HCG滴金免疫测定法试剂的研制及应用
作者：边倩茹 王玉珠 张玉梅 王以红 卢秀云 张晨 周蕾 张燕
单位：郑州博赛生物技术研究所，河南 郑州 450003
关键词：人绒毛膜促性腺激素；单克隆抗体；滴金免疫测定法
标记免疫分析与临床000312 摘要： 应用自制的两种抗人绒毛膜促性腺激素(HCG)单克隆抗体，分别包被硝酸纤维膜及制备胶体金结合物，建立了检测HCG的滴金免疫测定法。结果表明，本法简便，快速，灵敏度高(最小抗原检测量为50mIU/L),特异性好，与高浓度的LH、FSH、TSH均无交叉反应，临床检验217例样品，与ELISA法对比测定的符合率为100%。
中图分类号： R711 文献标识码： A 文章编号： 1006-1703(2000)03-153-03
Reagent Preparation by Dot Immunogold Filtration Assay
, 百拇医药
for HCG Determination and Its Clinical Application
BIAN Qian-ru,WANG Yu-zhu, ZHANG Yu-mei, et al.
(Zhengzhou Biocell Institute,Zhengzhou 450003,China)
Abstract: A dot immunogold filtration assay for the determination of HCG in urine has been established by using two matched monoclonal antibodies (MCAb)prepared in our laboratory. One MCAb was inoculated on nitrocellulose membrane, and another MCAb was conjugated with colloidal gold.The result showed that it is a simple,rapid and highly specific method.The sensitivity of this method could reach 50mIU/L and it had no cross reaction with LH,FSH,TSH in high concentration.The accuracy was 100% in detecting 217 clinical cases contrast to ELISA assay.
, 百拇医药
Key words: Human chorionic gonadotropins; Monoclonal antibody; Dot immunogold filtration assay
本试剂盒是采用胶体金标记技术与快速斑点免疫法相结合，应用双抗体夹心法，来检测样品中的HCG含量。基本原理是利用微孔滤膜的垂直渗透浓缩，使被检样本中的抗原与N.C膜包被抗体快速形成Ag-Ab复合物，然后加入胶体金标记的抗体，形成双抗体夹心法。由于胶体金肉眼可见，故阳性反应会在膜上呈现红色斑点，阴性反应则不形成红色斑点。
材料和方法
1 材料
1.1 抗HCG-McAb 本所细胞室提供。
1.2 HCG参照品 中国药品生物制品检定所提供。
, http://www.100md.com
1.3 LH， FSH， TSH冻干参照品 中国药品生物制品检定所提供。
1.4 氯金酸(HAuCl4) AR，上海试剂一厂，其它所用配制试剂均为A级。
1.5 N.C 膜 美国Millipore公司。
2 方法
2.1 单克隆抗体制备 参考文献[1]用辛酸法，分别从两种抗HCG腹水中纯化相应位点配对抗体，紫外检测法测蛋白含量。
2.2 玻璃用品的硅化 将玻璃用品清洗干净，用1%甲基硅油浸洗一次，置200℃烘箱2小时，清洗后使用。
2.3 胶体金溶液的制备 按参考文献[2]用柠檬酸还原法制备胶体金。取一定量氯金酸溶液加入100mL三蒸水中，煮沸，剧烈搅拌下加入定量1%柠檬酸三钠，加热至溶液呈现透亮紫红色为止，冷却后置4℃保存。
, 百拇医药
2.4 胶体金标记物的制备 取1mL胶体金溶液，用0.1mol/L K2CO3磁力搅拌下调至合适pH值，加入标记抗体，10分钟后，加入BSA终止反应。14000r/min 离心60分钟，弃去上清液，将沉淀溶解在0.01mol/L PBS溶液中。无菌分装，4mL/瓶，4℃保存。
