黄芪总提物对佐剂性关节炎的抗氧化作用
作者：姚余有 王斌 李前进 李常玉 陈敏珠 曹正中
单位：姚余有 王斌 李前进 李常玉 陈敏珠(安徽医科大学，合肥 230032)；曹正中(江苏药物研究所,南京 210009)
关键词：氧自由基滑膜成纤维细胞滑膜细胞
中国临床药理学与治疗学000310
目的 研究黄芪总提物(total extract of astragalosides,TEA)对佐剂性关节炎(AA)大鼠的治疗作用与其抗氧化作用的关系。方法 测量(AA)大鼠非致炎侧足爪容积和滑膜细胞LPO；测量兔滑膜成纤维细胞的增殖量；间接测量体外超氧阴离子自由基(
)和羟自由基(.OH)产生量。结果 TEA对AA大鼠的阶段性治疗(90mg.kg-1.d-1，d15～23，ig)，不仅有抗关节炎作用，且可使AA鼠过高的滑膜细胞MDA水平降至正常；对低水平氧化应激诱导兔滑膜成纤维细胞的增殖反应，TEA(10～40μg.ml-1)有明显抑制作用。TEA(5～80μg.ml-1)对黄嘌呤(X)-黄嘌呤氧化酶(XO)体系以及非酶体系产生有明显抑制作用，高浓度TEA(80μg.ml-1以上)对XO的活性还有抑制作用；TEA(0.05～160μg.ml-1)对Fenton反应(Fe2+-H2O2)产生.OH引起苯甲酸羟化也有明显的浓度依赖性抑制作用。结论 TEA对AA鼠的治疗作用可能与其抗氧化作用有关。
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中图分类号 R966
Antioxidative effect of total axtract of astragalosides
YAO Yu-You，WANG Bin LI Chang-Yu，LI Qiang-Jing，CHEN Min-Zhu，CAO Zheng-Zhong
(Institute of Clinical Pharmacology, Anhui Medical University, Hefei 230032)
Aim The relationship between the therapeutic effect of TEA (total extract of astragalosides) on adjuvant arthritic (AA) rats and its antioxidative effects were studied . Methods The volume of non-injected hind paw of AA rats and malondialdehyde(MAD) content of arthritic synoviocytes from AA rats were measured and the proliferative responses of fibroblast, the level of superoxide anion() and the hydroxyl radical (. OH) generated in vitro were detected . Results The anti-inflammatory effect of TEA might be related to its antioxidative activity.In vitro low-level oxidative stress promoted the proliferative responses of fibroblast in rats synovium, which was marked by inhibited by TEA in a concentration-dependant manner. Further study showed that TEA could inhibit NBT reduction induced by both xanthine-xanthine oxidase and non-enzyme generated , but the inhibitory effect of this compound on activity of xanthine oxidase was obtained only at high concentration (more than 80 μ g. ml-1). It was also found that TEA could dose-dependantly inhibit the hydroxylation of benzoic acid induced by Fenton reaction generated . OH. Conclusion TEA has significant therapeutic effects on AA rats, which might be related to its antioxidative effects
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Key words oxygen free radical;fibroblast of synovium; synoviocyte
类风湿性关节炎(RA)是累及周身关节的慢性滑膜炎，是国际范围内的常见病。本室证明黄芪提取物(totalextractastragalosides,TEA)有免疫调节与抗炎作用，对大鼠佐剂性关节炎(AA)，既有抗关节炎作用，又可纠正异常免疫功能(待发表)。已知氧自由基在炎症病理过程中发挥着重要调节作用，可能参与RA和AA的病理过程[1]。本文拟用体内、外相结合的方法研究本品的抗氧化作用及其与抗关节炎作用的关系。
1材料与方法
1.1动物Wistar大鼠，♀、♂兼用，体重(160±30)g，由安徽省医学科学研究所实验动物中心提供，合格证号：皖医实动准第03号。新西兰家兔，♀、♂兼用，体重0.7～1.0kg，安徽医科大学动物科提供，合格证号：皖医实动准第06号。
