重症肝炎免疫治疗与细胞因子、T细胞亚群的调控关系
作者：齐晖 黄瑞芳 黄自存
单位：(广东省深圳市人民医院518020)
关键词：重症肝炎；免疫治疗；T淋巴细胞亚群；炎症性细胞因子
广东医学000313
【摘要】 目的 了解重症肝炎患者经Tα1免疫治疗前后外周血中(TNF-α)，sIL-2R,IL-4,IL-6,内毒素及T细胞亚群(CD+4，CD+8)的变化。方法 采用ELISA方法或合成基质偶氮显色法或链菌素亲生物素过氧化酶连接法检测上述指标。结果 治疗前各项指标较正常值均有明显改变，治疗后除sIL-2R和CD+4外，其他指标基本恢复到正常水平。结论 Tα1是强有力的免疫调节剂，能降低TNF-α，sIL-2R,IL-6，内毒素及CD+8含量，提高IL-4水平，从而减轻重症肝炎时免疫反应对肝细胞的损伤。
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Regulation effect of cytokines and T cell subtypes on the immunotherapy of severe hepatitis patients
Qi Hui, Huang Ruifang, Huang Zicun.
(Shenzhen People's Hospital, Shenzhen 518020)
【Abstract】 Objective To study the changes of TNF-α, sIL-2R, IL-4, IL-6, endotoxin and T cell subtypes in patients with severe hepatitis before and after treatment with Tα1. Methods TNF-α, sIL-2R, IL-4, IL-6, endotoxin and T cell subtypes were measured by using ELISA, azocoloration or Biotin-streptavidin-peroxides staining.Results Patients had abnormal TNF-α, sIL-2R, IL-4, IL-6, endotoxin and T cell subtypes before treatment when compared to those in the controls. Most indexed except sIL-2R and CD+4 returned close to normal level after treatment.Conclusion Tα1 can decrease the level of TNF-α, sIL-2R, IL-6, endotoxin and CD+8, while increases IL-4 level, attenuating immune injury of hepatocyte in severe hepatitis patients.
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【Key words】 Severe hepatitis Immunotherapy Cytokines T cell subtype
T淋巴细胞是参与病毒免疫的主要细胞群，而细胞因子又在免疫病理和活化过程中起重要作用。重症肝炎时，可能通过外源或肠源性内毒素刺激肿瘤坏死因子(TNF)的产生，TNF诱发一系列炎症性细胞因子的连锁反应；或是通过CD+8诱导组织相关抗原I型免疫反应，致使肝细胞大量坏死。目前对重症肝炎的免疫治疗是应用免疫调节剂来减轻上述免疫反应以达到阻断肝细胞坏死的过程。我们用化学合成胸腺肽α1(Tα1)治疗12例重症病毒性肝炎患者，检测患者外周血中TNF-α，TNF，sIL-2R,IL-4,IL-6，内毒素及T细胞亚群(CD+4，CD+8)水平，观察在治疗前、治疗后各项指标的变化，并对其相关性进行分析，探讨疗效与免疫之间的相互关系。
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1 资料与方法
1.1 一般资料 按1995年全国肝炎会议标准，选取重症肝炎12例，男性8例，女性4例，平均年龄42.5岁。其中急性重症1例，亚急性重症2例，慢性重症9例。
1.2 治疗方法 在一般综合治疗(包括血浆、白蛋白及对症治疗)的基础上，加用Tα1 1.6 mg， 隔日一次或每周两次，皮下注射，28 d为一疗程。
1.3 实验室检测 分别于治疗前、治疗后抽取重症肝炎患者静脉血，①检测TNF-α，IL-2R，IL-4，IL-6：静脉血2 ml, 2% EDTA抗凝，1 500 r/min离心，取血浆-30℃保存至检测。TNF-α，IL-2R，IL-4，IL-6试剂盒均为美国Endogen公司生产。采用ELISA方法检测，450 nm处读吸光度值，根据各自的标准曲线计算各因子含量。②检测内毒素：2 ml静脉血肝素抗凝，以上海医化所生产的鲎试剂合成基质偶氮显色法检测内毒素水平。③T细胞亚群检测：用美国Zymed公司生产的试剂盒，以链菌素亲生物素过氧化酶连接法检测CD+4、CD+8。④对照组20例，选自健康献血者，男12例，女8例，平均年龄38.5岁。
