微生物产生的免疫抑制活性化合物S-9818的研究Ⅱ.发酵及生物学性质
作者：吕淑君 张新宜 田敏
单位：四川抗菌素工业研究所，成都 610051
关键词：免疫抑制；S-9818；FK-506；发酵
中国抗生素杂志000302 摘 要 千佛链霉菌新种SIIA 9818(Streptomyces qianfoensis sp nov SIIA 9818)在含合适碳氮源的培养基内，经发酵获约50%菌丝量的培养液。发酵第5天，其代谢产物S-9818的产生达到高峰，主要存在于菌丝体内。S-9818对革兰氏阳性、阴性菌和酵母不显示抗微生物活性，但有显著的抗其它真菌性质，特别是对黑曲霉、烟曲霉有极强的抗菌作用。淋巴细胞产生抑制试验显示，S-9818比环孢素有更强的抑制小鼠淋巴细胞产生的免疫抑制性能，S-9818的生物学性质与日本报道的FK-506十分相似。
Study on a streptomyces-produced immunosuppressive-activity compound S-9818 Ⅱ.Fermentation and biological properties
, http://www.100md.com
Lu Shujun，Zhang Xinyi，Tian Min
(Sichuan Industrial Institute of Antibiotics，Chengdu 610051)
ABSTRACT In a common medium with suitable C,N sources,Streptomyces qianfoensis sp.nov.SIIA 9818 was cultured for 7 days,harvested cultural broth with 50% mycelial mass.A metabolite named S-9818 was obtained in a peak amount at 5th day in the mycelia mainly.S-9818 appeared no activities against G+,G- bacteria,neither yeast,but active against the fungi,Aspergillus niger and A.fumigatus,especially.In the inhibition tests of lymphocyte proliferation in mice,S-9818 demonstrated its immuno-inhibiting properties,it has more stronger effects of inhibiting lymphocyte proliferation than those of Cyclosporin A.As for its biological properties,we found that S-9818 is very similar to FK-506,an immunosuppressant developed in Japan.
, 百拇医药
KEY WORDS Immunosuppressant；S-9818；FK-506；Fermentation
环孢素用于临床器官移植已取得了很好疗效，但它会引起肾毒性、高血压、高脂血症等不良反应。为了研究和开发更好的免疫抑制药物，1984年日本藤泽公司根据环孢素能抑制T细胞介导的可溶性介质如白细胞介素2、3和γ-干扰素的原理，从大量发酵液里筛选抑制白细胞介素2产生的免疫抑制剂，从中发现了由筑波链霉菌产生的代谢产物FK-506[1][通用名：他克莫司(tacrolimus)]。他克莫司的体内外免疫抑制活性为环孢素的10～100倍[2]，且无明显细胞毒性，临床用于肝、肾移植患者，特别是环孢素无效患者或因不良反应不能继续使用环孢素的患者，取得良好成绩。FK-506对自身免疫疾病，如难治性贝切特氏病、慢性关节风湿病、特异性皮炎也有疗效，1993年在日本上市，1994年获FDA批准在美国用于肝脏移植，目前已在世界20多个国家上市。
, http://www.100md.com
我所从山东济南土壤中分离到一株放线菌SIIA 9818，分类学研究鉴别其为千佛链霉菌新种，经发酵、提取、精制获得了代谢产物的棱柱状结晶，其生物、理化性质与FK-506十分相似，结构研究也证明与FK-506同质。菌株的分类学鉴别和化合物结构鉴定另文报道，本文报道产生菌SIIA-9818的发酵、代谢过程及部分生物学性质。
1 材料和方法
1.1 产生菌
