一种竞争性RT-PCR测定HCV RNA方法的建立及其应用
作者：杨才生 卢桥生 李东良 温云海 张国安
单位：杨才生(解放军476医院，福建 福州 350002)；卢桥生(解放军476医院，福建 福州 350002)；李东良(解放军476医院，福建 福州 350002)；温云海(解放军476医院，福建 福州 350002)；张国安(解放军476医院，福建 福州 350002)；卢桥生(第一军医大学南方医院，广东 广州 510515)
关键词：丙型肝炎病毒；竞争性逆转录-聚合酶链式反应；定量试验
现代诊断与治疗000311
摘要：目的 建立检测丙型肝炎病人血清HCVRNA水平的竞争性逆转录-聚合酶链式反应定量方法。方法 采用含HCV5非编码区(5NCR)缺失突变的重组质粒5T1d，将其目的基因亚克隆到体外转录载体pCDNAⅠ多克隆位点上，获得转录重组体5T1d。将其线性化后用SP6RNA聚合酶体外转录竞争性缺失突变模板RNA，该模板定量后与血清HCVRNA一起作逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)，建立检测血清HCVRNA水平的竞争性定量方法。结果 检测15例丙肝病人20份血清，滴度为6.6×102～6.6×106copies/ml。结论 各类丙型肝炎患者血清病毒滴度均较高，经干扰素治疗后病毒水平下降1～5个Log，年龄小于20岁者干扰素治疗效果较好。
, http://www.100md.com
分类号：R446.1 文献标识码：A
文章编号：1001-8174(2000)03-0155-02
Development and Application of a Quantitative Assay by Competitive RT-PCR to Measure Serum HCV RNA
YANG Cai-sheng，LI Dong-liang,WEN Yun-hai,ZHANG Guo-an
(The 476th Hospital of PLA,Fuzhou 350002,China)
LU Qiao-sheng
(The South Hospital of The First Military Medical University,Guangzhou 510516,China)
, 百拇医药
Abstract:Objective To establish quantitative assay by competitive RT-PCR measuring serum HCV RNA from patients with HCV infection.Method An in vitro transcription recombinant plasmid 5T1d was obtained after subcloning the target gene of clone 5T1d,which contained mutant HCV 5 non-coding region cDNA,into a transcriptive vector pCDNA Ⅰ.After linearization of 5T1d,recombinant RNA was synthesized using SP6 RNA polymerase.A competitive RT-PCR assay was established by co-amplification HCV wild type genome extracted from serum and recombinant RNA.Results The HCV RNA titers of 20 sera from 15 cases with hepatitis C,including five patients treated with alpha-interferon(IFN-α),were detected using this method.It was found that serum HCV RNA concerntrations ranged from 6.6×102 to 6.6×106 copies/ml.Conclusions There were high titers of HCV RNA in all kinds of patients with HCV infection.In the five patients treated with IFN-α,the serum concentrations decreased 1～5Log.The effect of IFN-α is better in patients younger than 20 years old.
, 百拇医药
Key Words:Hepatitis C virus;Competitive RT-PCR;Quantatitive assay
