图2 TRAIL杀伤的量效关系
3. 1 μg/ml TRAIL作用于培养SMMC7721细胞8 h。电镜观察到细胞凋亡的形态学特征，细胞染色体固缩致密化，边缘化，出现凋亡小体，细胞膜保持完整(图3，4)。作用12 h后FACS分析观察到其明显的诱导凋亡活性(图5)。
图3 正常对照细胞×4 000
图4 可溶性TRAIL，细胞染色体固缩致密化，边缘化，出现凋亡小体，细胞膜保持完整 ×6 000
图5 FACS分析其诱导凋亡活性
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4. 1 μg/ml人可溶性TRAIL作用于人乳腺癌MCF-7细胞，宫颈癌Hela细胞，肝细胞肝癌SMMC7721、BEL7402、BEL7405细胞，肺巨细胞癌95C细胞与各自对照(溶解TRAIL缓冲液)，FACS观察到实验组凋亡细胞数明显高于对照组(表1)。
表1 肿瘤细胞株中凋亡的诱导结果 细胞株
凋亡细胞(%)
对照
TRAIL
BEL7402
14.2
50.2
BEL7405
, 百拇医药
10.3
48.6
SMMC7721
15.1
53.0
MCF-7
3.9
20.8
95C
13.7
58.4
HeLa
6.1
, 百拇医药
25.7
注：经χ2检验，所有各组差异均有显著意义，P<0.05
5.上述各细胞株p53免疫组织化学均呈阳性。
讨论
药物化疗和放射治疗是临床上用来诱导肿瘤细胞凋亡最为普遍的治疗方法。在DNA被药物或X线损伤后p53能激活胞内的自杀机制。在约半数的肿瘤里，由于p53的突变，部分顽固的细胞系即使遭受化疗和放疗的打击后经常并不死亡[6]。这给临床肿瘤的治疗带来了极大的困难。诸多诱导凋亡物质，如TNF、FasL与其他化疗药物一样，因其非选择性杀伤或其他副作用而难于进入临床应用。
由于全长TRAIL为膜蛋白，且从其一级结构推测其空间结构与TNF相似。根据TNF的结构与活性关系分析，为便于原核表达，参照其他学者真核表达的工作[3]，我们构建了人TRAIL密码子114-281以使产物成为可溶性蛋白。也有真核表达构建密码子95-281的报道[4]。FACS定量分析观察到：对人乳腺癌MCF-7细胞，宫颈癌Hela细胞，肝细胞肝癌SMMC7721、BEL7402、BEL7405细胞，肺巨细胞癌95C细胞等多种恶性肿瘤细胞，实验组凋亡细胞数明显高于对照组，表明该表达产物与真核表达产物一样具明显的诱导肿瘤细胞凋亡活性。其他学者证实了其对人多种恶性淋巴瘤细胞、急慢性白血病细胞、EB病毒转化的B 淋巴细胞等的诱凋亡作用，说明了TRAIL与CD95L一样具有诱凋亡作用的广谱性。
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我们在检测TRAIL的凋亡诱导活性中所使用的细胞株均检测到了p53的突变，示TRAIL杀伤瘤细胞与其家族其它因子一样不依赖于p53，这样可以更有效地杀伤一些p53发生突变了的细胞。
TRAIL在许多组织有表达，近期陆续发现了其4种受体[2]：DR5、DR4、DcR1(TRID)和DcR2，它们均不与其他细胞毒配体如TNF-α结合。正常和肿瘤组织均表达DR5、DR4[7]，并介导TRAIL的凋亡作用。而DcR1和DcR2在正常组织(含肝组织)中高表达，在胚胎(含胎肝)及肿瘤组织中低表达。尤为重要的是， DcR1和DcR2不能传递死亡信号，为具保护性作用的“诱饵”受体，使得正常细胞免于被杀伤。转染实验已证实这一保护性作用[9，10]。根据TRAIL及其多种受体的表达推测正常组织对其诱导凋亡作用不敏感。故可溶性TRAIL可望成为一种选择性杀伤肿瘤的治疗药物。但TRAIL的生理作用及其对荷瘤模型的杀伤作用尚待进一步研究。原核表达纯化大量获得该活性蛋白，为进一步研究奠定了基础。
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志谢 上海医科大学电镜室钟慈声教授协助电镜片制作及结果判定，肿瘤医院流式细胞室协助FACS分析
基金项目：上海市卫生局医学领先专业科研基金资助项目(983001)
参考文献：
1 Evan G, Littlewood. A matter of lilfe and cell death. Science, 1998,281:1317-1321.
2 Ashkenazi A, Dixit VM. Death receptor: signaling and modulation. Science. 1998,281:1305-1308.
3 Pitti RM, Marsters SA, Ruppert S, et al. Induction of apoptosis by APO-2 ligand, a new member of the tumor necrosis factor cytokine family. J Biol Chem. 1996,271:12687-12690.
, http://www.100md.com
4 Wiley SR, Schooley K, smolak PJ, et al. Identification and characterization of a new member of the TNF family. Immunity, 1995,3:673-682.
5 丁舰，俞彰，钟慈声. 兔血小板被A23178、凝血酶、ADP激活时其超微结构和颗粒数的变化. 上海医科大学学报,1996,23:434.
6 Gura T. How TRAIL kills cancer cells, but not normal cells. Science, 1997, 277: 768.
7 Pan G, O'Rourke K, Chinnaiyan AM, et al. The receptor for cytotoxic ligand TRAIL. Science, 1997,276:111-113.
, http://www.100md.com
8 Pan G, Ni J, Wei YF, et al. Anew member of the TRAIL receptor family that antagonizes TRAIL signalling. FEBS Lett, 1998,424:41-45
9 Sheridan JP, Marster SA, Pitti RM, et al. Control of TRAIL-induced apotosis by a family of signaling and decoy receptors. Science, 1997,277:818-821.
10 Pan G, Ni J, Wei YF, et al. An antagonist decoy receptor and a death domain-containing receptor for TRAIL. Science, 1997,277:815-818.
收稿日期：1999-02-24, 百拇医药