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1.2药品与试剂TEA由南京药物研究所植化室提供，其主要成份为总甙，占50%以上，应用时用少量无水乙醇溶解后，再用PBS或营养液稀释至所需浓度(乙醇终浓度<0.2%)。硫代巴比妥酸(TBA)(BR)上海试剂二厂产品。卡介苗(BCG，批2号9101)：中国药品生物制品检定所产品。1，1，3，3-四乙氧基丙烷(tetraethoxypropane，TEP)，Fluka公司产品，由本校生化教研组张在和教授惠赠。黄嘌呤(X)，还原型辅酶Ⅰ二钠盐(NADH2Na2)均为上海东风生化试剂公司产品。硫酸甲酯吩嗪(phenazinemethosμlphate,PMS)，(AR级)，Fluka公司产品。氯化硝基四唑氮蓝(NBT)华美公司进口分装，用少量无水乙醇溶解后，再用PBS稀释到所需浓度。维生素E(VitE)Merck公司产品。甘露醇(AR级)北京双环化学试剂厂产品。苯甲酸(AR级)天津天泰精细化学品有限公司产品。硫酸亚铁江苏徐州试剂二厂产品。过氧化氢溶液(AR级)上海桃浦化工厂产品。RPMI1640培养粉Gibico公司产品，应用液另加25mmol.L-1HEPES，1mmol.L-1丙酮酸钠，2mmol.L-1谷氨酰胺，50μmol.L-1二巯基乙醇，100IU.ml-1青霉素，100μg.ml-1链霉素和10%小牛血清，pH调整至7.4。(3H)TdR(比放射性666TBq.mmol-1)中国原子能研究院产品。Ⅱ型胶原酶(collage-nase,typeⅡ)，Sigma公司产品、用营养液配制。胰蛋白酶(1∶250)，Difco产品进口分装，用无钙镁Hanks液配制。吲哚美辛(indomethacin,IM)上海第十二制药厂产品。
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1.3仪器Napco-6100型CO2培养箱，美国杜邦公司产品；FJ2107液体闪烁计数仪，西安262厂生产；Dyg-Ⅲ型多头细胞收集器，绍兴坡塘医疗器械厂生产；荧光分光光度计，日本日立公司产品；MK500型足爪容积测定仪，日本产。
1.4方法
1.4.1大鼠佐剂性关节炎(AA)模型制备和治疗按文献[2]制备，于每鼠左后足跖皮内注射0.1ml致炎，致炎后d15～23，ig，TEA90mg.kg-1.d-1(以往实验示此剂量疗效最佳)观察疗效。
1.4.2滑膜细胞MDA含量的测定(1)滑膜细胞的分离与培养参照文献[3]：无菌取出兔双侧膝关节滑膜，用0.4%胶原酶作用2h，再用0.25%胰蛋白酶37℃作用30min，分离出单个滑膜细胞。用含有5μg.ml-1LPS的DMEM培养液配制滑膜细胞悬液(5×105.ml-1)，加入24孔培养板内，每孔1ml，在37℃，5%CO2培养箱内培养48h。(2)MDA标准曲线的制备：用双蒸水配制5个不同浓度的TEP溶液(2、4、6、8、10nmol.ml-1)，各取1ml，加30%三氯醋酸1ml，静置5min后，离心(3000rpm，10min)取上清1ml加入0.67%TBA2ml，沸水浴中加热30min，流水冷却至室温，离心(3000rpm,10min)取上清在535nm处测吸光度(A)值，以TEP浓度为横坐标，吸光度为纵座标，绘制标准曲线(图1)。(3)滑膜细胞MDA含量的测定[4]，在贴壁的滑膜细胞中加入0.1ml内含0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA的培养液，作用10min后除去，加入冷生理盐水并用吸管冲打贴壁细胞2次，一并移入离心管，离心(1500rpm,10min)，弃上清，加15%三氯醋酸2ml，破坏细胞并沉淀蛋白质。以后步骤同上。最后根据吸光度值于标准曲线上查出MDA含量，结果以nmol.(5×105)cell-1表示。
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图1丙二醛标准曲线
1.4.3黄嘌呤(X)-黄嘌呤氧化酶(XO)系统产生O2的检测按文献[5]略作修改。反应总体积2ml，内含X，100μmol.L-1、NBT300μmol.L-1、0.1mol.L-1PBS(pH7.4)及不同浓度药物，37℃预温5min后，加入XO(0.014U.ml-1)起动反应，37℃反应30min，立即用2mmol.L-1CuCl2100μl终止反应，于560nm处测吸光度(A)。
1.4.4黄嘌呤氧化酶(XO)活力的检测按文献[3]略作修改。反应总体积4ml，内含黄嘌呤50μmol.L-1、不同浓度药物和0.1mol.ml-1PBS(pH7.4)，37℃预温5min后，用XO0.007U.ml-1起动反应，30min后用2mmol.L-1CuCl2200μl终止反应，于295nm处测吸光度为尿酸含量，间接反映黄嘌呤氧化酶的活力。
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1.4.5非酶体系产生的检测按文献[5]略作修改。反应总体积2ml，内含NADH78μmol.L-1、NBT50μmol.L-1、不同浓度药物和0.1mol.L-1PBS(pH7.4)，37℃预温5min后，加入PMS(10μmol.L-1)起动反应，10min后于560nm处测吸光度值。
1.4.6Fe2+-H2O2体系产生(.OH)的检测参照文献[6]略作修改。反应总体积3.5ml，依次加入不同浓度药物6mmol.L-1苯甲酸、500μmol.L-1FeSO4-1.5mmol.L-1EDTANa2和0.07mol.L-1PBS(pH7.4)，最后加入H2O21mmol.L-1，混匀后移入25℃水浴避光温育5h(工作曲线表明，5h的F值为峰值)。以荧光分光光度计激发波长300nm，发射波长408nm测荧光强度(fluorescence.F)，按下式计算清除率(F药-F空)/F空×100%。
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1.4.7兔滑膜成纤维细胞的分离、培养及增殖反应(1)滑膜成纤维细胞的分离与培养[7]：取兔双侧膝关节滑膜组织，剪成约1～2mm3小块，以RPMI1640培养液充分漂洗数次后，用弯头吸管吸取数小块，均匀排列在培养瓶的底壁上，轻轻翻转培养瓶，使瓶底朝上，置37℃，5%CO2中培养2h，使其贴壁，加入37℃预温的20%小牛血清-RPMI1640培养液少许，使液体刚覆盖组织块为宜，继续培养，每隔2～3日换营养液一次，待大量成纤维细胞长出组织块后，除去组织块，继续培养，待细胞长满瓶壁后，用0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA处理细胞并进行传代培养。(2)滑膜成纤维细胞的增殖反应[8]：用RPMI1640制备成纤维细胞悬液(1×105个.ml-1)加入96孔培养板，每孔100μl，置37℃，5%CO2中培养24h，使其贴壁，弃原培养液，加入低浓度FeSO4-H2O2体系，并补充营养液至200μl，继续培养72h，终止前6h，加入(3H)TdR(0.4uci/孔)。室温下用0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA处理细胞约10min。用多头细胞收集器收获细胞于69型玻璃纤维滤纸上，干燥后，用液闪仪测定放射性，结果以6个复孔的平均cpm值表示。