从我国山东济南市郊外千佛山土壤中分离获得一株放线菌，经菌种分类学研究定名为千佛链霉菌新种SIIA-9818(Streptomyces qianfoensis sp nov SIIA-9818)[3]。
1.2 发酵
链霉菌SIIA-9818能在葡萄糖-天冬素、AGS等多种斜面上生长良好。种子培养基为专利文献报道的KE培养基作适当修改。发酵培养基为专利文献报道的FKA培养基加T因子。斜面孢子转种到装有30ml培养基的250ml摇瓶或100ml发酵培养基的750ml摇瓶中，在旋转式摇床上培养，获菌丝量达50%左右的黄褐色培养液。
, 百拇医药
1.3 抗微生物活性
最小抑菌浓度(MIC)试验中，被试菌种烟曲霉和尖孢镰刀菌由中国科学院北京微生物研究所中国菌种保藏中心提供，其余标准检定菌为本研究室保藏菌种。试验采用二倍稀释法。MH培养基用于抗细菌试验，沙氏培养基用于抗真菌试验。细菌培养在35℃ 18h，真菌培养在28℃ 24h记录结果。S-9818棱柱状结晶由本研究室提供。
1.4 分析
用高压液相法测定发酵液及菌丝体内的S-9818的含量。HPLC分析由本所药理研究室程强承担。
1.5 淋巴细胞增生抑制试验
按专利文献[4]方法作适当改进。无菌取出BALB/C小鼠脾脏，小心分散于冰冷的RPMI 1640培养液增补10%热失活小牛血清及100u/ml青霉素和100u/ml链霉素(简称1640培养液)里，1500r/min离心5min，收集细胞，细胞用氯化铵缓冲液处理以除去带入的红细胞，再用冷的1640培养液洗涤2次，将细胞调成106/ml后在96孔板里每孔加100μl并加入6.7mg/L的伴刀豆球蛋白A(Sigma Con.A)以刺激淋巴细胞增生，96孔板在37℃，5% CO2培养箱内培养24h后加入不同稀释浓度的被测样品，环孢素(本研究室提供)为阳性对照，不加样品的为空白对照，每样3孔，同样条件下继续培养48h后，96孔板上的样品用MTT比色法[5]，用318MC型酶标仪于570nm测光密度判断小鼠淋巴细胞增生。以
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2 结果
2.1 发酵
千佛链霉菌SIIA 9818在种子培养基中28℃培养2d，移种于发酵培养基内28℃培养7d，可见发酵液内约有50%含量的菌丝体，菌丝在72h时生长即达高峰；pH值在24h略有下降，以后渐升至7.0以上；S-9818在发酵第3天产生，第5天达高峰，以后略有下降。S-9818主要存在于菌丝体内。表1列出了5个菌株发酵全液和菌丝体内S-9818含量比例，约有80%的S-9818存在于菌丝体内，20%左右的S-9818释放在滤液中。
2.2 抗微生物活性
经S-9818的最小抑菌浓度(MIC)测定，显示S-9818不抗细菌和酵母，但有抗其它真菌活性，特别是对黑曲霉和烟曲霉具有极强的抗菌活性，其抗微生物活性见表2所示。
2.3 S-9818对淋巴细胞增生的抑制试验
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表1 S-9818在菌丝体内外的含量比 菌号
HPLC测定效价(mg/L)
%
菌丝抽液
发酵全液
20
36
53
68
69
31
41
76
, http://www.100md.com
77
41
53
77
R-10
42
54
78
U-88
66
75
88
表2 S-9818抗微生物活性 微生物
, 百拇医药
MIC
(mg/L)
微生物
MIC
(mg/L)
枯草杆菌
100
白色念珠菌
100
金葡球菌
100
新型隐球菌51A
50
, http://www.100md.com
腊样芽孢杆菌
100
尖孢镰刀菌
100
大肠埃希氏菌
100
石膏样小孢子菌
12.5
铜绿假单孢菌
100
黑曲霉
0.05
酵母
, http://www.100md.com
100
烟曲霉
0.05
用Con.A体外刺激BALA/C小鼠脾脏淋巴细胞使其增生，在加了各种浓度的免疫抑制活性化合物后，淋巴细胞增生受到抑制，通过MTT比色法可测出抑制百分率。实验中S-9818和环孢素的实验浓度为0.5～50mg/L，在我们的实验条件下，试验结果显示1mg/L的S-9818即能抑制55.9%的小鼠淋巴细胞产生，50mg/L可达80%左右的抑制率。而环孢素在50mg/L的浓度下才能达47.4%的抑制率，见图1。
将SIIA 9818的发酵抽提液稀释150倍可达同样抑制百分率(67.4%)。
图1 S-9818对小鼠淋巴细胞增生的抑制作用
, 百拇医药
1：S-9818；2：环孢素
3 讨论