2.5 N.C 膜的包被 硝酸纤维素膜用去离子水浸泡后，取出晾干，裁成1cm×1cm的方格，用微量加样器将包被抗体点于方格内，室温干燥后，用0.5%BSA封闭，然后用PBS洗涤两次，烘干备用。
2.6 反应板组装 将封闭好的膜点样面朝上装入自制的反应板内(反应板中央有一小孔，下垫有吸水材料)，按上滤器。
3 检测方法
3.1 一步法 在反应板中央孔上滴加5滴新鲜尿样后即加金标物3滴，待样品渗入后，取下滤器，再加入1-2滴洗液，观察结果。
, 百拇医药
3.2 两步法 将5滴新鲜尿样滴入反应板内，待尿样完全渗入后，取下滤器，加入3滴金标物，待渗入，用洗液冲洗1-2遍，观察结果。
结 果
1 结果表示
如在孔中央膜上出现红色斑点，则表明结果为阳性，否则为阴性。
2 灵敏度
用HCG参照品，HCG含量依次为0，25，50，100，400，3000，10000mIU/mL,做滴金免疫法测定，在0-25mIU/mL内，结果为阴性，膜中央无斑点，50-400mIU/mL内，为弱阳，斑点呈浅红色，3000-10000mIU/mL为强阳，斑点呈深红色。
3 特异性
取LH(120mIU/mL)，FSH(100mIU/mL)， TSH(525mIU/mL)参照品检测，无斑点出现。
, http://www.100md.com
4 稳定性
将金标结合物和反应板放置在37℃烘箱一个月，各项检测指标均无明显变化。
5 准确率
临床标本检测217例样品，与ELISA法对照试验，准确率为100%。
讨 论
胶体金是一种带负电荷的疏水胶体溶液，主要靠静电排斥作用来维持其体系的稳定，胶体金的稳定性主要取决于胶体粒子的大小，颗粒越小越稳定，越不容易受电解质的干扰而凝聚，因而胶体金的制备和标记是获得良好结果的关键。在胶体金制备中，保持其它条件不变，仅改变加入的柠檬酸三钠的含量就可获得不同颜色，不同大小的胶金颗粒，较高浓度下金颗粒变小，低浓度则金颗粒变大。胶体金颗粒的大小必须与选择包被膜孔径相适应，倘若制备的金颗粒过大，则金溶液容易凝聚，金微粒不易通过N.C膜，导致本底颜色过深。若金颗粒过小，则金微粒又易渗透过小滤膜，导致斑点显色过浅，从而影响反应的灵敏度。另外标记所用抗体必须尽可能纯化，以除去其中的有效离子成分，以免电解质浓度过高而破坏胶体金颗粒表面的扩散层，致使胶体金失去稳定而很快凝集。除此之外，胶体金标记实质上就是抗体蛋白分子的正电荷与带负电荷的金颗粒之间通过静电相互吸引，达到范德华范围内而形成牢固结合，所以胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或略偏碱的pH值条件下，二者易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点，则胶体金就会失去吸附力产生聚集，破坏胶体金平衡。但pH值过高，也会导致蛋白质变性失活，减少蛋白与胶体金的有效吸附，从而降低反应的灵敏度。
, 百拇医药
在本试剂盒的检测过程中，应用一步法要比两步法斑点显色深，灵敏度高，可能是因为一步法中抗原抗体反应比较充分，结合时间长。
随着现代医学的发展，人们越来越多地发现HCG的含量与许多肿瘤性疾病有着密切联系。当人体出现某些病理情况时，尿中也会出现异常HCG,另外一些非正常妊娠，如宫外孕，葡萄胎等也会导致尿中HCG异常，因而本试剂盒不仅可用作早孕诊断，还可作为一种肿瘤性疾病的辅助检测方法。
金免疫渗滤测定应用单份试剂，不便进行质量控制，难于保证同一性，因此金免疫法仅用于定性实验。
参考文献：
[1] 杨景山.医学细胞学与细胞生物技术[M].北京：中国协和医科大学、北京医科大学联合出版社，1992.194.
[2] 沈关心，周汝麟.现代免疫学实验技术[M].武汉： 湖北科学技术出版社，1998.131.
[3] 赵长春，王庭桂，杨春生.临床免疫检验学[M].天津：天津科学技术出版社，1990.19.
[4] 李晨旭，尹晓光，孙长杰.免疫层析法用于HCG快速检测的研究[J].白求恩医科大学学报，1998，2(24)：2.
[5] 赵中夫，郭进军，等.滴金免疫法快速检测肾综合症出血热血清特异性IgM的研究[J].中华医学检验杂志，1998,(21)：2.