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图2TEA不同的处理方式对Fe2+-H2O2系统诱导的兔滑膜成纤维细胞增殖的作用
按图所示，兔滑膜成纤维细胞与或不与TEA(20μg.ml-1)预培养8h后，C组药物被洗去，再按图加入或不加入Fe2+-H2O2体系(各20μmol.L-1，±s，n=4),与正常对照组相比*P<0.05,**P<0.01;与Fe2+_H2O2相比＃＃P<0.01
1.5数据处理与统计学检验各组实验数据用
±s表示，计量资料组间比较采用Student’t检验。
2结果
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2.2TEA对低水平氧化应激(Fe2+-H2O2体系)诱导兔滑膜成纤维细胞增殖的影响表2结果显示，低浓度FeSO4-H2O2体系可明显促进兔滑膜成纤维细胞的增殖。本品有明显的抑制作用。本品20μg.ml-1与兔滑膜成纤维细胞预培养8h后，洗去药物，对Fe2+-H2O2体系诱导滑膜成纤维细胞的增殖反应仍有明显的抑制作用(图2)。
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表1TEA对佐剂性关节炎大鼠继发症反应以及滑膜细胞MDA含量的影响(±s) 组别
剂量/mg.kg-1.d-1
d24足爪容积/△ml
滑膜细胞MDA/nmol.(5×105cell)-1
正常对照组
2.21±0.30(4)
AA
0.84±0.24(8)
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4.31±1.78*(4)
AA+TEA
90
0.50±0.18＃＃(9)
1.80±0.51＃(4)
AA+吲哚美辛
2
0.46±0.16＃＃(8)
2.06±0.54(4)
弗氏完全佐剂于do接种，AA大鼠口服TEA或吲哚美辛连续9d，致炎后24d，非致炎侧后足爪体积被测量，且滑膜细胞被分离，然后与脂多糖(5μg.ml-1)共育48h，测定滑膜MDA含量。()代表样本数，与正常组相比*P<0.05;与AA对照相比＃P<0.05,＃＃P<0.01 表2TEA对Fe2+-H2O2体系、诱导的兔滑膜成纤维细胞增殖的抑制作用(±s，n=6) 组别
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浓度
[3H]TdR吸收量×10-2(cpm)
正常对照组
6.22±1.16
Fe2+-H2O2
9.03±2.51**
Fe2+-H2O2+TEA/μg.ml-1
10
4.73±1.12*##
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20
4.85±0.37*##
40
4.45±0.56*##
Fe2+-H2O2甘露醇/mmol.L-1
5
6.39±2.12
不同浓度TEA或甘露醇与兔滑膜成纤维细胞预培养8h后，加入FeSO4-H2O2(各20μmol.L-1)与正常对照组相比*P<0.05,**P<0.01;与Fe2+_H2O2对照相比＃＃P<0.01。表3TEA对黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系产生引起NBT还原的影响作用(±s,n=4) 药物
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浓度
吸光度
清除率%
TEA/μg.ml-1
0
0.704±0.005
1
0.695±0.004
1.3
5
0.661±0.005**
6.0
, 百拇医药
20
0.600±0.012**
14.8
40
0.536±0.010**
20.0
80
0.508±0.010**
27.7
VitE/μmol.L-1
0
0.729±0.005
, 百拇医药
600
0.636±0.010**
12.7
反应总体积2ml，内含100μmol.L-1黄嘌呤，0.014U.ml-1黄嘌呤氧化酶300μmol.L-1NBT，在37℃共育30min。560nm处测吸光度，与不含药物的对照相比*P<0.05,**P<0.01 表4TEA对黄嘌呤氧化酶活性的影响(±s,n=4) 浓度
吸光度
清除率%
0
0.738±0.006
1
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0.735±0.007
0.4
5
0.734±0.009
0.5
20
0.736±0.005
0.3
40
0.723±0.005
2.0
80
0.703±0.001*
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4.7
160
0.663±0.010**
10.1
4ml的反应总体积中含有50μmol.L-1黄嘌呤，0.007U.ml-1黄嘌呤氧化酶，不同浓度TEA，0.1mol.L-1PBS(pH7.4),37℃温育30min后，于295nm测吸光度。与不含药物的对照相比*P<0.05,**P<0.01 表5TEA对非酶体系产生2引起NBT还原的影响(±s,n=4) 药物
浓度
吸光度
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清除率%
TEA/μg.ml-1
0
0.486±0.008
1
0.483±0.006
0.6
5
0.469±0.005**
3.5
20
0.386±0.005**
, 百拇医药
20.5
40
0.368±0.006**
24.5
80
0.366±0.003
24.6
VitE/μmol.L-1
0
0.591±0.013
600
0.544±0.008**
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7.9