由千佛链霉菌SIIA 9818产生的代谢产物经分离、纯化获大环内酯类抗生素棱柱状结晶S-9818，其理化性质及结构与国外报道的FK-506一致[6]。发酵过程及其生物学性质的研究亦显示S-9818与FK-506十分相似。文献报道[1]FK-506产生菌筑波链霉菌在培养40h后开始产生FK-506，90h以后获最大累积量。培养期间，培养基的pH下落至6.2，然后渐升至7.3，此时代谢物获最大累积量，与本文报道的数据相一致。
许多大环内酯类抗生素在发酵过程中被释放在培养液中，如16元大环内酯类抗生素柱晶白霉素以及红霉素、麦迪霉素、螺旋霉素等，它们的代谢产物在菌丝体内残存极少，而有些抗生素如23元大环内酯类抗生素阿弗菌素则主要存在于菌丝体内，约有97%的阿弗菌素在培养液的菌丝体内，而仅有3%左右释放在溶液中。筑波链霉菌在培养到90h时，菌丝体内约含40mg/L以上的FK-506，而溶液中约含10mg/L[1]。我们报道的大环内酯类抗生素S-9818有80%左右存在于菌丝体内，这与FK-506的产生十分相似。
, 百拇医药
在抗微生物活性试验中，S-9818和国外报道的FK-506一样不抗革兰氏阳性、阴性菌，而对烟曲霉有较强的抗菌活性，其MIC分别为0.05和0.025mg/L，但对尖孢镰刀菌的抗菌活性相差较大(FK-506 MIC文献值为0.05mg/L)。
FK-506有很强的免疫抑制作用，其中对淋巴细胞增生的抑制作用被多篇文章报道过[4，7，8]，我们改进了专利文献[4]报道的方法，采用Con.A刺激淋巴细胞，成功地检测了S-9818对小鼠淋巴细胞增生的抑制作用，试验结果明显指出S-9818比环孢素有更强的抑制小鼠淋巴细胞增生的作用。SIIA 9818的发酵液有同样的免疫抑制作用。
致谢：刘瑜参加过部分工作，吴明帮助测定OD值，特此感谢。
吕淑君,女,生于1940年,研究员.
参考文献
, 百拇医药
1，Kino T,Hatanaka H,Hashimoto M,et al.FK-506,a novel immunosuppressant isolated from a Streptomyces I.Fermentation,isolation and physico-chemical and biological characteristics.J Antibiot，1987；40(9)：1249
2，Siekierka J J,Jostakuch M,Hung S H Y,et al.FK-506,a potent novel immunosuppressive agent binds to a cytosolic protein which is distinct from the CsA-binding protein.J Immunology，1989；143(5)：1580
3，田敏，张新宜，刘瑜，等.微生物产生的免疫抑制活性化合物S-9818的研究Ⅰ.产生菌SIIA-9818菌株的分类鉴定.中国抗生素杂志，待发表
, 百拇医药
4，Salituro G M,Dumont F,Garrity G M,et al.Process for producing FK-506.U.S.Patent 5194378.1993
5，Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotoxicity assays.J Immunol Methods，1983；65：55
6，陆群.微生物产生的免疫抑制活性化合物S-9818的研究Ⅲ.分离和结构鉴别.中国抗生素杂志，待发表
7，Okuhara M,Tanaka H,Goto T,et al.Tricyclo compounds,a process for their production and a pharmaceutical composition containing the same.U.S.Patent 4894366.1990
8，Kino T,Hatanaka H,Miyata S,et al.FK-506,a novel immunosuppressant isolated from a Streptomyces Ⅱ.Immunosuppressive effect of FK-506 in vitro.J Antibiot，1987；40(9)：1256
收稿：1999-07-20, 百拇医药
单位：四川抗菌素工业研究所，成都 610051
关键词：免疫抑制；S-9818；FK-506；发酵
中国抗生素杂志000302 摘 要 千佛链霉菌新种SIIA 9818(Streptomyces qianfoensis sp nov SIIA 9818)在含合适碳氮源的培养基内，经发酵获约50%菌丝量的培养液。发酵第5天，其代谢产物S-9818的产生达到高峰，主要存在于菌丝体内。S-9818对革兰氏阳性、阴性菌和酵母不显示抗微生物活性，但有显著的抗其它真菌性质，特别是对黑曲霉、烟曲霉有极强的抗菌作用。淋巴细胞产生抑制试验显示，S-9818比环孢素有更强的抑制小鼠淋巴细胞产生的免疫抑制性能，S-9818的生物学性质与日本报道的FK-506十分相似。
