单克隆抗体双位点一步ELISA方法检测MN血型
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法医学杂志 2000年第3期第16卷 论著
作者：鲍蕾 张健 孙玉显 郑剑玲 孙辉
单位：鲍蕾(辽宁省基础医学研究所,辽宁沈阳 110005)；张健(辽宁省基础医学研究所,辽宁沈阳 110005)；孙玉显(辽宁省刑事科学技术研究所,辽宁沈阳 110032)；郑剑玲(辽宁省基础医学研究所,辽宁沈阳 110005)；孙辉(辽宁省刑事科学技术研究所,辽宁沈阳 110032)
关键词：单克隆抗体；ELISA；MN血型
法医学杂志000308
摘要]目的：对法医学样品中微量液体血、血痕进行MN分型。方法：利用抗M、抗N及抗血型糖蛋白A单抗，采用双位点一步ELISA方法。结果：此法可检测的最低全血量约0.065μl,血痕约10～50ng。对455份新鲜血液及200份新鲜血痕的标本均正确检出；对58例陈旧血痕的检出率为96.6%。结论：此法准确率高且简便、快速，具有很大的实用价值。
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[中图分类号]DF795.2 [文献标识码]A
[文章编号]1004-5619(2000)03-0146-02
The MN typing of whole blood and bloodstains by the method of one-step sandwich ELISA
Bao Lei,et al.
(Liaoning Basic Medical Institute, Shenyang 110005,PRC)
The samples of whole blood and bloodstain were MN-typed by the method of one-step sandwich ELISA, monoclonal antibodies include anti-M, N and glycernprotein.The lowest sample amount in this study is: for whole blood is 0.065μ l, for bloodstain about 10 to 50ng.455 cases of fresh blood and 200 cases of fresh bloodstain are correctly typed.For 58 cases of old bloodstains , the success rate is 96.6%.
, 百拇医药
Key words: monoclonal antibody; ELISA; MN typing
对法医学样品中血型的鉴定常包括ABO、MN等多种血型系统的鉴定,测定MN血型常用的方法是解离实验和吸收实验，上述实验所需血痕的量较大，效果也常不令人满意[1]。我们在研制出抗N[2]、抗M[3]单克隆抗体的基础上，建立了检测MN抗原的双位点一步ELISA方法，本文利用此法对法医微量血液、新鲜血痕及陈旧血痕样品进行MN分型。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
1.1.1 单抗制备
抗N单抗(ON1D3)、抗M单抗(4E6)、抗血型糖蛋白A单抗(2C8)由本研究室制备[2,3]。
, 百拇医药
1.1.2 酶标记抗体
将抗M单抗(4E6)、抗N单抗(ON1D3)按Ishikawa方法[4]标记辣根过氧化物酶。
1.1.3 酶标仪
Bio-Rad。
1.2 标本制备
1.2.1 新鲜血液
455份健康献血员全血(由沈阳军区总医院提供)，置冰箱冻存。
1.2.2 血痕标本
已知MN血型的新鲜血液2μl滴在纱布上，室温干燥保存，新鲜血痕保存时间为24～72h，陈旧血痕保存时间为2周～1年。
, 百拇医药
1.3 双位点一步ELISA法
用抗血型糖蛋白A单抗(2C8)包被酶标反应板，5μg/100μl/孔，4℃过夜。用2%BSA封闭，300μl/孔，4℃24h，备用。将浸泡后的待检样品与抗M、抗N酶标单抗溶液等量混合，加入经上述预处理的反应板中，25℃放置适当时间(血液样品放置30min，血痕样品放置60min)，用0.1%Tween20-PBS及PBS各洗4次，加底物OPD显色，在492nm波长测定光吸收值(OD值)，以阴性对照孔OD值的均数加3倍标准差(X+3SD)作为判定的界限值，高于此值者，判为M或N阳性。同时记录肉眼判定的结果。