2ml0.1mol.l-1PBS(pH7.4)中含10μmol.L-1PMS、78μmol.L-1NADH和50μmol.L-1NBT,37℃温育10min后，于560nm处测吸光度。与不含药物的对照相比**P<0.01表6TEA对Fe2+-H2O2体系产生(.OH)引起苯甲酸羟化的影响(±s,n=4) 药物
浓度
吸光度
清除率%
TEA/μg.ml-1
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0
41.8±1.4
0.1
41.9±1.8
0
0.5
38.2±0.7*
8.6
5
32.9±0.5**
21.2
20
27.1±0.7**
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35.2
40
22.7±0.9**
45.7
80
15.9±1.3**
62.0
160
13.3±0.8**
68
甘露醇/mmol.L-1
0
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42.1±1.6
0.625
36.7±0.5**
12.8
1.25
33.8±0.6**
19.7
2.5
30.1±0.8**
28.5
5.0
26.5±0.9**
, 百拇医药
37.0
10.0
20.6±0.7**
51.0
3.5ml0.07mol.L-1PBS(pH7.4)的溶液中含不同浓度TEA、6mmol.L-1苯甲酸、0.5mmol.L-1FeSO4.7H2O-1.5mmol.L-1EDTA-Na2、1mmol.L-1过氧化氢。25℃温育5h后，在激发波长300nm，发射波长408nm处测荧光值，与不含药物对照相比*P<0.05,**P<0.01
2.3TEA对体外黄嘌呤氧化酶和非酶体系产生的影响(1)对黄嘌呤(X)-黄嘌呤氧化酶(XO)体系产生引起NBT还原的影响。表3结果表明本品(5～80μg.ml-1)可浓度依赖性地抑制X-XO体系引起NBT还原显色反应，提示本品可降低X-XO体系产生。(2)对黄嘌呤氧化酶(XO)活性的影响，见表4。表4结果表明，本品仅在高浓度(80μg.ml-1以上)时才对XO活性有抑制作用。(3)对非酶体系产生引起NBT还原的影响。在碱性条件下，PMS自氧化产生引起NBT还原显色。表5结果表明，本品(5～80μg.ml-1)可明显抑制非酶体系产生引起NBT显色反应。
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2.4TEA对Fe2+-H2O2体系(Fenton反应)产生(.OH)引起苯甲酸羟化的影响本品与甘露醇(.OH捕捉剂)均可浓度依赖性地抑制Fenton反应引起的苯甲酸羟化，提示它与甘露醇相似有捕捉(.OH)的作用。若以药物的对数浓度为X，清除率为Y，可得本品的直线回归方程为Y1=10.13+23.17X1，r=0.923，P<0.01，IC50="52.57"μg.ml-1；甘露醇的直线回归方程为Y2="17.40+"31.20X2，r="0.906，"P<0.01，IC50="11.09"mmol.L-1(表6)。
3讨论
本文结果表明，AA大鼠发生多发性关节炎期间，其滑膜细胞的LPO水平明显升高，本品的阶段性治疗(d15～23)有明显的抗关节炎作用，同时使其过高的滑膜细胞LPO降至正常水平，提示其抗关节炎作用可能与其抗氧化作用有关。滑膜成纤维细胞等的过度增殖构成了RA的特征性血管翳，这是导致关节软骨与骨损伤的一种重要因素[9]，本文体外实验结果表明，低浓度Fe2+-H2O2体系可促进兔滑膜成纤维细胞的增殖，本品(10～40μg.ml-1)预处理滑膜成纤维细胞8h或共培养对Fe2+-H2O2体系诱导兔滑膜成纤维细胞的增殖反应均有抑制作用，且作用强度相近，不仅表明本品的抗增殖作用与其抗氧作用有关，而且提示该药可在细胞内外发挥作用，其作用机理有待进一步研究。超氧阴离子()与羟自由基(.OH)均是体内主要的氧自由基。可直接产生脂质过氧化也可通过.OH导致脂质过氧化[10]。本文结果表明TEA对X-XO系统以及非酶体系引起的NBT还原有显著抑制作用，但仅在较高浓度(80μg.ml-1以上)时才呈现抑制XO的活性，提示本品兼有强的直接捕获和弱的抑制产生的作用。结果还表明本品与甘露醇(.OH清除剂)类似均可浓度依赖性地抑制苯甲酸羟化，提示本品有直接捕获.OH的作用，且其作用较甘露醇为强(本品与甘露醇IC50分别为52.57μg.ml-1和2.20mg.ml-1)。综上所述，本品对AA大鼠既有抗关节炎作用，又可降低其滑膜细胞的脂质过氧化水平，对体外低浓度Fe2+-H2O2体系促进滑膜成纤维细胞的增殖反应有明显的保护作用，进一步研究表明本品兼有直接捕获和减少产生的双重作用，以及直接清除.OH的作用。提示其抗氧化作用可能是其抗关节炎作用的机理之一。
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姚余有，男，34岁，药理学硕士，讲师，主要研究抗炎免疫药理学。
陈敏珠，女，67岁，教授，博士生导师。
参 考 文 献
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2，陈敏珠.抗炎药物筛选规程.见：周金黄，主编.药理学进展.第1版.北京：人民卫生出版社，1982∶178
3，王斌，陈敏珠，徐叔云.大鼠滑膜细胞的分离和培养.中国药理学通报，1994；10(1)：73
4，Victore， Gavino， James S,et al. Effect of polyunsat-urated fatty acid and antioxidants on lipid. J Lipid Research,1981;22： 763
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5，Robak J, Ryszard J. Flavoids are scavengers of su-peroxide anions.Biochem Phar, 1988;37(5):837
6，邓柯玉，辛洪波，张宝恒.云南甘草总皂甙清除氧自由基和抗脂质过氧化作用.中国药理学通报，1993；9(5)：350
7，鄂征.细胞的分离与培养.见：鄂征，主编.组织培养技术.第2版.北京：人民卫生出版社，1988：127
8，Gitter BD,Labus JM. Charactristics of human syn-ovial firbroblast activation by IL- 1 and TNFa. Im-munol, 1989;66(2)∶ 196