丙型肝炎病毒(HCV)是肠道外传播非甲非乙型肝炎的重要病原，感染后很少自然缓解，病情较轻，进展缓慢，但预后严重，必须抗病毒治疗。检测血清HCV水平是丙型肝炎(HC)基础研究和考核疗效的重要手段。而其病毒血症水平极低，定量检测是目前HCV研究的困难之一。我们采用Kumar等[1]构建的HCV5’非编码区(5’NCR)缺失突变克隆，建立检测血清HCV的竞争性逆转录PCR(CRT-PCR)方法，初步观察丙肝病人自然状态和抗病毒治疗后的血清HCVRNA滴度变化。
1 材料与方法
1.1 研究对象 15例HC患者，男9例，女6例，年龄16～71岁，根据1995年第五次全国传染病寄生虫会议修订的临床诊断标准，急性HC5例，慢性9例，亚急性重型1例。有输血史10例。全部病人经EIA或PCR试验已排除甲型和乙型肝炎病毒感染。血清标本于-20℃库存。
, 百拇医药
1.2 主要试剂 TOP10F菌株、转录载体pCDNA Ⅰ(Invitrogen公司)，含HCV5’NCRcDNA的缺失突变克隆5T1d(英国St Mary’s Hospital Medical School的Umesh Kumar博士惠赠)，SP6RNA聚合酶、EcoRⅠ、BamH Ⅰ、T4DNA连接酶、无RNase污染的胰DNase Ⅰ、rNTP、地高辛寡核苷酸加尾标记及检测试剂盒(BM公司)；TaqDNA聚合酶(上海复生生物工程研究所)；dNTP、AMV逆转录酶(Promega公司)；RNasin(华美生物工程公司)；引物由中国科学院上海细胞所合成，序列如下：外引物1985’CGG TTG GTG TTA CGT TTG3’(反义)，1975’ATA GAT CAC TCC CCT GTG3’(正义)；内引物0385’GAT GCA CGG TCT ACG AGA CC3’(反义)，2475’CTT CAC GCA GAA AGC GTC3’(正义)。
1.3 5T1d目的基因的亚克隆 Kumar等[1]设计的重组质粒5T1d，目的基因为人工缺失突变的5NCRcDNA(173bp),将该目的基因亚克隆到转录截体pCDNAⅠ的BamHⅠ和EcoRⅠ位点上，所获新重组体用5T1d’表示。用EcoRⅠ和BamHⅠ消化5T1d和体外转录载体pCDNAⅠ，得到目的基因及线状pCDNAⅠ在20μl体积中进行连接反应，内含T4DNA连接酶1单位，16℃过夜连接，反应液转化TOP10F’受体菌，涂布LB平皿培养基，37℃过夜培养，取白色菌落增殖后碱裂解法小规模提取质粒，斑点杂交法筛选阳性克隆5T1d’。
, 百拇医药
1.4 竞争性RNA模板的体外转录 (1)模板制备：用BamHⅠ酶切使5T1d’线性化，在SP6RNA聚合酶作用下合成缺失突变的正链RNA分子。取5T1d’100μl，BamHⅠ5μl，10×缓冲液10μl，37℃90分钟，透析袋电泳洗脱法回收转录模板线状5T1d’。(2)转录反应：在0.5ml离心管中依次加入5×转录缓冲液20μl，100mmol/LDTT(二硫苏糖醇)10μl，RNasin3μl，5mmol/LrNTP10μl，线状5T1d’10μl，SP6RNA聚合酶2μl，无核酸酶H2O补足至100μl，37℃2小时。加入无RNase的DNaseⅠ3μl,37℃20分钟，以去除模板DNA，酚氯仿抽提，无水乙醇沉淀，10μl无核酸酶H2O重悬RNA。RNA定量参照文献[1]，获得每μl分别含105、104、103、102、101个分子的系列浓度。
1.5 竞争性RT-PCR检测血清HCVRNA滴度 (1)血清HCVRNA的抽提：SDS-蛋白酶K消化法。简言之，血清50μl，2×RNA抽提缓冲液100μl，蛋白酶K8μl(10mg/ml),无核酸酶H2O补足至200μl，42℃水浴消化45分钟，酚氯仿抽提，无水乙醇沉淀，10μl无核酸酶H2O重悬。(2)cDNA合成：设置5个反应体系，每个反应管分别加入105、104、103、102、101个竞争性模板RNA，血清RNA1μl，引物198，AMV逆转录酶10单位，总体积20μl，42℃水浴90分钟，94℃5分钟灭活逆转录酶，cDNA立即作PCR扩增。(3)巢式PCR：取cDNA各5μl，引物198、197，TaqDNA聚合酶，PCR缓冲液，dNTP进行第一轮PCR；取第一轮PCR产物1μl，引物038、247，代替第一轮引物进行第二轮PCR。两轮PCR体积均50μl，条件均为94℃60秒，56℃60秒，72℃60秒，35次循环。(4)PCR产物观察和血清HCVRNA滴度的计算：取10μl第二轮PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外光观察。扩增的野株模板产物应为279bp，竞争模板93bp，找到两者荧光亮度最接近的泳道，通过该反应管中所含的竞争性RNA拷贝数，计算血清HCVRNA的滴度。由于野株模板的分子量是竞争性模板的3倍，其RT-PCR效率是竞争模板的1/3，当两种PCR产物的荧光强度相当时，野株模板的分子数是竞争性模板拷贝数的1/3，。其计算公式是：HCVRNA滴度(拷贝/ml)=200/3×10n(10n分别为105、104、103、102、101)。