Study on a streptomyces-produced immunosuppressive-activity compound S-9818 Ⅱ.Fermentation and biological properties
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Lu Shujun，Zhang Xinyi，Tian Min
(Sichuan Industrial Institute of Antibiotics，Chengdu 610051)
ABSTRACT In a common medium with suitable C,N sources,Streptomyces qianfoensis sp.nov.SIIA 9818 was cultured for 7 days,harvested cultural broth with 50% mycelial mass.A metabolite named S-9818 was obtained in a peak amount at 5th day in the mycelia mainly.S-9818 appeared no activities against G+,G- bacteria,neither yeast,but active against the fungi,Aspergillus niger and A.fumigatus,especially.In the inhibition tests of lymphocyte proliferation in mice,S-9818 demonstrated its immuno-inhibiting properties,it has more stronger effects of inhibiting lymphocyte proliferation than those of Cyclosporin A.As for its biological properties,we found that S-9818 is very similar to FK-506,an immunosuppressant developed in Japan.
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KEY WORDS Immunosuppressant；S-9818；FK-506；Fermentation
环孢素用于临床器官移植已取得了很好疗效，但它会引起肾毒性、高血压、高脂血症等不良反应。为了研究和开发更好的免疫抑制药物，1984年日本藤泽公司根据环孢素能抑制T细胞介导的可溶性介质如白细胞介素2、3和γ-干扰素的原理，从大量发酵液里筛选抑制白细胞介素2产生的免疫抑制剂，从中发现了由筑波链霉菌产生的代谢产物FK-506[1][通用名：他克莫司(tacrolimus)]。他克莫司的体内外免疫抑制活性为环孢素的10～100倍[2]，且无明显细胞毒性，临床用于肝、肾移植患者，特别是环孢素无效患者或因不良反应不能继续使用环孢素的患者，取得良好成绩。FK-506对自身免疫疾病，如难治性贝切特氏病、慢性关节风湿病、特异性皮炎也有疗效，1993年在日本上市，1994年获FDA批准在美国用于肝脏移植，目前已在世界20多个国家上市。
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我所从山东济南土壤中分离到一株放线菌SIIA 9818，分类学研究鉴别其为千佛链霉菌新种，经发酵、提取、精制获得了代谢产物的棱柱状结晶，其生物、理化性质与FK-506十分相似，结构研究也证明与FK-506同质。菌株的分类学鉴别和化合物结构鉴定另文报道，本文报道产生菌SIIA-9818的发酵、代谢过程及部分生物学性质。
1 材料和方法
1.1 产生菌
从我国山东济南市郊外千佛山土壤中分离获得一株放线菌，经菌种分类学研究定名为千佛链霉菌新种SIIA-9818(Streptomyces qianfoensis sp nov SIIA-9818)[3]。
1.2 发酵