收稿日期： 1999-12-06, 百拇医药
单位：郑州博赛生物技术研究所，河南 郑州 450003
关键词：人绒毛膜促性腺激素；单克隆抗体；滴金免疫测定法
标记免疫分析与临床000312 摘要： 应用自制的两种抗人绒毛膜促性腺激素(HCG)单克隆抗体，分别包被硝酸纤维膜及制备胶体金结合物，建立了检测HCG的滴金免疫测定法。结果表明，本法简便，快速，灵敏度高(最小抗原检测量为50mIU/L),特异性好，与高浓度的LH、FSH、TSH均无交叉反应，临床检验217例样品，与ELISA法对比测定的符合率为100%。
中图分类号： R711 文献标识码： A 文章编号： 1006-1703(2000)03-153-03
Reagent Preparation by Dot Immunogold Filtration Assay
, 百拇医药
for HCG Determination and Its Clinical Application
BIAN Qian-ru,WANG Yu-zhu, ZHANG Yu-mei, et al.
(Zhengzhou Biocell Institute,Zhengzhou 450003,China)
Abstract: A dot immunogold filtration assay for the determination of HCG in urine has been established by using two matched monoclonal antibodies (MCAb)prepared in our laboratory. One MCAb was inoculated on nitrocellulose membrane, and another MCAb was conjugated with colloidal gold.The result showed that it is a simple,rapid and highly specific method.The sensitivity of this method could reach 50mIU/L and it had no cross reaction with LH,FSH,TSH in high concentration.The accuracy was 100% in detecting 217 clinical cases contrast to ELISA assay.
, 百拇医药
Key words: Human chorionic gonadotropins; Monoclonal antibody; Dot immunogold filtration assay
本试剂盒是采用胶体金标记技术与快速斑点免疫法相结合，应用双抗体夹心法，来检测样品中的HCG含量。基本原理是利用微孔滤膜的垂直渗透浓缩，使被检样本中的抗原与N.C膜包被抗体快速形成Ag-Ab复合物，然后加入胶体金标记的抗体，形成双抗体夹心法。由于胶体金肉眼可见，故阳性反应会在膜上呈现红色斑点，阴性反应则不形成红色斑点。
材料和方法
1 材料
1.1 抗HCG-McAb 本所细胞室提供。
1.2 HCG参照品 中国药品生物制品检定所提供。
, http://www.100md.com
1.3 LH， FSH， TSH冻干参照品 中国药品生物制品检定所提供。
1.4 氯金酸(HAuCl4) AR，上海试剂一厂，其它所用配制试剂均为A级。
1.5 N.C 膜 美国Millipore公司。
2 方法
2.1 单克隆抗体制备 参考文献[1]用辛酸法，分别从两种抗HCG腹水中纯化相应位点配对抗体，紫外检测法测蛋白含量。
2.2 玻璃用品的硅化 将玻璃用品清洗干净，用1%甲基硅油浸洗一次，置200℃烘箱2小时，清洗后使用。
2.3 胶体金溶液的制备 按参考文献[2]用柠檬酸还原法制备胶体金。取一定量氯金酸溶液加入100mL三蒸水中，煮沸，剧烈搅拌下加入定量1%柠檬酸三钠，加热至溶液呈现透亮紫红色为止，冷却后置4℃保存。
, 百拇医药
2.4 胶体金标记物的制备 取1mL胶体金溶液，用0.1mol/L K2CO3磁力搅拌下调至合适pH值，加入标记抗体，10分钟后，加入BSA终止反应。14000r/min 离心60分钟，弃去上清液，将沉淀溶解在0.01mol/L PBS溶液中。无菌分装，4mL/瓶，4℃保存。