, 百拇医药
2 结果
2.1 HCV野株模板和突变模板电泳结果 见附图。
附图 HCV野株模板和突变模板电泳结果。
泳道1、8小分子量Marker,泳道2～6分别是待测野株模板RNA和105、104、103、102、101个突变模板RNA的RT-PCR产物，可见泳道6两条带荧光强度大致相等，泳道7从第一轮PCR开始设置的空白对照
2.2 HC病人HCVRNA滴度 见表1、2。
表1 各型丙型肝炎血清HCVRNA定量结果[n(%)]
, http://www.100md.com
n
HCVRNA(拷贝/ml)
6.6×102
6.6×103～6.6×104
6.6×105
6.6×106
急性
5
2(13.3)
3(20.0)
慢性
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9
1(6.7)
5(33.4)
1(6.7)
2(13.3)
亚急性重型
1
1(6.7)
合计
15
3(20.0)
8(53.3)
1(6.7)
, 百拇医药
3(20.0)
表2 慢性丙肝干扰素治疗前后HCVRNA滴度变化 病人
年龄/性别
疗程
(月)
HCVRNA(拷贝/ml)
治疗前
治疗后
下降幅度(Log)
1
36/F
3
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6.6×104
6.6×102
2
2
45/M
6
6.6×106
6.6×104
2
3
20/F
4
, 百拇医药
6.6×106
6.6×102
4
4
16/M
6
6.6×105
检不出
5
5
29/F
4
, 百拇医药 6.6×104
6.6×103
1
3 讨论
HCV复制水平低，患者血清中病毒非常少，低于分子杂交检测的敏感性，逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)是一种定性试验，表现为“全”或“无”状态，不能反映病毒血症水平，建立HCV定量方法是国内外研究的热点。我们利用Kumar等[1]构建的HCV5NCR缺失突变克隆5T1d，初步建立了竞争性RT-PCR方法。该法将已知量的竞争性RNA与血清RNA一起作逆转录-PCR，两者以相同的机率竞争引物、Taq酶、dNTP等合成各自的产物，能较客观地反映样品病毒水平。用这种方法检测了15例未抗病毒治疗的HC病人血清HCVRNA含量(表2)，6.6×102copies/ml占20.0%，6.6×103～6.6×104copies/ml占53.3%，6.6×105～6.6×106copies/ml占26.7%，与其它文献报道大致相同[2]。说明无论急性和慢性HC，病毒滴度均较高。
, 百拇医药
慢性HC病情较轻、进展较慢，很少自然恢复，抗病毒治疗是必需的。目前慢性HCV感染的主要治疗手段是α-干扰素(IFN-α)，但只是抑制HCV复制从而使炎症缓解，较少达到彻底清除病毒的目的。尽管如此，IFN治疗对大部分病例可延迟肝病进展过程。本研究检测了5例慢性HC患者IFN治疗前后的HCVRNA滴度。5例病人经IFN-α治疗后病毒滴度下降了1～5个Log。其中1例16岁男性患者治疗前HCVRNA水平6.6×105copies/ml，完成6个月疗程后病毒量低于检测水平；另1例20岁女性病人治疗前HCVRNA6.6×106copies/ml，接受4个月抗病毒治疗后，病毒滴度下降幅度较大(4个Log)。另3例病人年龄为29～45岁，治疗效果相对较差。提示年龄小者IFN治疗效果较好，与文献报道基本一致[3]。慢性HC病人经抗病毒治疗后，ALT长期稳定正常仅10%～25%，病毒清除和生化指标改善常不一致，临床上常见ALT恢复正常，病毒却没有清除，大部分病例迟早要复发，利用竞争性RT-PCR技术检测血清HCV的病毒量，是评价疗效的较理想指标，监测病程中病毒水平的动态变化，或疗程结束后进行随访，有助于决定是否延长疗程，复发前捕捉治疗机会。许多研究表明治疗前HCVRNA水平是IFN应答的重要参数，因此定量检测HCVRNA技术是一项十分有用的临床工具。
, 百拇医药
(龙宝光教授 审)
作者简介：杨才生(1967-)，男，福建省上杭县人，主治医师，医学硕士，目前主要从事胸腺激素基础与临床工作。
参考文献：
[1]Kumar U,Thomas HC,Monjardino J.Serum HCV RNA levels in chronic HCV hepatitis measured by quantitative PCR assay,correlation with serum AST[J].J Virol Meth,1994,47(1):95-102.
[2]苏秀芬，牛俊奇，胡玉琳，等.竞争性逆转录聚合酶链式反应定量检测HCVRNA[J].中华传染病杂志，1997，15(1)：32-34.