9，王斌，陈敏珠，徐叔云.类风湿性关节炎滑膜细胞功能的研究进展.中国药理学通报，1993；9(2)：99
10，方允中.生物体内自由基的产生和清除，见:方允中，李文杰，主编.自由基与酶.北京：科学出版社，1989：147
2000-06-03收稿，2000-07-17修回, 百拇医药
单位：姚余有 王斌 李前进 李常玉 陈敏珠(安徽医科大学，合肥 230032)；曹正中(江苏药物研究所,南京 210009)
关键词：氧自由基滑膜成纤维细胞滑膜细胞
中国临床药理学与治疗学000310
目的 研究黄芪总提物(total extract of astragalosides,TEA)对佐剂性关节炎(AA)大鼠的治疗作用与其抗氧化作用的关系。方法 测量(AA)大鼠非致炎侧足爪容积和滑膜细胞LPO；测量兔滑膜成纤维细胞的增殖量；间接测量体外超氧阴离子自由基(
)和羟自由基(.OH)产生量。结果 TEA对AA大鼠的阶段性治疗(90mg.kg-1.d-1，d15～23，ig)，不仅有抗关节炎作用，且可使AA鼠过高的滑膜细胞MDA水平降至正常；对低水平氧化应激诱导兔滑膜成纤维细胞的增殖反应，TEA(10～40μg.ml-1)有明显抑制作用。TEA(5～80μg.ml-1)对黄嘌呤(X)-黄嘌呤氧化酶(XO)体系以及非酶体系产生有明显抑制作用，高浓度TEA(80μg.ml-1以上)对XO的活性还有抑制作用；TEA(0.05～160μg.ml-1)对Fenton反应(Fe2+-H2O2)产生.OH引起苯甲酸羟化也有明显的浓度依赖性抑制作用。结论 TEA对AA鼠的治疗作用可能与其抗氧化作用有关。, 百拇医药
中图分类号 R966
Antioxidative effect of total axtract of astragalosides
YAO Yu-You，WANG Bin LI Chang-Yu，LI Qiang-Jing，CHEN Min-Zhu，CAO Zheng-Zhong
(Institute of Clinical Pharmacology, Anhui Medical University, Hefei 230032)
Aim The relationship between the therapeutic effect of TEA (total extract of astragalosides) on adjuvant arthritic (AA) rats and its antioxidative effects were studied . Methods The volume of non-injected hind paw of AA rats and malondialdehyde(MAD) content of arthritic synoviocytes from AA rats were measured and the proliferative responses of fibroblast, the level of superoxide anion(
) and the hydroxyl radical (. OH) generated in vitro were detected . Results The anti-inflammatory effect of TEA might be related to its antioxidative activity.In vitro low-level oxidative stress promoted the proliferative responses of fibroblast in rats synovium, which was marked by inhibited by TEA in a concentration-dependant manner. Further study showed that TEA could inhibit NBT reduction induced by both xanthine-xanthine oxidase and non-enzyme generated , but the inhibitory effect of this compound on activity of xanthine oxidase was obtained only at high concentration (more than 80 μ g. ml-1). It was also found that TEA could dose-dependantly inhibit the hydroxylation of benzoic acid induced by Fenton reaction generated . OH. Conclusion TEA has significant therapeutic effects on AA rats, which might be related to its antioxidative effects, 百拇医药
Key words oxygen free radical;fibroblast of synovium; synoviocyte
类风湿性关节炎(RA)是累及周身关节的慢性滑膜炎，是国际范围内的常见病。本室证明黄芪提取物(totalextractastragalosides,TEA)有免疫调节与抗炎作用，对大鼠佐剂性关节炎(AA)，既有抗关节炎作用，又可纠正异常免疫功能(待发表)。已知氧自由基在炎症病理过程中发挥着重要调节作用，可能参与RA和AA的病理过程[1]。本文拟用体内、外相结合的方法研究本品的抗氧化作用及其与抗关节炎作用的关系。
1材料与方法
1.1动物Wistar大鼠，♀、♂兼用，体重(160±30)g，由安徽省医学科学研究所实验动物中心提供，合格证号：皖医实动准第03号。新西兰家兔，♀、♂兼用，体重0.7～1.0kg，安徽医科大学动物科提供，合格证号：皖医实动准第06号。