链霉菌SIIA-9818能在葡萄糖-天冬素、AGS等多种斜面上生长良好。种子培养基为专利文献报道的KE培养基作适当修改。发酵培养基为专利文献报道的FKA培养基加T因子。斜面孢子转种到装有30ml培养基的250ml摇瓶或100ml发酵培养基的750ml摇瓶中，在旋转式摇床上培养，获菌丝量达50%左右的黄褐色培养液。
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1.3 抗微生物活性
最小抑菌浓度(MIC)试验中，被试菌种烟曲霉和尖孢镰刀菌由中国科学院北京微生物研究所中国菌种保藏中心提供，其余标准检定菌为本研究室保藏菌种。试验采用二倍稀释法。MH培养基用于抗细菌试验，沙氏培养基用于抗真菌试验。细菌培养在35℃ 18h，真菌培养在28℃ 24h记录结果。S-9818棱柱状结晶由本研究室提供。
1.4 分析
用高压液相法测定发酵液及菌丝体内的S-9818的含量。HPLC分析由本所药理研究室程强承担。
1.5 淋巴细胞增生抑制试验
按专利文献[4]方法作适当改进。无菌取出BALB/C小鼠脾脏，小心分散于冰冷的RPMI 1640培养液增补10%热失活小牛血清及100u/ml青霉素和100u/ml链霉素(简称1640培养液)里，1500r/min离心5min，收集细胞，细胞用氯化铵缓冲液处理以除去带入的红细胞，再用冷的1640培养液洗涤2次，将细胞调成106/ml后在96孔板里每孔加100μl并加入6.7mg/L的伴刀豆球蛋白A(Sigma Con.A)以刺激淋巴细胞增生，96孔板在37℃，5% CO2培养箱内培养24h后加入不同稀释浓度的被测样品，环孢素(本研究室提供)为阳性对照，不加样品的为空白对照，每样3孔，同样条件下继续培养48h后，96孔板上的样品用MTT比色法[5]，用318MC型酶标仪于570nm测光密度判断小鼠淋巴细胞增生。以
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2 结果
2.1 发酵
千佛链霉菌SIIA 9818在种子培养基中28℃培养2d，移种于发酵培养基内28℃培养7d，可见发酵液内约有50%含量的菌丝体，菌丝在72h时生长即达高峰；pH值在24h略有下降，以后渐升至7.0以上；S-9818在发酵第3天产生，第5天达高峰，以后略有下降。S-9818主要存在于菌丝体内。表1列出了5个菌株发酵全液和菌丝体内S-9818含量比例，约有80%的S-9818存在于菌丝体内，20%左右的S-9818释放在滤液中。
2.2 抗微生物活性
经S-9818的最小抑菌浓度(MIC)测定，显示S-9818不抗细菌和酵母，但有抗其它真菌活性，特别是对黑曲霉和烟曲霉具有极强的抗菌活性，其抗微生物活性见表2所示。
2.3 S-9818对淋巴细胞增生的抑制试验
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表1 S-9818在菌丝体内外的含量比 菌号
HPLC测定效价(mg/L)
%
菌丝抽液
发酵全液
20
36
53
68
69
31
41
76
, http://www.100md.com
77
41
53
77
R-10
42
54
78
U-88
66
75
88
表2 S-9818抗微生物活性 微生物
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MIC
(mg/L)
微生物
MIC
(mg/L)
枯草杆菌
100
白色念珠菌
100
金葡球菌
100
新型隐球菌51A
50
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腊样芽孢杆菌
100
尖孢镰刀菌
100
大肠埃希氏菌
100
石膏样小孢子菌
12.5
铜绿假单孢菌
100
黑曲霉
0.05
酵母
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100
烟曲霉
0.05
用Con.A体外刺激BALA/C小鼠脾脏淋巴细胞使其增生，在加了各种浓度的免疫抑制活性化合物后，淋巴细胞增生受到抑制，通过MTT比色法可测出抑制百分率。实验中S-9818和环孢素的实验浓度为0.5～50mg/L，在我们的实验条件下，试验结果显示1mg/L的S-9818即能抑制55.9%的小鼠淋巴细胞产生，50mg/L可达80%左右的抑制率。而环孢素在50mg/L的浓度下才能达47.4%的抑制率，见图1。
将SIIA 9818的发酵抽提液稀释150倍可达同样抑制百分率(67.4%)。
图1 S-9818对小鼠淋巴细胞增生的抑制作用
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1：S-9818；2：环孢素
3 讨论