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1.4 统计学处理 检测数据以
±s表示，部分指标进行相关性分析，P<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 TNF-α，IL-2R，IL-4，IL-6水平 治疗前TNF-α，IL-2R，IL-6水平较对照组明显升高，而IL-4水平较对照组明显降低，P值均小于0.01。经Tα1治疗后，TNF-α，IL-4，IL-6基本恢复至正常水平，IL-2R水平较治疗前明显降低，但与正常值比较仍明显升高(P<0.05)。详见表1。
表1 治疗前后TNF-α，IL-2R，IL-4，IL-6水平的变化 (±s)pg/ml 组别
TNF-α
, 百拇医药
IL-2R
IL-4
IL-6
对照组
10.35±1.88
812.92±69.47
23.77±1.10
?8.93±2.57
治疗前
16.15±3.70**
2004.57±412.91△
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18.75±1.05**
11.20±3.27*
治疗后
13.32±2.13
1208.90±240.23*
21.72±0.84
8.85±2.70
与对照组比较 *P<0.05,**P<0.01,△P<0.001
2.2 T细胞亚群及内毒素改变 重症肝炎患者血淋巴细胞计数见表2。与对照组比较治疗前CD+4明显降低、CD+8升高；内毒素水平较对照组明显升高。治疗后CD+8基本恢复正常，CD+4较治疗前则没有明显改变。内毒素水平下降接近正常值。表2 治疗前后T细胞亚群及内毒素改变±s 组别
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CD+4(%)
CD+8(%)
内毒素(EU/ml)
正常值
41.3±5.6
26.4±4.6
<0.03
治疗前
32.1±4.22*
31.1±3.47*
0.125±0.026**
, 百拇医药
治疗后
33.55±3.03*
25.5±2.69
0.032±0.013
与正常值比较，*P<0.05,**P<0.01
2.3 相关性分析 重症肝炎患者血浆中IL-6与TNF-α、sIL-2R存在明显相关性，r值分别为0.677和0.778。IL-6与CD+8的相关系数为0.815，P<0.05。其它各因子间相关性不明显。
3 讨论
TNF-α和IL-6为单核巨噬细胞分泌的细胞因子，在机体各种炎性反应中发挥重要作用。重症肝炎时，TNF-α是引起肝细胞大量坏死的重要因素。TNF-α的增高和凝血酶原活动度、胆红素有关。在病毒感染的情况下，TNF可诱导一系列的炎症性细胞因子，包括IL-2R，IL-6的连锁反应，这些炎症因子可刺激体内产生内源性丝氨酸类蛋白酶，对肝细胞产生损伤。我们的研究结果显示：重症肝炎病人血中TNF-α，IL-6水平均升高，经Tα1治疗后，它们的活性降低，其水平也大致恢复正常。说明Tα1具有抗炎效应，能抑制TNF-α，IL-6等炎性细胞因子的活性，减轻肝脏损伤的程度。L-2R来源于淋巴细胞膜受体的细胞外段，是机体免疫系统激活的重要标志之一。肝炎患者肝细胞的损害是细胞毒性T淋巴细胞对受染肝细胞的清除作用所致，因此，检测sIL-2R有助于了解机体的T细胞免疫、肝细胞损害程度和免疫治疗评估。我们的实验资料表明治疗前sIL-2R明显升高，虽然治疗后其水平降低，但较正常对照组仍有明显差异。提示免疫治疗激活淋巴细胞，细胞因子的分泌受多方面的影响。IL-6可诱导淋巴细胞表达sIL-2R，两者之间存在明显相关性。
, 百拇医药
IL-4是Th2细胞产生的具有多种生物学活性的细胞因子。体内外实验证实，IL-4可抑制单核巨噬细胞分泌的IL-1和TNF-α，而且促进IL-1受体拮抗剂的表达。IL-4还能抑制TNF-α，IL-6，IL-8等多种炎症介质的形成，具有显著抗炎作用。Fukuda等[1]检测肝组织内IL-4 mRNA表达时观察到，在慢性活动性肝炎缓解期常伴有IL-4 mRNA水平增高，提示IL-4与肝炎缓解有密切关系。国内有学者报道重症肝炎时IL-4水平与病情和预后有关[2]。我们的实验显示，重症肝炎病人治疗前IL-4水平低下，治疗后回升，表明IL-4可做为重症肝炎疗效观察的重要指标。
淋巴细胞膜表面白细胞分化抗原CD+4和CD+8在病毒性肝炎病人表现各异[3]。CD+8通过组织相关抗原Ⅰ型免疫反应导致肝细胞损伤[4]，此类损伤较CD+4介导的损伤更明显。重症肝炎时CD+8增高，CD+4降低，说明CD+8在重症肝炎时肝细胞大量坏死中起重要作用。治疗后病人外周血中淋巴细胞CD+8降低，CD+4升高，提示经Tα1免疫治疗能改变重症肝炎患者T细胞亚群的比例，减轻CD+8导致的肝细胞坏死程度。
, 百拇医药
细菌产生的内毒素是多种细胞因子的诱生剂，可刺激IL-1，IL-6，TNF-α的分泌[5]。内毒素通过TNF介导加重肝脏损伤。内毒素和TNF可作为激发剂诱导Schwrtzman反应，造成大量肝细胞损伤。重症肝炎时，网状内皮系统功能低下，不能清除来自肠道的内毒素，同时，由于机体抵抗力低下，容易招致细菌感染。因此，重症肝炎常产生高内毒素血症。