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1.2药品与试剂TEA由南京药物研究所植化室提供，其主要成份为总甙，占50%以上，应用时用少量无水乙醇溶解后，再用PBS或营养液稀释至所需浓度(乙醇终浓度<0.2%)。硫代巴比妥酸(TBA)(BR)上海试剂二厂产品。卡介苗(BCG，批2号9101)：中国药品生物制品检定所产品。1，1，3，3-四乙氧基丙烷(tetraethoxypropane，TEP)，Fluka公司产品，由本校生化教研组张在和教授惠赠。黄嘌呤(X)，还原型辅酶Ⅰ二钠盐(NADH2Na2)均为上海东风生化试剂公司产品。硫酸甲酯吩嗪(phenazinemethosμlphate,PMS)，(AR级)，Fluka公司产品。氯化硝基四唑氮蓝(NBT)华美公司进口分装，用少量无水乙醇溶解后，再用PBS稀释到所需浓度。维生素E(VitE)Merck公司产品。甘露醇(AR级)北京双环化学试剂厂产品。苯甲酸(AR级)天津天泰精细化学品有限公司产品。硫酸亚铁江苏徐州试剂二厂产品。过氧化氢溶液(AR级)上海桃浦化工厂产品。RPMI1640培养粉Gibico公司产品，应用液另加25mmol.L-1HEPES，1mmol.L-1丙酮酸钠，2mmol.L-1谷氨酰胺，50μmol.L-1二巯基乙醇，100IU.ml-1青霉素，100μg.ml-1链霉素和10%小牛血清，pH调整至7.4。(3H)TdR(比放射性666TBq.mmol-1)中国原子能研究院产品。Ⅱ型胶原酶(collage-nase,typeⅡ)，Sigma公司产品、用营养液配制。胰蛋白酶(1∶250)，Difco产品进口分装，用无钙镁Hanks液配制。吲哚美辛(indomethacin,IM)上海第十二制药厂产品。
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1.3仪器Napco-6100型CO2培养箱，美国杜邦公司产品；FJ2107液体闪烁计数仪，西安262厂生产；Dyg-Ⅲ型多头细胞收集器，绍兴坡塘医疗器械厂生产；荧光分光光度计，日本日立公司产品；MK500型足爪容积测定仪，日本产。
1.4方法
1.4.1大鼠佐剂性关节炎(AA)模型制备和治疗按文献[2]制备，于每鼠左后足跖皮内注射0.1ml致炎，致炎后d15～23，ig，TEA90mg.kg-1.d-1(以往实验示此剂量疗效最佳)观察疗效。
1.4.2滑膜细胞MDA含量的测定(1)滑膜细胞的分离与培养参照文献[3]：无菌取出兔双侧膝关节滑膜，用0.4%胶原酶作用2h，再用0.25%胰蛋白酶37℃作用30min，分离出单个滑膜细胞。用含有5μg.ml-1LPS的DMEM培养液配制滑膜细胞悬液(5×105.ml-1)，加入24孔培养板内，每孔1ml，在37℃，5%CO2培养箱内培养48h。(2)MDA标准曲线的制备：用双蒸水配制5个不同浓度的TEP溶液(2、4、6、8、10nmol.ml-1)，各取1ml，加30%三氯醋酸1ml，静置5min后，离心(3000rpm，10min)取上清1ml加入0.67%TBA2ml，沸水浴中加热30min，流水冷却至室温，离心(3000rpm,10min)取上清在535nm处测吸光度(A)值，以TEP浓度为横坐标，吸光度为纵座标，绘制标准曲线(图1)。(3)滑膜细胞MDA含量的测定[4]，在贴壁的滑膜细胞中加入0.1ml内含0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA的培养液，作用10min后除去，加入冷生理盐水并用吸管冲打贴壁细胞2次，一并移入离心管，离心(1500rpm,10min)，弃上清，加15%三氯醋酸2ml，破坏细胞并沉淀蛋白质。以后步骤同上。最后根据吸光度值于标准曲线上查出MDA含量，结果以nmol.(5×105)cell-1表示。
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图1丙二醛标准曲线
1.4.3黄嘌呤(X)-黄嘌呤氧化酶(XO)系统产生O2的检测按文献[5]略作修改。反应总体积2ml，内含X，100μmol.L-1、NBT300μmol.L-1、0.1mol.L-1PBS(pH7.4)及不同浓度药物，37℃预温5min后，加入XO(0.014U.ml-1)起动反应，37℃反应30min，立即用2mmol.L-1CuCl2100μl终止反应，于560nm处测吸光度(A)。
1.4.4黄嘌呤氧化酶(XO)活力的检测按文献[3]略作修改。反应总体积4ml，内含黄嘌呤50μmol.L-1、不同浓度药物和0.1mol.ml-1PBS(pH7.4)，37℃预温5min后，用XO0.007U.ml-1起动反应，30min后用2mmol.L-1CuCl2200μl终止反应，于295nm处测吸光度为尿酸含量，间接反映黄嘌呤氧化酶的活力。
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1.4.5非酶体系产生
的检测按文献[5]略作修改。反应总体积2ml，内含NADH78μmol.L-1、NBT50μmol.L-1、不同浓度药物和0.1mol.L-1PBS(pH7.4)，37℃预温5min后，加入PMS(10μmol.L-1)起动反应，10min后于560nm处测吸光度值。1.4.6Fe2+-H2O2体系产生(.OH)的检测参照文献[6]略作修改。反应总体积3.5ml，依次加入不同浓度药物6mmol.L-1苯甲酸、500μmol.L-1FeSO4-1.5mmol.L-1EDTANa2和0.07mol.L-1PBS(pH7.4)，最后加入H2O21mmol.L-1，混匀后移入25℃水浴避光温育5h(工作曲线表明，5h的F值为峰值)。以荧光分光光度计激发波长300nm，发射波长408nm测荧光强度(fluorescence.F)，按下式计算清除率(F药-F空)/F空×100%。
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1.4.7兔滑膜成纤维细胞的分离、培养及增殖反应(1)滑膜成纤维细胞的分离与培养[7]：取兔双侧膝关节滑膜组织，剪成约1～2mm3小块，以RPMI1640培养液充分漂洗数次后，用弯头吸管吸取数小块，均匀排列在培养瓶的底壁上，轻轻翻转培养瓶，使瓶底朝上，置37℃，5%CO2中培养2h，使其贴壁，加入37℃预温的20%小牛血清-RPMI1640培养液少许，使液体刚覆盖组织块为宜，继续培养，每隔2～3日换营养液一次，待大量成纤维细胞长出组织块后，除去组织块，继续培养，待细胞长满瓶壁后，用0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA处理细胞并进行传代培养。(2)滑膜成纤维细胞的增殖反应[8]：用RPMI1640制备成纤维细胞悬液(1×105个.ml-1)加入96孔培养板，每孔100μl，置37℃，5%CO2中培养24h，使其贴壁，弃原培养液，加入低浓度FeSO4-H2O2体系，并补充营养液至200μl，继续培养72h，终止前6h，加入(3H)TdR(0.4uci/孔)。室温下用0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA处理细胞约10min。用多头细胞收集器收获细胞于69型玻璃纤维滤纸上，干燥后，用液闪仪测定放射性，结果以6个复孔的平均cpm值表示。