由千佛链霉菌SIIA 9818产生的代谢产物经分离、纯化获大环内酯类抗生素棱柱状结晶S-9818，其理化性质及结构与国外报道的FK-506一致[6]。发酵过程及其生物学性质的研究亦显示S-9818与FK-506十分相似。文献报道[1]FK-506产生菌筑波链霉菌在培养40h后开始产生FK-506，90h以后获最大累积量。培养期间，培养基的pH下落至6.2，然后渐升至7.3，此时代谢物获最大累积量，与本文报道的数据相一致。
许多大环内酯类抗生素在发酵过程中被释放在培养液中，如16元大环内酯类抗生素柱晶白霉素以及红霉素、麦迪霉素、螺旋霉素等，它们的代谢产物在菌丝体内残存极少，而有些抗生素如23元大环内酯类抗生素阿弗菌素则主要存在于菌丝体内，约有97%的阿弗菌素在培养液的菌丝体内，而仅有3%左右释放在溶液中。筑波链霉菌在培养到90h时，菌丝体内约含40mg/L以上的FK-506，而溶液中约含10mg/L[1]。我们报道的大环内酯类抗生素S-9818有80%左右存在于菌丝体内，这与FK-506的产生十分相似。
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在抗微生物活性试验中，S-9818和国外报道的FK-506一样不抗革兰氏阳性、阴性菌，而对烟曲霉有较强的抗菌活性，其MIC分别为0.05和0.025mg/L，但对尖孢镰刀菌的抗菌活性相差较大(FK-506 MIC文献值为0.05mg/L)。
FK-506有很强的免疫抑制作用，其中对淋巴细胞增生的抑制作用被多篇文章报道过[4，7，8]，我们改进了专利文献[4]报道的方法，采用Con.A刺激淋巴细胞，成功地检测了S-9818对小鼠淋巴细胞增生的抑制作用，试验结果明显指出S-9818比环孢素有更强的抑制小鼠淋巴细胞增生的作用。SIIA 9818的发酵液有同样的免疫抑制作用。
致谢：刘瑜参加过部分工作，吴明帮助测定OD值，特此感谢。
吕淑君,女,生于1940年,研究员.
参考文献
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1，Kino T,Hatanaka H,Hashimoto M,et al.FK-506,a novel immunosuppressant isolated from a Streptomyces I.Fermentation,isolation and physico-chemical and biological characteristics.J Antibiot，1987；40(9)：1249
2，Siekierka J J,Jostakuch M,Hung S H Y,et al.FK-506,a potent novel immunosuppressive agent binds to a cytosolic protein which is distinct from the CsA-binding protein.J Immunology，1989；143(5)：1580
3，田敏，张新宜，刘瑜，等.微生物产生的免疫抑制活性化合物S-9818的研究Ⅰ.产生菌SIIA-9818菌株的分类鉴定.中国抗生素杂志，待发表
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4，Salituro G M,Dumont F,Garrity G M,et al.Process for producing FK-506.U.S.Patent 5194378.1993
5，Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotoxicity assays.J Immunol Methods，1983；65：55
6，陆群.微生物产生的免疫抑制活性化合物S-9818的研究Ⅲ.分离和结构鉴别.中国抗生素杂志，待发表
7，Okuhara M,Tanaka H,Goto T,et al.Tricyclo compounds,a process for their production and a pharmaceutical composition containing the same.U.S.Patent 4894366.1990
8，Kino T,Hatanaka H,Miyata S,et al.FK-506,a novel immunosuppressant isolated from a Streptomyces Ⅱ.Immunosuppressive effect of FK-506 in vitro.J Antibiot，1987；40(9)：1256
收稿：1999-07-20, 百拇医药