2.5 N.C 膜的包被 硝酸纤维素膜用去离子水浸泡后，取出晾干，裁成1cm×1cm的方格，用微量加样器将包被抗体点于方格内，室温干燥后，用0.5%BSA封闭，然后用PBS洗涤两次，烘干备用。
2.6 反应板组装 将封闭好的膜点样面朝上装入自制的反应板内(反应板中央有一小孔，下垫有吸水材料)，按上滤器。
3 检测方法
3.1 一步法 在反应板中央孔上滴加5滴新鲜尿样后即加金标物3滴，待样品渗入后，取下滤器，再加入1-2滴洗液，观察结果。
, 百拇医药
3.2 两步法 将5滴新鲜尿样滴入反应板内，待尿样完全渗入后，取下滤器，加入3滴金标物，待渗入，用洗液冲洗1-2遍，观察结果。
结 果
1 结果表示
如在孔中央膜上出现红色斑点，则表明结果为阳性，否则为阴性。
2 灵敏度
用HCG参照品，HCG含量依次为0，25，50，100，400，3000，10000mIU/mL,做滴金免疫法测定，在0-25mIU/mL内，结果为阴性，膜中央无斑点，50-400mIU/mL内，为弱阳，斑点呈浅红色，3000-10000mIU/mL为强阳，斑点呈深红色。
3 特异性
取LH(120mIU/mL)，FSH(100mIU/mL)， TSH(525mIU/mL)参照品检测，无斑点出现。
, http://www.100md.com
4 稳定性
将金标结合物和反应板放置在37℃烘箱一个月，各项检测指标均无明显变化。
5 准确率
临床标本检测217例样品，与ELISA法对照试验，准确率为100%。
讨 论
胶体金是一种带负电荷的疏水胶体溶液，主要靠静电排斥作用来维持其体系的稳定，胶体金的稳定性主要取决于胶体粒子的大小，颗粒越小越稳定，越不容易受电解质的干扰而凝聚，因而胶体金的制备和标记是获得良好结果的关键。在胶体金制备中，保持其它条件不变，仅改变加入的柠檬酸三钠的含量就可获得不同颜色，不同大小的胶金颗粒，较高浓度下金颗粒变小，低浓度则金颗粒变大。胶体金颗粒的大小必须与选择包被膜孔径相适应，倘若制备的金颗粒过大，则金溶液容易凝聚，金微粒不易通过N.C膜，导致本底颜色过深。若金颗粒过小，则金微粒又易渗透过小滤膜，导致斑点显色过浅，从而影响反应的灵敏度。另外标记所用抗体必须尽可能纯化，以除去其中的有效离子成分，以免电解质浓度过高而破坏胶体金颗粒表面的扩散层，致使胶体金失去稳定而很快凝集。除此之外，胶体金标记实质上就是抗体蛋白分子的正电荷与带负电荷的金颗粒之间通过静电相互吸引，达到范德华范围内而形成牢固结合，所以胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或略偏碱的pH值条件下，二者易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点，则胶体金就会失去吸附力产生聚集，破坏胶体金平衡。但pH值过高，也会导致蛋白质变性失活，减少蛋白与胶体金的有效吸附，从而降低反应的灵敏度。
, 百拇医药
在本试剂盒的检测过程中，应用一步法要比两步法斑点显色深，灵敏度高，可能是因为一步法中抗原抗体反应比较充分，结合时间长。
随着现代医学的发展，人们越来越多地发现HCG的含量与许多肿瘤性疾病有着密切联系。当人体出现某些病理情况时，尿中也会出现异常HCG,另外一些非正常妊娠，如宫外孕，葡萄胎等也会导致尿中HCG异常，因而本试剂盒不仅可用作早孕诊断，还可作为一种肿瘤性疾病的辅助检测方法。
金免疫渗滤测定应用单份试剂，不便进行质量控制，难于保证同一性，因此金免疫法仅用于定性实验。
参考文献：
[1] 杨景山.医学细胞学与细胞生物技术[M].北京：中国协和医科大学、北京医科大学联合出版社，1992.194.
[2] 沈关心，周汝麟.现代免疫学实验技术[M].武汉： 湖北科学技术出版社，1998.131.
[3] 赵长春，王庭桂，杨春生.临床免疫检验学[M].天津：天津科学技术出版社，1990.19.
[4] 李晨旭，尹晓光，孙长杰.免疫层析法用于HCG快速检测的研究[J].白求恩医科大学学报，1998，2(24)：2.
[5] 赵中夫，郭进军，等.滴金免疫法快速检测肾综合症出血热血清特异性IgM的研究[J].中华医学检验杂志，1998,(21)：2.
收稿日期： 1999-12-06, 百拇医药