HPLC-ELSD法测定湖北麦冬中主要皂苷的含量
作者：吴弢 余伯阳 程志红 徐珞珊
单位：中国药科大学中药分析教研室 南京 210038
关键词：湖北麦冬；山麦冬皂苷B；ELSD；甾体皂苷
中草药000308摘 要 采用蒸发光散射检测器(ELSD)测定了湖北麦冬中山麦冬皂苷B的含量，结果表明，ELSD是皂苷类化合物较为适宜的检测器。经对不同采收期样品的含量考察，认为湖北麦冬的最佳采收期与传统采收期(清明)相一致。
Quantitative Determination of the Main Saponin Content in Hubei Liriope(Liriope spicata var.prolifera) by HPLC-ELSD
Wu Tao,Yu Boyang,Cheng Zhihong an Xu Luoshan
, http://www.100md.com
(Department of Pharmacognosy,China Pharmaceutical University Nanjing 210038)
Abstract Quantitative determination of saponins without UV absorption was tried by using the new detector ELSD in combination with HPLC.A pilot study on the determination of the content of 25 (S)-ruscogenin-1-O-β-D-fucopyranoside-3-O-α-L-rhamnopyranose,the main saponin in Liriope spicata var.prolifera was tried and showed that the accumulational rule of the constituents in the plants could be found.It was also found that the optimal harvesting time of L.spicata var.prolifera was around early April,the Chinese solar term of Qing-Ming,which coincides with the traditional Chinese practice.The results showed that ELSD is a realiable,highly sensitive and reproducible detector for saponins analysis.
, 百拇医药
Key words Liriope spicata var.prolifera Y.T.Ma liriopesides B ELSD steroid saponin▲
湖北麦冬Liriope spicata var.prolifera Y.T.Ma为《中华人民共和国药典》(1995年版)新增品种山麦冬的基原植物之一，在湖北省广泛栽培，并作为主流商品。湖北麦冬中所含皂苷类成分在免疫系统、心血管系统等方面具有良好的活性[1～3]。为了探明湖北麦冬皂苷的积累规律，寻找最佳采收期、最佳采收部位，我们收集了不同采收时间的湖北麦冬，测定了其块根和须根中有效成分山麦冬皂苷B的含量。
由于皂苷为一类极性较大，结构复杂的化合物，它无紫外吸收，无专一显色剂，再加上麦冬皂苷测定经常受糖的干扰，在用紫外检测器时，若采用末端吸收，流动相的种类受到限制，增加了分离皂苷的难度，使得许多结构近似的皂苷无法分离。因此，我们采用了较先进的蒸发光散射检测器(ELSD)作为检测手段，利用HPLC法测定湖北麦冬中主要皂苷含量，同时对不同采收期的样品进行含量变化研究。
, http://www.100md.com
蒸发光散射检测器(ELSD)是一种通用质量型检测器，其检测原理及步骤为：柱子洗脱 液进入雾化器针管，在针的末端，洗脱液和氮气混合形成小液滴，液滴流经加热的漂移管将溶剂挥发，样品在溶剂蒸气中形成小液滴，样品颗粒进入流动池时，经过一束激光，颗粒散射激光，经硅晶体光电二极管检测散射光，并产生电信号。由于散色光强度的增加速度快于粒子直径的四次方，当峰被冲洗出来时，单位时间或单位体积溶液中溶液粒子的数目为常数，而这些粒子中溶质的浓度却在变化，因此当溶剂挥发后，组成纯溶质的粒子的大小与柱出口溶质的浓度的立方根呈正比，因此，ELSD的响应值与浓度并非呈简单的线形关系，而是其峰面积或峰高的自然对数与浓度的自然对数有良好的线形关系[5]。