综上所述，重症肝炎病人CD+8数量增加，诱发组织相关抗原Ⅰ型免疫反应，血清内毒素水平增加，诱发IL-2R，IL-6等炎性因子连锁反应，造成大量肝细胞坏死。经免疫调节剂Tα1治疗后，CD+8数量减少，血清内毒素水平及TNF活性降低，从而减轻炎症反应。另外通过提高IL-4水平，抑制炎症性细胞因子对肝脏的损伤。
参考文献
[1]Fukuda R, Ishimuraa N, Nguyen TX, et al. The expression IL-2, IL-4 and interferon gam (IFN γ)mRNA using liver biopsis at different phase of acute exacerbaation of chronic hepatitis B. Clin Exp Immunol, 1995, 100: 446
, http://www.100md.com
[2]石裕明，张立煌，方梅林，等.IL-4对重症肝炎患者外周血单核细胞IL-1α表达调节的研究.中华传染病杂志，1998，16(3)：144
[3]张国良，黄自存，黄瑞芳，等.病毒肝炎患者免疫治疗与CD、TNF、sIL-2R的调控关系.实用医学杂志，1997，13(12)：783
[4]Ando K, Guidotti L, Wirth L, et al. Class-Irestricted cytetoxin lymphocytes are directly cytopathic for their target cell in vivo. J Immunology, 1994, 152(7):3425
[5]Sekiyama KD, Yoshiba M, Thomson AW, et al. Circulating proinflammaatory cytokines (IL-1R, TNF-α and IL-6) and IL-1 receptor antagonist (IL-1R α) in fuliminant hepatic failure. Clin Exp Immunol, 1994, 98: 71
(收稿日期：1999-07-17), http://www.100md.com
单位：(广东省深圳市人民医院518020)
关键词：重症肝炎；免疫治疗；T淋巴细胞亚群；炎症性细胞因子
广东医学000313
【摘要】 目的 了解重症肝炎患者经Tα1免疫治疗前后外周血中(TNF-α)，sIL-2R,IL-4,IL-6,内毒素及T细胞亚群(CD+4，CD+8)的变化。方法 采用ELISA方法或合成基质偶氮显色法或链菌素亲生物素过氧化酶连接法检测上述指标。结果 治疗前各项指标较正常值均有明显改变，治疗后除sIL-2R和CD+4外，其他指标基本恢复到正常水平。结论 Tα1是强有力的免疫调节剂，能降低TNF-α，sIL-2R,IL-6，内毒素及CD+8含量，提高IL-4水平，从而减轻重症肝炎时免疫反应对肝细胞的损伤。
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Regulation effect of cytokines and T cell subtypes on the immunotherapy of severe hepatitis patients
Qi Hui, Huang Ruifang, Huang Zicun.
(Shenzhen People's Hospital, Shenzhen 518020)
【Abstract】 Objective To study the changes of TNF-α, sIL-2R, IL-4, IL-6, endotoxin and T cell subtypes in patients with severe hepatitis before and after treatment with Tα1. Methods TNF-α, sIL-2R, IL-4, IL-6, endotoxin and T cell subtypes were measured by using ELISA, azocoloration or Biotin-streptavidin-peroxides staining.Results Patients had abnormal TNF-α, sIL-2R, IL-4, IL-6, endotoxin and T cell subtypes before treatment when compared to those in the controls. Most indexed except sIL-2R and CD+4 returned close to normal level after treatment.Conclusion Tα1 can decrease the level of TNF-α, sIL-2R, IL-6, endotoxin and CD+8, while increases IL-4 level, attenuating immune injury of hepatocyte in severe hepatitis patients.
