Fas和Fasl在乙型肝炎肝组织中表达的免疫组化研究
作者：梅存金 王海舰 郎振为
单位：梅存金(徐州市传染病医院 221004)；王海舰(徐州市传染病医院 221004)；郎振为(北京佑安医院 100054)
关键词：乙型肝炎；凋亡；Fas/Fasl
黑龙江医药科学000318 提要 目的：探讨Fas、Fasl在乙型肝炎肝组织中表达与肝细胞损伤的关系。方法：采用免疫组化方法活检或尸检60例急、慢性乙型肝病肝组织中Fas及Fasl的表达情况。结果：Fas、Fasl的检出率分别为76.7%及73.3%。Fas在肝细胞浆内表达，Fas见于肝内浸润的淋巴细胞中，也见于肝细胞浆内表达。Fasl阳性淋巴细胞主要分布于汇管内，与Fas抗原阳性肝细胞分布一致。免疫组化双标记染色示Fas及Fasl可在同一肝细胞内表达。结论：Fas/Fasl系统在乙型肝炎细胞损伤中起重要作用。
细胞凋亡与病毒性肝炎的发生、发展有着密切关系，Nagata在给转基因小鼠体内注射抗Fas单抗后引起广泛性肝细胞坏死，认为其可能与暴发型肝炎发病有关[1]，引起肝病学者的高度重视。我们采用免疫组化方法检测了60例急、慢性乙型肝病肝组织中Fas和Fasl的原位表达及分布，现总结如下。
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1 材料与方法
1.1 材料来源
选择1992～1995年北京佑安医院病理科收集的活检及部分尸检肝组织标本60例。血清学检查乙肝病毒标志均阳性，病理诊断按1995年北京全国传染病和寄生虫病会议修订的诊断标准。其中急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎及活动性肝硬变各20例。
1.2 试验方法
肝组织经10%甲醛固定，石蜡包埋，连续5um厚切片。二甲苯脱蜡，H2O2处理。分别做HE染色及免疫组织化学检测，按说明书操作。每例标本分别作Fas及Fasl检测，阳性标本再进行Fas/Fasl免疫组化双标记检测。选用预试验中Fas抗原阳性的慢性乙型肝炎肝组织及Fasl阳性的慢性淋巴结炎组织切片为阳性对照。血清学检测HA-E标志均阴性，免疫组化检测HBsAg、HBcAg及HCVNS3-Ag均阴性的正常肝组织为阴性对照。另用兔血清和磷酸盐缓冲液代替-抗为空白及替代对照，以检验其特异性和可靠性。兔抗Fas、兔抗Fasl多克隆抗体及免疫组织化学双染试剂盒均为美国ZymedLab公司产品，购自北京中山生物技术公司。血清学检测采用ELISA法，试剂盒购自北京肝病研究所。
, 百拇医药
2 结果
2.1 单标记染色
Fas抗原在急性肝炎，慢性肝炎及活动性肝硬变3组肝组织中分别检出13、16及17例。Fas抗原呈细颗粒状分布于肝细胞浆内，急性乙型肝炎Fas抗原在肝小叶内弥散分布，慢性肝炎及活动性肝硬变则多聚集在碎屑样坏死区或假小叶周边肝细胞。Fasl在3组不同肝组织中分别检出11、15、18例。Fasl阳性颗粒定位于淋巴细胞及肝细胞浆内。在Fasl阳性表达的各型肝组织切片中，急性乙型肝炎组有9例表达于汇管区浸润的淋巴细胞内，1例于肝细胞内表达，1例于淋巴细胞及肝细胞内均见表达；慢性肝炎组有6例表达于淋巴细胞，4例于肝细胞内表达，5例淋巴细胞及肝细胞同时表达；活动性肝硬变组有4例表达于淋巴细胞，5例于肝细胞内表达，9例淋巴细胞与肝细胞同时表达。各型肝炎肝组织Fasl阳性细胞的分布与Fas抗原阳性肝细胞分布一致，Fasl阳性淋巴细胞多弥散分布于汇管区周围，小叶内较少见。
, http://www.100md.com 2.2 双标记染色
急、慢性肝炎肝细胞内Fas及Fasl同时检出分别为1例和3例。活动性肝硬变同时检出8例。Fas及Fasl分别经碱性磷酸酶或辣根过氧化物显色后，可见Fas及Fasl在同一肝细胞或不同肝细胞内表达，分布与单标记染色相同。急慢性乙型肝炎及活动性肝硬变Fas/Fasl，检结果见附表。
附表 急慢性乙型肝炎及活动肝硬化变Fas/Fasl检测结果 病理分型
例数
单标记染色(%)
双标记染色(%)
Fas+Fasl
Fas
Fasl
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急性乙型肝炎
20
13(65.0)
11(55.0)
1(5.0)
慢性乙型肝炎
20
16(80.0)
15(75.0)
3(15.0)
活动性肝硬变
20
, http://www.100md.com 17(85.0)
18(80.0)
8(40.0)
合计
20
46(76.7)
44(73.3)
12(20.0)