[3]Ampurdanes S,Olmedo E,Maluenda MD,et al.Permanent response to alpha-interferon therapy in chronic hepatitis C is preceded by rapid clearnce of HCV RNA from serum[J].J Hepatol,1996,25:827-832.
收稿日期：1999-09-24, 百拇医药
单位：杨才生(解放军476医院，福建 福州 350002)；卢桥生(解放军476医院，福建 福州 350002)；李东良(解放军476医院，福建 福州 350002)；温云海(解放军476医院，福建 福州 350002)；张国安(解放军476医院，福建 福州 350002)；卢桥生(第一军医大学南方医院，广东 广州 510515)
关键词：丙型肝炎病毒；竞争性逆转录-聚合酶链式反应；定量试验
现代诊断与治疗000311
摘要：目的 建立检测丙型肝炎病人血清HCVRNA水平的竞争性逆转录-聚合酶链式反应定量方法。方法 采用含HCV5非编码区(5NCR)缺失突变的重组质粒5T1d，将其目的基因亚克隆到体外转录载体pCDNAⅠ多克隆位点上，获得转录重组体5T1d。将其线性化后用SP6RNA聚合酶体外转录竞争性缺失突变模板RNA，该模板定量后与血清HCVRNA一起作逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)，建立检测血清HCVRNA水平的竞争性定量方法。结果 检测15例丙肝病人20份血清，滴度为6.6×102～6.6×106copies/ml。结论 各类丙型肝炎患者血清病毒滴度均较高，经干扰素治疗后病毒水平下降1～5个Log，年龄小于20岁者干扰素治疗效果较好。
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分类号：R446.1 文献标识码：A
文章编号：1001-8174(2000)03-0155-02
Development and Application of a Quantitative Assay by Competitive RT-PCR to Measure Serum HCV RNA
YANG Cai-sheng，LI Dong-liang,WEN Yun-hai,ZHANG Guo-an
(The 476th Hospital of PLA,Fuzhou 350002,China)
LU Qiao-sheng
(The South Hospital of The First Military Medical University,Guangzhou 510516,China)
, 百拇医药
Abstract:Objective To establish quantitative assay by competitive RT-PCR measuring serum HCV RNA from patients with HCV infection.Method An in vitro transcription recombinant plasmid 5T1d was obtained after subcloning the target gene of clone 5T1d,which contained mutant HCV 5 non-coding region cDNA,into a transcriptive vector pCDNA Ⅰ.After linearization of 5T1d,recombinant RNA was synthesized using SP6 RNA polymerase.A competitive RT-PCR assay was established by co-amplification HCV wild type genome extracted from serum and recombinant RNA.Results The HCV RNA titers of 20 sera from 15 cases with hepatitis C,including five patients treated with alpha-interferon(IFN-α),were detected using this method.It was found that serum HCV RNA concerntrations ranged from 6.6×102 to 6.6×106 copies/ml.Conclusions There were high titers of HCV RNA in all kinds of patients with HCV infection.In the five patients treated with IFN-α,the serum concentrations decreased 1～5Log.The effect of IFN-α is better in patients younger than 20 years old.