漂移管温度与载气流速是影响ELSD检测的两个关键性参数。在ELSD的气化室中，载气流速对信号影响很大，当载气流速太低时，会形成大量雾滴，从而导致尖峰信号或噪声信号；另一方面当载气流速太高时，微滴量会下降导致信号响应降低。漂移管温度降低时，溶剂挥发不够完全；温度高时，由于分析样品部分挥发导致质粒挥发，使颗粒量下降而使检测器响应下降[5]。
, 百拇医药
ELSD与示差折光检测器相比灵敏度高，对流动相系统温度变化不敏感，可进行梯度洗脱；与紫外检测器相比它扩大了高效液相色谱的应用范围，消除了杂质和流动相的紫外吸收干扰，无需校正因子就可定量[4，5]。
ELSD在国外受到了分析化学家的重视并得到了广泛的应用。文献报道，成功利用HPLC/ELSD法分析的物质有磷脂、表面活性剂、甘油三酯、脂肪、脂肪酸酯、糖、合成聚合物、甾体化合物、无机离子对、药物及其降解产物等[5]。但在国内有关ELSD在中药分析中的应用尚为少见，近来田南卉[6]等用HPLC/ELSD法测定了银杏叶中银杏内酯的含量；汤俊[7]等对西洋参中拟人参皂苷F11的含量也进行了测定，结果均表明：用ELSD检测，基线稳定，重现性、灵敏度均较好。
1 实验材料、仪器及测定条件
, http://www.100md.com 1.1 实验材料：湖北麦冬L.spicata var.prolifera的块根和须根。采集时间：1995年1月3日～3月22日。
1.2 对照品：山麦冬皂苷B〔25(S)-ruscogenin-1-O-β-D-fucopyranoside-3-O-α-L-rhamnopyranosy〕(自提)。
1.3 试剂与药品：乙腈、甲醇(色谱纯)，四氢呋喃(进口分装)。
1.4 仪器：色谱仪：Shimadzu-10AT高效液相色谱仪；检测器：Alltech ELSD 500型，气化温度93.18 ℃，气体流速(N2)2.47 SLPM；记录仪：Chromatopac C-R6A；色谱柱：Alltech Verspapack C18(4.6 mm×250 mm)；纸速：2 mm/min。
, http://www.100md.com 1.5 流动相：乙腈-四氢呋喃-水(45.6∶2.9∶51.5)；流速：0.7 mL/min。
2 实验方法
2.1 样品制备：精密称取干燥的湖北麦冬块根、须根粉末各2 g，置于索氏提取器内，加入20 mL甲醇，80 ℃水浴提取3～4 h至无色，挥干甲醇，用10 mL水分两次超声溶解残渣，水饱和正丁醇萃取4次(15，10，5，5 mL)，合并正丁醇部分，回收正丁醇至干。块根用甲醇定容至2 mL；须根用甲醇定容至10 mL；精密吸取2.5 mL，甲醇定容至10 mL。
2.2 标准曲线制备：精密称取对照品2.8 mg，用甲醇定容至10 mL，从中精密吸取0.25，0.5，1，1.5，2 mL对照品溶液，用甲醇定容至2 mL。分析结果：以峰面积的自然对数为纵坐标，对照品浓度×100的自然对数为横坐标，做标准曲线[5]。回归方程：lnA=8.560+1.409 lnC，r=0.999 2。
, 百拇医药
2.3 精密度试验：取0.21 mg/mL浓度的对照品，连续进样5次，得RSD=1.428%。
2.4 含量测定：取样品制备项下样品20 μL进样，每个样品测定3次，结果见表1，图1，2。
1-短葶山麦冬皂苷C 2-Ls-S7 3-Ls-S10 4-山麦冬皂苷B
图1 样品及其他皂苷HPLC图
图2 时间-含量关系曲线
表1 不同采集时间及部位山麦冬皂苷B的含量 时 间
须根(%)
, 百拇医药
块根(%)
1995-01-03
0.283
0.898 7×10-2
1995-01-19
0.158
1.046 5×10-2
1995-01-30
0.109
1.331 8×10-2
1995-02-16
, 百拇医药
0.185
1.344 2×10-2
1995-03-06
0.184
1.216 9×10-2
1995-03-22
0.247
1.526 2×10-2
二年生
0.190
2.5 加样回收率：精密称量3月6日的须根1 g，置于索氏提取器内，加入20 mL甲醇，回流3～4 h至无色，挥干甲醇，10 mL水分两次超声溶解残渣，加入山麦冬皂苷B 0.96 mg，其余步骤同“样品制备项下的须根的制备”，共做3次，回收率为106.6%，RSD=2.48%。
, 百拇医药
2.6 其它皂苷的影响：湖北麦冬中，除含有山麦冬皂苷B除外，尚还有其它皂苷，为了检验我们所选择的分离条件能否排除其它皂苷的干扰，将分得的短葶山麦冬皂苷C，Ls-S10，Ls-S7与山麦冬皂苷B混合，用测定条件分离，结果表明，所选用的色谱条件对山麦冬皂苷B具有较好的专属性。