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图2TEA不同的处理方式对Fe2+-H2O2系统诱导的兔滑膜成纤维细胞增殖的作用
按图所示，兔滑膜成纤维细胞与或不与TEA(20μg.ml-1)预培养8h后，C组药物被洗去，再按图加入或不加入Fe2+-H2O2体系(各20μmol.L-1，±s，n=4),与正常对照组相比*P<0.05,**P<0.01;与Fe2+_H2O2相比＃＃P<0.01
1.5数据处理与统计学检验各组实验数据用
±s表示，计量资料组间比较采用Student’t检验。2结果
, 百拇医药 2.1TEA对AA大鼠多发性关节炎及其滑膜细胞脂质过氧化的影响大鼠致炎后d15～23，按表1分组与ig给药。d24测大鼠非致炎侧足爪容积，并分离关节滑膜细胞和测定其LPO产物MDA含量。结果显示，本品(90mg.kg-1.d-1，ig×9d)有明显的抗关节炎作用，同时可使AA鼠过高的滑膜细胞MDA含量降至正常水平。IM在发挥抗炎作用的同时，也可使滑膜细胞的MDA呈下降趋势，但无统计学差异。
2.2TEA对低水平氧化应激(Fe2+-H2O2体系)诱导兔滑膜成纤维细胞增殖的影响表2结果显示，低浓度FeSO4-H2O2体系可明显促进兔滑膜成纤维细胞的增殖。本品有明显的抑制作用。本品20μg.ml-1与兔滑膜成纤维细胞预培养8h后，洗去药物，对Fe2+-H2O2体系诱导滑膜成纤维细胞的增殖反应仍有明显的抑制作用(图2)。
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表1TEA对佐剂性关节炎大鼠继发症反应以及滑膜细胞MDA含量的影响(
±s) 组别剂量/mg.kg-1.d-1
d24足爪容积/△ml
滑膜细胞MDA/nmol.(5×105cell)-1
正常对照组
2.21±0.30(4)
AA
0.84±0.24(8)
, 百拇医药
4.31±1.78*(4)
AA+TEA
90
0.50±0.18＃＃(9)
1.80±0.51＃(4)
AA+吲哚美辛
2
0.46±0.16＃＃(8)
2.06±0.54(4)
弗氏完全佐剂于do接种，AA大鼠口服TEA或吲哚美辛连续9d，致炎后24d，非致炎侧后足爪体积被测量，且滑膜细胞被分离，然后与脂多糖(5μg.ml-1)共育48h，测定滑膜MDA含量。()代表样本数，与正常组相比*P<0.05;与AA对照相比＃P<0.05,＃＃P<0.01 表2TEA对Fe2+-H2O2体系、诱导的兔滑膜成纤维细胞增殖的抑制作用(
±s，n=6) 组别, http://www.100md.com
浓度
[3H]TdR吸收量×10-2(cpm)
正常对照组
6.22±1.16
Fe2+-H2O2
9.03±2.51**
Fe2+-H2O2+TEA/μg.ml-1
10
4.73±1.12*##
, 百拇医药
20
4.85±0.37*##
40
4.45±0.56*##
Fe2+-H2O2甘露醇/mmol.L-1
5
6.39±2.12
不同浓度TEA或甘露醇与兔滑膜成纤维细胞预培养8h后，加入FeSO4-H2O2(各20μmol.L-1)与正常对照组相比*P<0.05,**P<0.01;与Fe2+_H2O2对照相比＃＃P<0.01。表3TEA对黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系产生引起NBT还原的影响作用(
±s,n=4) 药物, 百拇医药
浓度
吸光度
清除率%
TEA/μg.ml-1
0
0.704±0.005
1
0.695±0.004
1.3
5
0.661±0.005**
6.0
, 百拇医药
20
0.600±0.012**
14.8
40
0.536±0.010**
20.0
80
0.508±0.010**
27.7
VitE/μmol.L-1
0
0.729±0.005
, 百拇医药
600
0.636±0.010**
12.7
反应总体积2ml，内含100μmol.L-1黄嘌呤，0.014U.ml-1黄嘌呤氧化酶300μmol.L-1NBT，在37℃共育30min。560nm处测吸光度，与不含药物的对照相比*P<0.05,**P<0.01 表4TEA对黄嘌呤氧化酶活性的影响(±s,n=4) 浓度
吸光度
清除率%
0
0.738±0.006
1
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0.735±0.007
0.4
5
0.734±0.009
0.5
20
0.736±0.005
0.3
40
0.723±0.005
2.0
80
0.703±0.001*
, 百拇医药
4.7
160
0.663±0.010**
10.1
4ml的反应总体积中含有50μmol.L-1黄嘌呤，0.007U.ml-1黄嘌呤氧化酶，不同浓度TEA，0.1mol.L-1PBS(pH7.4),37℃温育30min后，于295nm测吸光度。与不含药物的对照相比*P<0.05,**P<0.01 表5TEA对非酶体系产生2引起NBT还原的影响(
±s,n=4) 药物浓度
吸光度
, 百拇医药
清除率%
TEA/μg.ml-1
0
0.486±0.008
1
0.483±0.006
0.6
5
0.469±0.005**
3.5
20
0.386±0.005**
, 百拇医药
20.5
40
0.368±0.006**
24.5
80
0.366±0.003
24.6
VitE/μmol.L-1
0
0.591±0.013
600
0.544±0.008**
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7.9
2ml0.1mol.l-1PBS(pH7.4)中含10μmol.L-1PMS、78μmol.L-1NADH和50μmol.L-1NBT,37℃温育10min后，于560nm处测吸光度。与不含药物的对照相比**P<0.01表6TEA对Fe2+-H2O2体系产生(.OH)引起苯甲酸羟化的影响(
±s,n=4) 药物浓度
吸光度
清除率%