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Key Words:Hepatitis C virus;Competitive RT-PCR;Quantatitive assay
丙型肝炎病毒(HCV)是肠道外传播非甲非乙型肝炎的重要病原，感染后很少自然缓解，病情较轻，进展缓慢，但预后严重，必须抗病毒治疗。检测血清HCV水平是丙型肝炎(HC)基础研究和考核疗效的重要手段。而其病毒血症水平极低，定量检测是目前HCV研究的困难之一。我们采用Kumar等[1]构建的HCV5’非编码区(5’NCR)缺失突变克隆，建立检测血清HCV的竞争性逆转录PCR(CRT-PCR)方法，初步观察丙肝病人自然状态和抗病毒治疗后的血清HCVRNA滴度变化。
1 材料与方法
1.1 研究对象 15例HC患者，男9例，女6例，年龄16～71岁，根据1995年第五次全国传染病寄生虫会议修订的临床诊断标准，急性HC5例，慢性9例，亚急性重型1例。有输血史10例。全部病人经EIA或PCR试验已排除甲型和乙型肝炎病毒感染。血清标本于-20℃库存。
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1.2 主要试剂 TOP10F菌株、转录载体pCDNA Ⅰ(Invitrogen公司)，含HCV5’NCRcDNA的缺失突变克隆5T1d(英国St Mary’s Hospital Medical School的Umesh Kumar博士惠赠)，SP6RNA聚合酶、EcoRⅠ、BamH Ⅰ、T4DNA连接酶、无RNase污染的胰DNase Ⅰ、rNTP、地高辛寡核苷酸加尾标记及检测试剂盒(BM公司)；TaqDNA聚合酶(上海复生生物工程研究所)；dNTP、AMV逆转录酶(Promega公司)；RNasin(华美生物工程公司)；引物由中国科学院上海细胞所合成，序列如下：外引物1985’CGG TTG GTG TTA CGT TTG3’(反义)，1975’ATA GAT CAC TCC CCT GTG3’(正义)；内引物0385’GAT GCA CGG TCT ACG AGA CC3’(反义)，2475’CTT CAC GCA GAA AGC GTC3’(正义)。
1.3 5T1d目的基因的亚克隆 Kumar等[1]设计的重组质粒5T1d，目的基因为人工缺失突变的5NCRcDNA(173bp),将该目的基因亚克隆到转录截体pCDNAⅠ的BamHⅠ和EcoRⅠ位点上，所获新重组体用5T1d’表示。用EcoRⅠ和BamHⅠ消化5T1d和体外转录载体pCDNAⅠ，得到目的基因及线状pCDNAⅠ在20μl体积中进行连接反应，内含T4DNA连接酶1单位，16℃过夜连接，反应液转化TOP10F’受体菌，涂布LB平皿培养基，37℃过夜培养，取白色菌落增殖后碱裂解法小规模提取质粒，斑点杂交法筛选阳性克隆5T1d’。
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1.4 竞争性RNA模板的体外转录 (1)模板制备：用BamHⅠ酶切使5T1d’线性化，在SP6RNA聚合酶作用下合成缺失突变的正链RNA分子。取5T1d’100μl，BamHⅠ5μl，10×缓冲液10μl，37℃90分钟，透析袋电泳洗脱法回收转录模板线状5T1d’。(2)转录反应：在0.5ml离心管中依次加入5×转录缓冲液20μl，100mmol/LDTT(二硫苏糖醇)10μl，RNasin3μl，5mmol/LrNTP10μl，线状5T1d’10μl，SP6RNA聚合酶2μl，无核酸酶H2O补足至100μl，37℃2小时。加入无RNase的DNaseⅠ3μl,37℃20分钟，以去除模板DNA，酚氯仿抽提，无水乙醇沉淀，10μl无核酸酶H2O重悬RNA。RNA定量参照文献[1]，获得每μl分别含105、104、103、102、101个分子的系列浓度。
1.5 竞争性RT-PCR检测血清HCVRNA滴度 (1)血清HCVRNA的抽提：SDS-蛋白酶K消化法。简言之，血清50μl，2×RNA抽提缓冲液100μl，蛋白酶K8μl(10mg/ml),无核酸酶H2O补足至200μl，42℃水浴消化45分钟，酚氯仿抽提，无水乙醇沉淀，10μl无核酸酶H2O重悬。(2)cDNA合成：设置5个反应体系，每个反应管分别加入105、104、103、102、101个竞争性模板RNA，血清RNA1μl，引物198，AMV逆转录酶10单位，总体积20μl，42℃水浴90分钟，94℃5分钟灭活逆转录酶，cDNA立即作PCR扩增。(3)巢式PCR：取cDNA各5μl，引物198、197，TaqDNA聚合酶，PCR缓冲液，dNTP进行第一轮PCR；取第一轮PCR产物1μl，引物038、247，代替第一轮引物进行第二轮PCR。两轮PCR体积均50μl，条件均为94℃60秒，56℃60秒，72℃60秒，35次循环。(4)PCR产物观察和血清HCVRNA滴度的计算：取10μl第二轮PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外光观察。扩增的野株模板产物应为279bp，竞争模板93bp，找到两者荧光亮度最接近的泳道，通过该反应管中所含的竞争性RNA拷贝数，计算血清HCVRNA的滴度。由于野株模板的分子量是竞争性模板的3倍，其RT-PCR效率是竞争模板的1/3，当两种PCR产物的荧光强度相当时，野株模板的分子数是竞争性模板拷贝数的1/3，。其计算公式是：HCVRNA滴度(拷贝/ml)=200/3×10n(10n分别为105、104、103、102、101)。
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2 结果