2.7 湖北麦冬的失水率：把收集到的样品剪去须根，洗净泥土，沥干水分，称重，记录的重量为鲜重；置于80 ℃烘箱内，烘至恒重，记录的重量为干重。表2 湖北麦冬块根失水率 时 间
鲜重g
干重g
干/湿
1995-01-03
94
22.5
, 百拇医药
0.239
1995-01-19
41
12
0.293
1995-01-30
21
7
0.333
1995-02-16
110
44
0.400
, 百拇医药
1995-03-06
164
73
0.445
1995-03-22
258
128
0.496
3 讨论
3.1 从我们做的时间-含量曲线来看，湖北麦冬块根皂苷的含量以1月30日、2月16日、3月22日较高；同时，根据湖北麦冬块根干湿之比，这两天的比例相近。从外观上看，3月22日的湖北麦冬的个大、饱满，而1月30日、2月16日则瘦小、干瘪，因此，在清明采收为宜。
, http://www.100md.com
3.2 从须根和块根的不同采收日期的皂苷含量曲线来看，这两部分的皂苷分布是不均匀的。1月3日须根中皂苷含量较高，而块根最低，随着时间的推移，块根中皂苷的含量逐渐升高，到1月30日至最高点，此时，须根中皂苷含量却最低，而后再逐渐升高。至3月22日，块根、须根中含量都较高，其中块根中皂苷含量至最高。■
霍英东教育基金资助项目
参考文献
1，余伯阳，等.中国中药杂志，1991，16(10)：584
2，高广猷，等.大连医学院学报，1984，6(3)：12
3，桂 苡，等.中草药，1984，15(3)：21
4，邓海根，等.药物分析杂志，1994，14(3)：61
5，冯埃生，等.药物分析杂志，1996，16(4)：414
6，田南卉，等.药物分析杂志，1997，17(4)：282
7，汤 俊，等.药物分析杂志，1999，19(4)：241
(收稿日期：1999-11-01), 百拇医药
单位：中国药科大学中药分析教研室 南京 210038
关键词：湖北麦冬；山麦冬皂苷B；ELSD；甾体皂苷
中草药000308摘 要 采用蒸发光散射检测器(ELSD)测定了湖北麦冬中山麦冬皂苷B的含量，结果表明，ELSD是皂苷类化合物较为适宜的检测器。经对不同采收期样品的含量考察，认为湖北麦冬的最佳采收期与传统采收期(清明)相一致。
Quantitative Determination of the Main Saponin Content in Hubei Liriope(Liriope spicata var.prolifera) by HPLC-ELSD
Wu Tao,Yu Boyang,Cheng Zhihong an Xu Luoshan
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(Department of Pharmacognosy,China Pharmaceutical University Nanjing 210038)
Abstract Quantitative determination of saponins without UV absorption was tried by using the new detector ELSD in combination with HPLC.A pilot study on the determination of the content of 25 (S)-ruscogenin-1-O-β-D-fucopyranoside-3-O-α-L-rhamnopyranose,the main saponin in Liriope spicata var.prolifera was tried and showed that the accumulational rule of the constituents in the plants could be found.It was also found that the optimal harvesting time of L.spicata var.prolifera was around early April,the Chinese solar term of Qing-Ming,which coincides with the traditional Chinese practice.The results showed that ELSD is a realiable,highly sensitive and reproducible detector for saponins analysis.