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【Key words】 Severe hepatitis Immunotherapy Cytokines T cell subtype
T淋巴细胞是参与病毒免疫的主要细胞群，而细胞因子又在免疫病理和活化过程中起重要作用。重症肝炎时，可能通过外源或肠源性内毒素刺激肿瘤坏死因子(TNF)的产生，TNF诱发一系列炎症性细胞因子的连锁反应；或是通过CD+8诱导组织相关抗原I型免疫反应，致使肝细胞大量坏死。目前对重症肝炎的免疫治疗是应用免疫调节剂来减轻上述免疫反应以达到阻断肝细胞坏死的过程。我们用化学合成胸腺肽α1(Tα1)治疗12例重症病毒性肝炎患者，检测患者外周血中TNF-α，TNF，sIL-2R,IL-4,IL-6，内毒素及T细胞亚群(CD+4，CD+8)水平，观察在治疗前、治疗后各项指标的变化，并对其相关性进行分析，探讨疗效与免疫之间的相互关系。
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1 资料与方法
1.1 一般资料 按1995年全国肝炎会议标准，选取重症肝炎12例，男性8例，女性4例，平均年龄42.5岁。其中急性重症1例，亚急性重症2例，慢性重症9例。
1.2 治疗方法 在一般综合治疗(包括血浆、白蛋白及对症治疗)的基础上，加用Tα1 1.6 mg， 隔日一次或每周两次，皮下注射，28 d为一疗程。
1.3 实验室检测 分别于治疗前、治疗后抽取重症肝炎患者静脉血，①检测TNF-α，IL-2R，IL-4，IL-6：静脉血2 ml, 2% EDTA抗凝，1 500 r/min离心，取血浆-30℃保存至检测。TNF-α，IL-2R，IL-4，IL-6试剂盒均为美国Endogen公司生产。采用ELISA方法检测，450 nm处读吸光度值，根据各自的标准曲线计算各因子含量。②检测内毒素：2 ml静脉血肝素抗凝，以上海医化所生产的鲎试剂合成基质偶氮显色法检测内毒素水平。③T细胞亚群检测：用美国Zymed公司生产的试剂盒，以链菌素亲生物素过氧化酶连接法检测CD+4、CD+8。④对照组20例，选自健康献血者，男12例，女8例，平均年龄38.5岁。
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1.4 统计学处理 检测数据以
±s表示，部分指标进行相关性分析，P<0.05有统计学意义。2 结果
2.1 TNF-α，IL-2R，IL-4，IL-6水平 治疗前TNF-α，IL-2R，IL-6水平较对照组明显升高，而IL-4水平较对照组明显降低，P值均小于0.01。经Tα1治疗后，TNF-α，IL-4，IL-6基本恢复至正常水平，IL-2R水平较治疗前明显降低，但与正常值比较仍明显升高(P<0.05)。详见表1。
表1 治疗前后TNF-α，IL-2R，IL-4，IL-6水平的变化 (
±s)pg/ml 组别TNF-α
, 百拇医药
IL-2R
IL-4
IL-6
对照组
10.35±1.88
812.92±69.47
23.77±1.10
?8.93±2.57
治疗前
16.15±3.70**
2004.57±412.91△
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18.75±1.05**
11.20±3.27*
治疗后
13.32±2.13
1208.90±240.23*
21.72±0.84
8.85±2.70
与对照组比较 *P<0.05,**P<0.01,△P<0.001
2.2 T细胞亚群及内毒素改变 重症肝炎患者血淋巴细胞计数见表2。与对照组比较治疗前CD+4明显降低、CD+8升高；内毒素水平较对照组明显升高。治疗后CD+8基本恢复正常，CD+4较治疗前则没有明显改变。内毒素水平下降接近正常值。表2 治疗前后T细胞亚群及内毒素改变
±s 组别, http://www.100md.com
CD+4(%)
CD+8(%)
内毒素(EU/ml)
正常值
41.3±5.6
26.4±4.6
<0.03
治疗前
32.1±4.22*
31.1±3.47*
0.125±0.026**
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治疗后
33.55±3.03*
25.5±2.69
0.032±0.013
与正常值比较，*P<0.05,**P<0.01
2.3 相关性分析 重症肝炎患者血浆中IL-6与TNF-α、sIL-2R存在明显相关性，r值分别为0.677和0.778。IL-6与CD+8的相关系数为0.815，P<0.05。其它各因子间相关性不明显。
3 讨论