2.1 HCV野株模板和突变模板电泳结果 见附图。
附图 HCV野株模板和突变模板电泳结果。
泳道1、8小分子量Marker,泳道2～6分别是待测野株模板RNA和105、104、103、102、101个突变模板RNA的RT-PCR产物，可见泳道6两条带荧光强度大致相等，泳道7从第一轮PCR开始设置的空白对照
2.2 HC病人HCVRNA滴度 见表1、2。
表1 各型丙型肝炎血清HCVRNA定量结果[n(%)]
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n
HCVRNA(拷贝/ml)
6.6×102
6.6×103～6.6×104
6.6×105
6.6×106
急性
5
2(13.3)
3(20.0)
慢性
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9
1(6.7)
5(33.4)
1(6.7)
2(13.3)
亚急性重型
1
1(6.7)
合计
15
3(20.0)
8(53.3)
1(6.7)
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3(20.0)
表2 慢性丙肝干扰素治疗前后HCVRNA滴度变化 病人
年龄/性别
疗程
(月)
HCVRNA(拷贝/ml)
治疗前
治疗后
下降幅度(Log)
1
36/F
3
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6.6×104
6.6×102
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45/M
6
6.6×106
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20/F
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16/M
6
6.6×105
检不出
5
5
29/F
4
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6.6×103
1
3 讨论
HCV复制水平低，患者血清中病毒非常少，低于分子杂交检测的敏感性，逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)是一种定性试验，表现为“全”或“无”状态，不能反映病毒血症水平，建立HCV定量方法是国内外研究的热点。我们利用Kumar等[1]构建的HCV5NCR缺失突变克隆5T1d，初步建立了竞争性RT-PCR方法。该法将已知量的竞争性RNA与血清RNA一起作逆转录-PCR，两者以相同的机率竞争引物、Taq酶、dNTP等合成各自的产物，能较客观地反映样品病毒水平。用这种方法检测了15例未抗病毒治疗的HC病人血清HCVRNA含量(表2)，6.6×102copies/ml占20.0%，6.6×103～6.6×104copies/ml占53.3%，6.6×105～6.6×106copies/ml占26.7%，与其它文献报道大致相同[2]。说明无论急性和慢性HC，病毒滴度均较高。
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慢性HC病情较轻、进展较慢，很少自然恢复，抗病毒治疗是必需的。目前慢性HCV感染的主要治疗手段是α-干扰素(IFN-α)，但只是抑制HCV复制从而使炎症缓解，较少达到彻底清除病毒的目的。尽管如此，IFN治疗对大部分病例可延迟肝病进展过程。本研究检测了5例慢性HC患者IFN治疗前后的HCVRNA滴度。5例病人经IFN-α治疗后病毒滴度下降了1～5个Log。其中1例16岁男性患者治疗前HCVRNA水平6.6×105copies/ml，完成6个月疗程后病毒量低于检测水平；另1例20岁女性病人治疗前HCVRNA6.6×106copies/ml，接受4个月抗病毒治疗后，病毒滴度下降幅度较大(4个Log)。另3例病人年龄为29～45岁，治疗效果相对较差。提示年龄小者IFN治疗效果较好，与文献报道基本一致[3]。慢性HC病人经抗病毒治疗后，ALT长期稳定正常仅10%～25%，病毒清除和生化指标改善常不一致，临床上常见ALT恢复正常，病毒却没有清除，大部分病例迟早要复发，利用竞争性RT-PCR技术检测血清HCV的病毒量，是评价疗效的较理想指标，监测病程中病毒水平的动态变化，或疗程结束后进行随访，有助于决定是否延长疗程，复发前捕捉治疗机会。许多研究表明治疗前HCVRNA水平是IFN应答的重要参数，因此定量检测HCVRNA技术是一项十分有用的临床工具。
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(龙宝光教授 审)
作者简介：杨才生(1967-)，男，福建省上杭县人，主治医师，医学硕士，目前主要从事胸腺激素基础与临床工作。
参考文献：
[1]Kumar U,Thomas HC,Monjardino J.Serum HCV RNA levels in chronic HCV hepatitis measured by quantitative PCR assay,correlation with serum AST[J].J Virol Meth,1994,47(1):95-102.
[2]苏秀芬，牛俊奇，胡玉琳，等.竞争性逆转录聚合酶链式反应定量检测HCVRNA[J].中华传染病杂志，1997，15(1)：32-34.
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收稿日期：1999-09-24, 百拇医药