正常肝组织Fas及Fasl检测均阴性，阳性病例切片用兔血清或磷酸盐缓冲液代替-抗后，原Fas、Fasl阳性标本均阴性。
3 讨论
在病毒性肝炎时，受染肝细胞表面表达了大量病毒抗原，并可诱导Fas抗原的表达[1]。病毒抗原、病毒抗原肽-MHCI类分子被淋巴细胞识别受体(TCR)识别，激活特异性细胞毒性淋巴细胞(CTL)并表达Fasl。通过Fas/Fasl机制介导肝细胞凋亡[2]。Ryo等研究表明，慢性肝炎的肝细胞表面Fas抗原表达强烈，并可测到大量富于Fasl的CD+8细胞[3]。Kagi等将HBsAg转基因小鼠肝细胞与HBsAg特异性CTL细胞接触后，立即发生肝细胞凋亡[5]。本文资料显示，Fas、Fasl在正常肝组织中无表达，Fas抗原在多数急、慢性乙型肝病细胞内表达，Fasl在多数肝内浸润的淋巴细胞内表达，Fas/Fasl的表达主要位于炎症界面，如小叶内，碎屑状死区及汇管区周边部，并且二者分部基本一致，说明Fas/Fasl系统在乙型病毒性肝炎、肝组织损伤机制中起重要作用。
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原来认为Fasl仅表达于CTL细胞，其它组织细胞无表达。新近研究表明，Fasl在其它免疫细胞甚至免疫细胞以外的少数组织细胞表达，并发现可在肝病的肝细胞中表达[2,5]。本研究结果显示，Fasl不仅表达于浸润的淋巴细胞，也可表达于肝细胞内。其可能的原因：①肝细胞接受病毒抗原刺激，即表达Fas抗原，同时也可以表达Fasl，肝细胞不仅是靶细胞，也可能是免疫效应细胞。②Fasl从浸润并表达Fasl的淋巴细胞膜上脱落或分泌，成为可溶性Fasl，这种可溶性分子结合至Fas抗原阳性表达的肝细胞膜上，故而显示双表达。由于Fasl的多种表达方式，肝细胞可通过直接自杀，自分泌及旁分泌等死亡途径遭受破坏[6]。许多研究表明，在同一肝组织中，可发现凋亡及坏死两种死亡类型的同时存在[7]。本试验发现，肝组织炎症坏死区Fas及Fasl均出现高表达，并且两者分布一致。推测两种不同死亡类型的同时存在，可能是由于CTL细胞通过Fas/Fasl系统介导细胞凋亡及通过穿孔素颗粒酶途径产生细胞毒效应双重作用的结果。这种细胞的相互杀伤行为可防止病毒从局部向周围扩散，是机体清除病毒的方式之一，同时也加重了肝脏损害。
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参考文献
1.Razaki M, Hino K, Murakami C et al. Fas antigen expression in livers of patients with chronic hepatitis C. before and after interferontherapy, Hepatol 1955:22(4):pt. 2;468A
2.Galle PR, Hopmann WJ, Walezak H, et al, Involvement of tne CD95(Apo-1/Fas) receptor and ligand in liver damage J Exp. Med 1995,198:1223～1230
3.Ryo K, Kamogawa Y, Ikeda I, et al Fas and Fas lgand strongly expressed in liver of fulminant Repatitis patients, Hepatol 1995,22:230
, 百拇医药
4.Kagi D, vignaux F, ledermann B, et al. Fas and perfrin pathways asmajor mechanisms of T-cell mediated cytotoxieity, Science 1994:265:528～530
5.Hahne M, Renno T, Sxhroeter M, et al Axrival B cell express functional Fan lignad Eur J Immmunol, 1996:26:721-724
6.秦波,张定凤,马英,等.乙型肝炎患者肝组织Fas/Fasl配体表达及其在肝细胞凋亡中的作用.中华肝脏病杂志,1997,5:88
7.Patel T, Gores GT. Apopatosis and hepatobiliary disease. Hepatology,1995:21:1725-17410
(1999-11-02收稿), http://www.100md.com