TNF-α和IL-6为单核巨噬细胞分泌的细胞因子，在机体各种炎性反应中发挥重要作用。重症肝炎时，TNF-α是引起肝细胞大量坏死的重要因素。TNF-α的增高和凝血酶原活动度、胆红素有关。在病毒感染的情况下，TNF可诱导一系列的炎症性细胞因子，包括IL-2R，IL-6的连锁反应，这些炎症因子可刺激体内产生内源性丝氨酸类蛋白酶，对肝细胞产生损伤。我们的研究结果显示：重症肝炎病人血中TNF-α，IL-6水平均升高，经Tα1治疗后，它们的活性降低，其水平也大致恢复正常。说明Tα1具有抗炎效应，能抑制TNF-α，IL-6等炎性细胞因子的活性，减轻肝脏损伤的程度。L-2R来源于淋巴细胞膜受体的细胞外段，是机体免疫系统激活的重要标志之一。肝炎患者肝细胞的损害是细胞毒性T淋巴细胞对受染肝细胞的清除作用所致，因此，检测sIL-2R有助于了解机体的T细胞免疫、肝细胞损害程度和免疫治疗评估。我们的实验资料表明治疗前sIL-2R明显升高，虽然治疗后其水平降低，但较正常对照组仍有明显差异。提示免疫治疗激活淋巴细胞，细胞因子的分泌受多方面的影响。IL-6可诱导淋巴细胞表达sIL-2R，两者之间存在明显相关性。
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IL-4是Th2细胞产生的具有多种生物学活性的细胞因子。体内外实验证实，IL-4可抑制单核巨噬细胞分泌的IL-1和TNF-α，而且促进IL-1受体拮抗剂的表达。IL-4还能抑制TNF-α，IL-6，IL-8等多种炎症介质的形成，具有显著抗炎作用。Fukuda等[1]检测肝组织内IL-4 mRNA表达时观察到，在慢性活动性肝炎缓解期常伴有IL-4 mRNA水平增高，提示IL-4与肝炎缓解有密切关系。国内有学者报道重症肝炎时IL-4水平与病情和预后有关[2]。我们的实验显示，重症肝炎病人治疗前IL-4水平低下，治疗后回升，表明IL-4可做为重症肝炎疗效观察的重要指标。
淋巴细胞膜表面白细胞分化抗原CD+4和CD+8在病毒性肝炎病人表现各异[3]。CD+8通过组织相关抗原Ⅰ型免疫反应导致肝细胞损伤[4]，此类损伤较CD+4介导的损伤更明显。重症肝炎时CD+8增高，CD+4降低，说明CD+8在重症肝炎时肝细胞大量坏死中起重要作用。治疗后病人外周血中淋巴细胞CD+8降低，CD+4升高，提示经Tα1免疫治疗能改变重症肝炎患者T细胞亚群的比例，减轻CD+8导致的肝细胞坏死程度。
, 百拇医药
细菌产生的内毒素是多种细胞因子的诱生剂，可刺激IL-1，IL-6，TNF-α的分泌[5]。内毒素通过TNF介导加重肝脏损伤。内毒素和TNF可作为激发剂诱导Schwrtzman反应，造成大量肝细胞损伤。重症肝炎时，网状内皮系统功能低下，不能清除来自肠道的内毒素，同时，由于机体抵抗力低下，容易招致细菌感染。因此，重症肝炎常产生高内毒素血症。
综上所述，重症肝炎病人CD+8数量增加，诱发组织相关抗原Ⅰ型免疫反应，血清内毒素水平增加，诱发IL-2R，IL-6等炎性因子连锁反应，造成大量肝细胞坏死。经免疫调节剂Tα1治疗后，CD+8数量减少，血清内毒素水平及TNF活性降低，从而减轻炎症反应。另外通过提高IL-4水平，抑制炎症性细胞因子对肝脏的损伤。
参考文献
[1]Fukuda R, Ishimuraa N, Nguyen TX, et al. The expression IL-2, IL-4 and interferon gam (IFN γ)mRNA using liver biopsis at different phase of acute exacerbaation of chronic hepatitis B. Clin Exp Immunol, 1995, 100: 446
, http://www.100md.com
[2]石裕明，张立煌，方梅林，等.IL-4对重症肝炎患者外周血单核细胞IL-1α表达调节的研究.中华传染病杂志，1998，16(3)：144
[3]张国良，黄自存，黄瑞芳，等.病毒肝炎患者免疫治疗与CD、TNF、sIL-2R的调控关系.实用医学杂志，1997，13(12)：783
[4]Ando K, Guidotti L, Wirth L, et al. Class-Irestricted cytetoxin lymphocytes are directly cytopathic for their target cell in vivo. J Immunology, 1994, 152(7):3425
[5]Sekiyama KD, Yoshiba M, Thomson AW, et al. Circulating proinflammaatory cytokines (IL-1R, TNF-α and IL-6) and IL-1 receptor antagonist (IL-1R α) in fuliminant hepatic failure. Clin Exp Immunol, 1994, 98: 71
(收稿日期：1999-07-17), http://www.100md.com