2 结果
2.1 灵敏度测定
将血液及血痕浸出液对倍稀释，测定稀释液中M及N抗原。结果见图1。
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图1 双位点一步ELISA检测微量液体血MN
血型灵敏度曲线
液体血的最小检出量为0.065μl,新鲜血痕的最小检出量为10～50ng(相当于0.25μl全血制备而成的血痕)。
2.2 对新鲜血液的MN分型
对455份新鲜血液标本用双位点一步ELISA方法进行MN分型，分型结果M型104例，N型76例，MN型275例，与已知MN血型完全一致，检测结果准确率达100%。
2.3 对血痕的MN分型
结果见表1。
表1 双位点一步ELISA法对血痕的MN分型
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血痕保存时间
例数
已知MN抗原
ELISA检测结果
M
N
MN
M
N
MN
1-3天
200
39
, 百拇医药
63
98
39
63
98
2周
12
4
3
5
4
3
5
1-2月
, http://www.100md.com
17
3
7
7
3
7
7
3-5月
16
6
7
3
6
7
, http://www.100md.com
2
1年
13
3
5
5
2
5
5
检测室温保存24～72h新鲜干血痕200例，准确率达100%，检测2周～1年的陈旧血痕58例，除有1例MN型只检出N抗原，1例M型血痕未检出外，其它均正确检出，准确率达96.6%。
2.4 酶标仪与肉眼判定结果的比较
, 百拇医药
由表2可见,鲜血液与新鲜血痕用酶标仪及肉眼判定结果的符合率均为100%，判定陈旧血痕两者的符合率为94.6%。
表2 酶标仪与肉眼判定结果的比较
例数
酶标仪测定结果
肉眼判定结果
符合率
M
N
MN
M
N
MN
, 百拇医药
血液
455
104
76
275
104
76
275
100%
新鲜血痕
200
39
63
, 百拇医药 98
39
63
98
100%
陈旧血痕
56
15
22
19
13
22
18
94.6%
, 百拇医药
3 讨论
利用抗血型糖蛋白A单抗分别与抗M单抗、抗N单抗酶结合物配对，建立了快速、敏感的检测MN血型抗原的双位点一步ELISA方法，将该法用于对法医微量血液及血痕样品的MN分型，取得满意结果。
近年，许多学者报导了利用单克隆抗体ELISA方法检测A、B、H抗原的研究结果[5]，证明了ELISA方法具有操作简便、快速、重复性好、结果可客观记录，尤其是方法灵敏度大大高于法医常规方法等多项优点。但在对MN抗原分型的研究中，这方面的报导还很少见。渡边芳久曾报导了用抗M、抗N单抗Dot-ELISA方法可正确判定12例新鲜血痕MN血型结果。我们利用建立的双位点一步ELISA方法检测了200例新鲜血痕及58例室温保存2周～1年的陈旧血痕，结果准确率分别达100%及96.6%，对新鲜血痕检测的灵敏度达10～50ng(相当于0.25μl全血)。此外，在试验结果的判定中，肉眼判定与仪器判定结果有较高的符合率。以上表明本法在法医学MN血型鉴定中具有很好的实用价值，并易于推广使用。
, http://www.100md.com
参考文献：
[1]贾静涛.法医血型血清学[M].第1版.沈阳：辽宁科学技术出版社.1988.
[2]张秀梅,张健,段薇,等.抗人N单克隆抗体的制备及其特性研究[J].中国法医学杂志,1987,2(2):69-71.
[3]张建,鲍蕾,段薇,等.抗M血型单克隆抗体特性的研究[J].中国生物制品学杂志,1996,9(2):58-61.
[4] Ishikawa E,Imagawa M,Hashida S,et al. Enzyme- labelling of antibodies and their fragments for enzyme immunoassay and immunohistochemical staining[J].J Immunoassay,1983,4:209- 237.
[5] Lincoln PJ,Watts PH,Zhang Z,et al. The Application of monoclonal antibodies in forensic practice[J].Jpn J Legal Med,1992,46(6):419- 421.