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Key words Liriope spicata var.prolifera Y.T.Ma liriopesides B ELSD steroid saponin▲
湖北麦冬Liriope spicata var.prolifera Y.T.Ma为《中华人民共和国药典》(1995年版)新增品种山麦冬的基原植物之一，在湖北省广泛栽培，并作为主流商品。湖北麦冬中所含皂苷类成分在免疫系统、心血管系统等方面具有良好的活性[1～3]。为了探明湖北麦冬皂苷的积累规律，寻找最佳采收期、最佳采收部位，我们收集了不同采收时间的湖北麦冬，测定了其块根和须根中有效成分山麦冬皂苷B的含量。
由于皂苷为一类极性较大，结构复杂的化合物，它无紫外吸收，无专一显色剂，再加上麦冬皂苷测定经常受糖的干扰，在用紫外检测器时，若采用末端吸收，流动相的种类受到限制，增加了分离皂苷的难度，使得许多结构近似的皂苷无法分离。因此，我们采用了较先进的蒸发光散射检测器(ELSD)作为检测手段，利用HPLC法测定湖北麦冬中主要皂苷含量，同时对不同采收期的样品进行含量变化研究。
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蒸发光散射检测器(ELSD)是一种通用质量型检测器，其检测原理及步骤为：柱子洗脱 液进入雾化器针管，在针的末端，洗脱液和氮气混合形成小液滴，液滴流经加热的漂移管将溶剂挥发，样品在溶剂蒸气中形成小液滴，样品颗粒进入流动池时，经过一束激光，颗粒散射激光，经硅晶体光电二极管检测散射光，并产生电信号。由于散色光强度的增加速度快于粒子直径的四次方，当峰被冲洗出来时，单位时间或单位体积溶液中溶液粒子的数目为常数，而这些粒子中溶质的浓度却在变化，因此当溶剂挥发后，组成纯溶质的粒子的大小与柱出口溶质的浓度的立方根呈正比，因此，ELSD的响应值与浓度并非呈简单的线形关系，而是其峰面积或峰高的自然对数与浓度的自然对数有良好的线形关系[5]。
漂移管温度与载气流速是影响ELSD检测的两个关键性参数。在ELSD的气化室中，载气流速对信号影响很大，当载气流速太低时，会形成大量雾滴，从而导致尖峰信号或噪声信号；另一方面当载气流速太高时，微滴量会下降导致信号响应降低。漂移管温度降低时，溶剂挥发不够完全；温度高时，由于分析样品部分挥发导致质粒挥发，使颗粒量下降而使检测器响应下降[5]。
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ELSD与示差折光检测器相比灵敏度高，对流动相系统温度变化不敏感，可进行梯度洗脱；与紫外检测器相比它扩大了高效液相色谱的应用范围，消除了杂质和流动相的紫外吸收干扰，无需校正因子就可定量[4，5]。
ELSD在国外受到了分析化学家的重视并得到了广泛的应用。文献报道，成功利用HPLC/ELSD法分析的物质有磷脂、表面活性剂、甘油三酯、脂肪、脂肪酸酯、糖、合成聚合物、甾体化合物、无机离子对、药物及其降解产物等[5]。但在国内有关ELSD在中药分析中的应用尚为少见，近来田南卉[6]等用HPLC/ELSD法测定了银杏叶中银杏内酯的含量；汤俊[7]等对西洋参中拟人参皂苷F11的含量也进行了测定，结果均表明：用ELSD检测，基线稳定，重现性、灵敏度均较好。
1 实验材料、仪器及测定条件
, http://www.100md.com 1.1 实验材料：湖北麦冬L.spicata var.prolifera的块根和须根。采集时间：1995年1月3日～3月22日。
1.2 对照品：山麦冬皂苷B〔25(S)-ruscogenin-1-O-β-D-fucopyranoside-3-O-α-L-rhamnopyranosy〕(自提)。
1.3 试剂与药品：乙腈、甲醇(色谱纯)，四氢呋喃(进口分装)。
1.4 仪器：色谱仪：Shimadzu-10AT高效液相色谱仪；检测器：Alltech ELSD 500型，气化温度93.18 ℃，气体流速(N2)2.47 SLPM；记录仪：Chromatopac C-R6A；色谱柱：Alltech Verspapack C18(4.6 mm×250 mm)；纸速：2 mm/min。
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2 实验方法