单位：梅存金(徐州市传染病医院 221004)；王海舰(徐州市传染病医院 221004)；郎振为(北京佑安医院 100054)
关键词：乙型肝炎；凋亡；Fas/Fasl
黑龙江医药科学000318 提要 目的：探讨Fas、Fasl在乙型肝炎肝组织中表达与肝细胞损伤的关系。方法：采用免疫组化方法活检或尸检60例急、慢性乙型肝病肝组织中Fas及Fasl的表达情况。结果：Fas、Fasl的检出率分别为76.7%及73.3%。Fas在肝细胞浆内表达，Fas见于肝内浸润的淋巴细胞中，也见于肝细胞浆内表达。Fasl阳性淋巴细胞主要分布于汇管内，与Fas抗原阳性肝细胞分布一致。免疫组化双标记染色示Fas及Fasl可在同一肝细胞内表达。结论：Fas/Fasl系统在乙型肝炎细胞损伤中起重要作用。
细胞凋亡与病毒性肝炎的发生、发展有着密切关系，Nagata在给转基因小鼠体内注射抗Fas单抗后引起广泛性肝细胞坏死，认为其可能与暴发型肝炎发病有关[1]，引起肝病学者的高度重视。我们采用免疫组化方法检测了60例急、慢性乙型肝病肝组织中Fas和Fasl的原位表达及分布，现总结如下。
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1 材料与方法
1.1 材料来源
选择1992～1995年北京佑安医院病理科收集的活检及部分尸检肝组织标本60例。血清学检查乙肝病毒标志均阳性，病理诊断按1995年北京全国传染病和寄生虫病会议修订的诊断标准。其中急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎及活动性肝硬变各20例。
1.2 试验方法
肝组织经10%甲醛固定，石蜡包埋，连续5um厚切片。二甲苯脱蜡，H2O2处理。分别做HE染色及免疫组织化学检测，按说明书操作。每例标本分别作Fas及Fasl检测，阳性标本再进行Fas/Fasl免疫组化双标记检测。选用预试验中Fas抗原阳性的慢性乙型肝炎肝组织及Fasl阳性的慢性淋巴结炎组织切片为阳性对照。血清学检测HA-E标志均阴性，免疫组化检测HBsAg、HBcAg及HCVNS3-Ag均阴性的正常肝组织为阴性对照。另用兔血清和磷酸盐缓冲液代替-抗为空白及替代对照，以检验其特异性和可靠性。兔抗Fas、兔抗Fasl多克隆抗体及免疫组织化学双染试剂盒均为美国ZymedLab公司产品，购自北京中山生物技术公司。血清学检测采用ELISA法，试剂盒购自北京肝病研究所。
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2 结果
2.1 单标记染色
Fas抗原在急性肝炎，慢性肝炎及活动性肝硬变3组肝组织中分别检出13、16及17例。Fas抗原呈细颗粒状分布于肝细胞浆内，急性乙型肝炎Fas抗原在肝小叶内弥散分布，慢性肝炎及活动性肝硬变则多聚集在碎屑样坏死区或假小叶周边肝细胞。Fasl在3组不同肝组织中分别检出11、15、18例。Fasl阳性颗粒定位于淋巴细胞及肝细胞浆内。在Fasl阳性表达的各型肝组织切片中，急性乙型肝炎组有9例表达于汇管区浸润的淋巴细胞内，1例于肝细胞内表达，1例于淋巴细胞及肝细胞内均见表达；慢性肝炎组有6例表达于淋巴细胞，4例于肝细胞内表达，5例淋巴细胞及肝细胞同时表达；活动性肝硬变组有4例表达于淋巴细胞，5例于肝细胞内表达，9例淋巴细胞与肝细胞同时表达。各型肝炎肝组织Fasl阳性细胞的分布与Fas抗原阳性肝细胞分布一致，Fasl阳性淋巴细胞多弥散分布于汇管区周围，小叶内较少见。
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急、慢性肝炎肝细胞内Fas及Fasl同时检出分别为1例和3例。活动性肝硬变同时检出8例。Fas及Fasl分别经碱性磷酸酶或辣根过氧化物显色后，可见Fas及Fasl在同一肝细胞或不同肝细胞内表达，分布与单标记染色相同。急慢性乙型肝炎及活动性肝硬变Fas/Fasl，检结果见附表。
附表 急慢性乙型肝炎及活动肝硬化变Fas/Fasl检测结果 病理分型
例数
单标记染色(%)
双标记染色(%)
Fas+Fasl
Fas
Fasl
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急性乙型肝炎
20
13(65.0)
11(55.0)
1(5.0)
慢性乙型肝炎
20
16(80.0)
15(75.0)
3(15.0)
活动性肝硬变
20
, http://www.100md.com 17(85.0)
18(80.0)
8(40.0)
合计
20
46(76.7)
44(73.3)