(收稿日期：1999-06-09修回日期：1999-10-29), http://www.100md.com
单位：鲍蕾(辽宁省基础医学研究所,辽宁沈阳 110005)；张健(辽宁省基础医学研究所,辽宁沈阳 110005)；孙玉显(辽宁省刑事科学技术研究所,辽宁沈阳 110032)；郑剑玲(辽宁省基础医学研究所,辽宁沈阳 110005)；孙辉(辽宁省刑事科学技术研究所,辽宁沈阳 110032)
关键词：单克隆抗体；ELISA；MN血型
法医学杂志000308
摘要]目的：对法医学样品中微量液体血、血痕进行MN分型。方法：利用抗M、抗N及抗血型糖蛋白A单抗，采用双位点一步ELISA方法。结果：此法可检测的最低全血量约0.065μl,血痕约10～50ng。对455份新鲜血液及200份新鲜血痕的标本均正确检出；对58例陈旧血痕的检出率为96.6%。结论：此法准确率高且简便、快速，具有很大的实用价值。
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[中图分类号]DF795.2 [文献标识码]A
[文章编号]1004-5619(2000)03-0146-02
The MN typing of whole blood and bloodstains by the method of one-step sandwich ELISA
Bao Lei,et al.
(Liaoning Basic Medical Institute, Shenyang 110005,PRC)
The samples of whole blood and bloodstain were MN-typed by the method of one-step sandwich ELISA, monoclonal antibodies include anti-M, N and glycernprotein.The lowest sample amount in this study is: for whole blood is 0.065μ l, for bloodstain about 10 to 50ng.455 cases of fresh blood and 200 cases of fresh bloodstain are correctly typed.For 58 cases of old bloodstains , the success rate is 96.6%.
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Key words: monoclonal antibody; ELISA; MN typing
对法医学样品中血型的鉴定常包括ABO、MN等多种血型系统的鉴定,测定MN血型常用的方法是解离实验和吸收实验，上述实验所需血痕的量较大，效果也常不令人满意[1]。我们在研制出抗N[2]、抗M[3]单克隆抗体的基础上，建立了检测MN抗原的双位点一步ELISA方法，本文利用此法对法医微量血液、新鲜血痕及陈旧血痕样品进行MN分型。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
1.1.1 单抗制备
抗N单抗(ON1D3)、抗M单抗(4E6)、抗血型糖蛋白A单抗(2C8)由本研究室制备[2,3]。
, 百拇医药
1.1.2 酶标记抗体
将抗M单抗(4E6)、抗N单抗(ON1D3)按Ishikawa方法[4]标记辣根过氧化物酶。
1.1.3 酶标仪
Bio-Rad。
1.2 标本制备
1.2.1 新鲜血液
455份健康献血员全血(由沈阳军区总医院提供)，置冰箱冻存。
1.2.2 血痕标本
已知MN血型的新鲜血液2μl滴在纱布上，室温干燥保存，新鲜血痕保存时间为24～72h，陈旧血痕保存时间为2周～1年。
, 百拇医药
1.3 双位点一步ELISA法
用抗血型糖蛋白A单抗(2C8)包被酶标反应板，5μg/100μl/孔，4℃过夜。用2%BSA封闭，300μl/孔，4℃24h，备用。将浸泡后的待检样品与抗M、抗N酶标单抗溶液等量混合，加入经上述预处理的反应板中，25℃放置适当时间(血液样品放置30min，血痕样品放置60min)，用0.1%Tween20-PBS及PBS各洗4次，加底物OPD显色，在492nm波长测定光吸收值(OD值)，以阴性对照孔OD值的均数加3倍标准差(X+3SD)作为判定的界限值，高于此值者，判为M或N阳性。同时记录肉眼判定的结果。
2 结果
2.1 灵敏度测定