TEA/μg.ml-1
, 百拇医药
0
41.8±1.4
0.1
41.9±1.8
0
0.5
38.2±0.7*
8.6
5
32.9±0.5**
21.2
20
27.1±0.7**
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35.2
40
22.7±0.9**
45.7
80
15.9±1.3**
62.0
160
13.3±0.8**
68
甘露醇/mmol.L-1
0
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42.1±1.6
0.625
36.7±0.5**
12.8
1.25
33.8±0.6**
19.7
2.5
30.1±0.8**
28.5
5.0
26.5±0.9**
, 百拇医药
37.0
10.0
20.6±0.7**
51.0
3.5ml0.07mol.L-1PBS(pH7.4)的溶液中含不同浓度TEA、6mmol.L-1苯甲酸、0.5mmol.L-1FeSO4.7H2O-1.5mmol.L-1EDTA-Na2、1mmol.L-1过氧化氢。25℃温育5h后，在激发波长300nm，发射波长408nm处测荧光值，与不含药物对照相比*P<0.05,**P<0.01
2.3TEA对体外黄嘌呤氧化酶和非酶体系产生的影响(1)对黄嘌呤(X)-黄嘌呤氧化酶(XO)体系产生引起NBT还原的影响。表3结果表明本品(5～80μg.ml-1)可浓度依赖性地抑制X-XO体系引起NBT还原显色反应，提示本品可降低X-XO体系产生。(2)对黄嘌呤氧化酶(XO)活性的影响，见表4。表4结果表明，本品仅在高浓度(80μg.ml-1以上)时才对XO活性有抑制作用。(3)对非酶体系产生引起NBT还原的影响。在碱性条件下，PMS自氧化产生引起NBT还原显色。表5结果表明，本品(5～80μg.ml-1)可明显抑制非酶体系产生引起NBT显色反应。
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2.4TEA对Fe2+-H2O2体系(Fenton反应)产生(.OH)引起苯甲酸羟化的影响本品与甘露醇(.OH捕捉剂)均可浓度依赖性地抑制Fenton反应引起的苯甲酸羟化，提示它与甘露醇相似有捕捉(.OH)的作用。若以药物的对数浓度为X，清除率为Y，可得本品的直线回归方程为Y1=10.13+23.17X1，r=0.923，P<0.01，IC50="52.57"μg.ml-1；甘露醇的直线回归方程为Y2="17.40+"31.20X2，r="0.906，"P<0.01，IC50="11.09"mmol.L-1(表6)。
3讨论
本文结果表明，AA大鼠发生多发性关节炎期间，其滑膜细胞的LPO水平明显升高，本品的阶段性治疗(d15～23)有明显的抗关节炎作用，同时使其过高的滑膜细胞LPO降至正常水平，提示其抗关节炎作用可能与其抗氧化作用有关。滑膜成纤维细胞等的过度增殖构成了RA的特征性血管翳，这是导致关节软骨与骨损伤的一种重要因素[9]，本文体外实验结果表明，低浓度Fe2+-H2O2体系可促进兔滑膜成纤维细胞的增殖，本品(10～40μg.ml-1)预处理滑膜成纤维细胞8h或共培养对Fe2+-H2O2体系诱导兔滑膜成纤维细胞的增殖反应均有抑制作用，且作用强度相近，不仅表明本品的抗增殖作用与其抗氧作用有关，而且提示该药可在细胞内外发挥作用，其作用机理有待进一步研究。超氧阴离子()与羟自由基(.OH)均是体内主要的氧自由基。可直接产生脂质过氧化也可通过.OH导致脂质过氧化[10]。本文结果表明TEA对X-XO系统以及非酶体系引起的NBT还原有显著抑制作用，但仅在较高浓度(80μg.ml-1以上)时才呈现抑制XO的活性，提示本品兼有强的直接捕获和弱的抑制产生的作用。结果还表明本品与甘露醇(.OH清除剂)类似均可浓度依赖性地抑制苯甲酸羟化，提示本品有直接捕获.OH的作用，且其作用较甘露醇为强(本品与甘露醇IC50分别为52.57μg.ml-1和2.20mg.ml-1)。综上所述，本品对AA大鼠既有抗关节炎作用，又可降低其滑膜细胞的脂质过氧化水平，对体外低浓度Fe2+-H2O2体系促进滑膜成纤维细胞的增殖反应有明显的保护作用，进一步研究表明本品兼有直接捕获和减少产生的双重作用，以及直接清除.OH的作用。提示其抗氧化作用可能是其抗关节炎作用的机理之一。
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姚余有，男，34岁，药理学硕士，讲师，主要研究抗炎免疫药理学。
陈敏珠，女，67岁，教授，博士生导师。
参 考 文 献
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2，陈敏珠.抗炎药物筛选规程.见：周金黄，主编.药理学进展.第1版.北京：人民卫生出版社，1982∶178
3，王斌，陈敏珠，徐叔云.大鼠滑膜细胞的分离和培养.中国药理学通报，1994；10(1)：73
4，Victore， Gavino， James S,et al. Effect of polyunsat-urated fatty acid and antioxidants on lipid. J Lipid Research,1981;22： 763
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5，Robak J, Ryszard J. Flavoids are scavengers of su-peroxide anions.Biochem Phar, 1988;37(5):837
6，邓柯玉，辛洪波，张宝恒.云南甘草总皂甙清除氧自由基和抗脂质过氧化作用.中国药理学通报，1993；9(5)：350
7，鄂征.细胞的分离与培养.见：鄂征，主编.组织培养技术.第2版.北京：人民卫生出版社，1988：127
8，Gitter BD,Labus JM. Charactristics of human syn-ovial firbroblast activation by IL- 1 and TNFa. Im-munol, 1989;66(2)∶ 196
9，王斌，陈敏珠，徐叔云.类风湿性关节炎滑膜细胞功能的研究进展.中国药理学通报，1993；9(2)：99
10，方允中.生物体内自由基的产生和清除，见:方允中，李文杰，主编.自由基与酶.北京：科学出版社，1989：147
2000-06-03收稿，2000-07-17修回, 百拇医药