12(20.0)
正常肝组织Fas及Fasl检测均阴性，阳性病例切片用兔血清或磷酸盐缓冲液代替-抗后，原Fas、Fasl阳性标本均阴性。
3 讨论
在病毒性肝炎时，受染肝细胞表面表达了大量病毒抗原，并可诱导Fas抗原的表达[1]。病毒抗原、病毒抗原肽-MHCI类分子被淋巴细胞识别受体(TCR)识别，激活特异性细胞毒性淋巴细胞(CTL)并表达Fasl。通过Fas/Fasl机制介导肝细胞凋亡[2]。Ryo等研究表明，慢性肝炎的肝细胞表面Fas抗原表达强烈，并可测到大量富于Fasl的CD+8细胞[3]。Kagi等将HBsAg转基因小鼠肝细胞与HBsAg特异性CTL细胞接触后，立即发生肝细胞凋亡[5]。本文资料显示，Fas、Fasl在正常肝组织中无表达，Fas抗原在多数急、慢性乙型肝病细胞内表达，Fasl在多数肝内浸润的淋巴细胞内表达，Fas/Fasl的表达主要位于炎症界面，如小叶内，碎屑状死区及汇管区周边部，并且二者分部基本一致，说明Fas/Fasl系统在乙型病毒性肝炎、肝组织损伤机制中起重要作用。
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原来认为Fasl仅表达于CTL细胞，其它组织细胞无表达。新近研究表明，Fasl在其它免疫细胞甚至免疫细胞以外的少数组织细胞表达，并发现可在肝病的肝细胞中表达[2,5]。本研究结果显示，Fasl不仅表达于浸润的淋巴细胞，也可表达于肝细胞内。其可能的原因：①肝细胞接受病毒抗原刺激，即表达Fas抗原，同时也可以表达Fasl，肝细胞不仅是靶细胞，也可能是免疫效应细胞。②Fasl从浸润并表达Fasl的淋巴细胞膜上脱落或分泌，成为可溶性Fasl，这种可溶性分子结合至Fas抗原阳性表达的肝细胞膜上，故而显示双表达。由于Fasl的多种表达方式，肝细胞可通过直接自杀，自分泌及旁分泌等死亡途径遭受破坏[6]。许多研究表明，在同一肝组织中，可发现凋亡及坏死两种死亡类型的同时存在[7]。本试验发现，肝组织炎症坏死区Fas及Fasl均出现高表达，并且两者分布一致。推测两种不同死亡类型的同时存在，可能是由于CTL细胞通过Fas/Fasl系统介导细胞凋亡及通过穿孔素颗粒酶途径产生细胞毒效应双重作用的结果。这种细胞的相互杀伤行为可防止病毒从局部向周围扩散，是机体清除病毒的方式之一，同时也加重了肝脏损害。
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参考文献
1.Razaki M, Hino K, Murakami C et al. Fas antigen expression in livers of patients with chronic hepatitis C. before and after interferontherapy, Hepatol 1955:22(4):pt. 2;468A
2.Galle PR, Hopmann WJ, Walezak H, et al, Involvement of tne CD95(Apo-1/Fas) receptor and ligand in liver damage J Exp. Med 1995,198:1223～1230
3.Ryo K, Kamogawa Y, Ikeda I, et al Fas and Fas lgand strongly expressed in liver of fulminant Repatitis patients, Hepatol 1995,22:230
, 百拇医药
4.Kagi D, vignaux F, ledermann B, et al. Fas and perfrin pathways asmajor mechanisms of T-cell mediated cytotoxieity, Science 1994:265:528～530
5.Hahne M, Renno T, Sxhroeter M, et al Axrival B cell express functional Fan lignad Eur J Immmunol, 1996:26:721-724
6.秦波,张定凤,马英,等.乙型肝炎患者肝组织Fas/Fasl配体表达及其在肝细胞凋亡中的作用.中华肝脏病杂志,1997,5:88
7.Patel T, Gores GT. Apopatosis and hepatobiliary disease. Hepatology,1995:21:1725-17410
(1999-11-02收稿), http://www.100md.com