2.1 样品制备：精密称取干燥的湖北麦冬块根、须根粉末各2 g，置于索氏提取器内，加入20 mL甲醇，80 ℃水浴提取3～4 h至无色，挥干甲醇，用10 mL水分两次超声溶解残渣，水饱和正丁醇萃取4次(15，10，5，5 mL)，合并正丁醇部分，回收正丁醇至干。块根用甲醇定容至2 mL；须根用甲醇定容至10 mL；精密吸取2.5 mL，甲醇定容至10 mL。
2.2 标准曲线制备：精密称取对照品2.8 mg，用甲醇定容至10 mL，从中精密吸取0.25，0.5，1，1.5，2 mL对照品溶液，用甲醇定容至2 mL。分析结果：以峰面积的自然对数为纵坐标，对照品浓度×100的自然对数为横坐标，做标准曲线[5]。回归方程：lnA=8.560+1.409 lnC，r=0.999 2。
, 百拇医药
2.3 精密度试验：取0.21 mg/mL浓度的对照品，连续进样5次，得RSD=1.428%。
2.4 含量测定：取样品制备项下样品20 μL进样，每个样品测定3次，结果见表1，图1，2。
1-短葶山麦冬皂苷C 2-Ls-S7 3-Ls-S10 4-山麦冬皂苷B
图1 样品及其他皂苷HPLC图
图2 时间-含量关系曲线
表1 不同采集时间及部位山麦冬皂苷B的含量 时 间
须根(%)
, 百拇医药
块根(%)
1995-01-03
0.283
0.898 7×10-2
1995-01-19
0.158
1.046 5×10-2
1995-01-30
0.109
1.331 8×10-2
1995-02-16
, 百拇医药
0.185
1.344 2×10-2
1995-03-06
0.184
1.216 9×10-2
1995-03-22
0.247
1.526 2×10-2
二年生
0.190
2.5 加样回收率：精密称量3月6日的须根1 g，置于索氏提取器内，加入20 mL甲醇，回流3～4 h至无色，挥干甲醇，10 mL水分两次超声溶解残渣，加入山麦冬皂苷B 0.96 mg，其余步骤同“样品制备项下的须根的制备”，共做3次，回收率为106.6%，RSD=2.48%。
, 百拇医药
2.6 其它皂苷的影响：湖北麦冬中，除含有山麦冬皂苷B除外，尚还有其它皂苷，为了检验我们所选择的分离条件能否排除其它皂苷的干扰，将分得的短葶山麦冬皂苷C，Ls-S10，Ls-S7与山麦冬皂苷B混合，用测定条件分离，结果表明，所选用的色谱条件对山麦冬皂苷B具有较好的专属性。
2.7 湖北麦冬的失水率：把收集到的样品剪去须根，洗净泥土，沥干水分，称重，记录的重量为鲜重；置于80 ℃烘箱内，烘至恒重，记录的重量为干重。表2 湖北麦冬块根失水率 时 间
鲜重g
干重g
干/湿
1995-01-03
94
22.5
, 百拇医药
0.239
1995-01-19
41
12
0.293
1995-01-30
21
7
0.333
1995-02-16
110
44
0.400
, 百拇医药
1995-03-06
164
73
0.445
1995-03-22
258
128
0.496
3 讨论
3.1 从我们做的时间-含量曲线来看，湖北麦冬块根皂苷的含量以1月30日、2月16日、3月22日较高；同时，根据湖北麦冬块根干湿之比，这两天的比例相近。从外观上看，3月22日的湖北麦冬的个大、饱满，而1月30日、2月16日则瘦小、干瘪，因此，在清明采收为宜。
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3.2 从须根和块根的不同采收日期的皂苷含量曲线来看，这两部分的皂苷分布是不均匀的。1月3日须根中皂苷含量较高，而块根最低，随着时间的推移，块根中皂苷的含量逐渐升高，到1月30日至最高点，此时，须根中皂苷含量却最低，而后再逐渐升高。至3月22日，块根、须根中含量都较高，其中块根中皂苷含量至最高。■
霍英东教育基金资助项目
参考文献
1，余伯阳，等.中国中药杂志，1991，16(10)：584
2，高广猷，等.大连医学院学报，1984，6(3)：12
3，桂 苡，等.中草药，1984，15(3)：21
4，邓海根，等.药物分析杂志，1994，14(3)：61
5，冯埃生，等.药物分析杂志，1996，16(4)：414
6，田南卉，等.药物分析杂志，1997，17(4)：282
7，汤 俊，等.药物分析杂志，1999，19(4)：241
(收稿日期：1999-11-01), 百拇医药