将血液及血痕浸出液对倍稀释，测定稀释液中M及N抗原。结果见图1。
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图1 双位点一步ELISA检测微量液体血MN
血型灵敏度曲线
液体血的最小检出量为0.065μl,新鲜血痕的最小检出量为10～50ng(相当于0.25μl全血制备而成的血痕)。
2.2 对新鲜血液的MN分型
对455份新鲜血液标本用双位点一步ELISA方法进行MN分型，分型结果M型104例，N型76例，MN型275例，与已知MN血型完全一致，检测结果准确率达100%。
2.3 对血痕的MN分型
结果见表1。
表1 双位点一步ELISA法对血痕的MN分型
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血痕保存时间
例数
已知MN抗原
ELISA检测结果
M
N
MN
M
N
MN
1-3天
200
39
, 百拇医药
63
98
39
63
98
2周
12
4
3
5
4
3
5
1-2月
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17
3
7
7
3
7
7
3-5月
16
6
7
3
6
7
, http://www.100md.com
2
1年
13
3
5
5
2
5
5
检测室温保存24～72h新鲜干血痕200例，准确率达100%，检测2周～1年的陈旧血痕58例，除有1例MN型只检出N抗原，1例M型血痕未检出外，其它均正确检出，准确率达96.6%。
2.4 酶标仪与肉眼判定结果的比较
, 百拇医药
由表2可见,鲜血液与新鲜血痕用酶标仪及肉眼判定结果的符合率均为100%，判定陈旧血痕两者的符合率为94.6%。
表2 酶标仪与肉眼判定结果的比较
例数
酶标仪测定结果
肉眼判定结果
符合率
M
N
MN
M
N
MN
, 百拇医药
血液
455
104
76
275
104
76
275
100%
新鲜血痕
200
39
63
, 百拇医药 98
39
63
98
100%
陈旧血痕
56
15
22
19
13
22
18
94.6%
, 百拇医药
3 讨论
利用抗血型糖蛋白A单抗分别与抗M单抗、抗N单抗酶结合物配对，建立了快速、敏感的检测MN血型抗原的双位点一步ELISA方法，将该法用于对法医微量血液及血痕样品的MN分型，取得满意结果。
近年，许多学者报导了利用单克隆抗体ELISA方法检测A、B、H抗原的研究结果[5]，证明了ELISA方法具有操作简便、快速、重复性好、结果可客观记录，尤其是方法灵敏度大大高于法医常规方法等多项优点。但在对MN抗原分型的研究中，这方面的报导还很少见。渡边芳久曾报导了用抗M、抗N单抗Dot-ELISA方法可正确判定12例新鲜血痕MN血型结果。我们利用建立的双位点一步ELISA方法检测了200例新鲜血痕及58例室温保存2周～1年的陈旧血痕，结果准确率分别达100%及96.6%，对新鲜血痕检测的灵敏度达10～50ng(相当于0.25μl全血)。此外，在试验结果的判定中，肉眼判定与仪器判定结果有较高的符合率。以上表明本法在法医学MN血型鉴定中具有很好的实用价值，并易于推广使用。
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参考文献：
[1]贾静涛.法医血型血清学[M].第1版.沈阳：辽宁科学技术出版社.1988.
[2]张秀梅,张健,段薇,等.抗人N单克隆抗体的制备及其特性研究[J].中国法医学杂志,1987,2(2):69-71.
[3]张建,鲍蕾,段薇,等.抗M血型单克隆抗体特性的研究[J].中国生物制品学杂志,1996,9(2):58-61.
[4] Ishikawa E,Imagawa M,Hashida S,et al. Enzyme- labelling of antibodies and their fragments for enzyme immunoassay and immunohistochemical staining[J].J Immunoassay,1983,4:209- 237.
[5] Lincoln PJ,Watts PH,Zhang Z,et al. The Application of monoclonal antibodies in forensic practice[J].Jpn J Legal Med,1992,46(6):419- 421.
(收稿日期：1999-06-09修回日期：1999-10-29), http://www.100md.com