胰高血糖素和双丁酰环腺苷酸对HepG2细胞分泌载脂蛋白AⅠ、AⅡ、B100、CⅢ及E的影响
作者：刘皓 刘秉文 吴兆丰
单位：刘皓(华西医科大学载脂蛋白研究室， 四川省成都市 610041)；刘秉文(华西医科大学载脂蛋白研究室， 四川省成都市 610041)；吴兆丰(华西医科大学载脂蛋白研究室， 四川省成都市 610041)
关键词：HepG2细胞；胰高血糖素；双丁酰环腺苷酸；载脂蛋白
中国动脉硬化杂志000309[摘 要] 为了解胰高血糖素和双丁酰环腺苷酸在肝脏载脂蛋白代谢中的作用，以培养的人肝癌细胞系HepG2细胞为研究对象，采用“冻干浓缩培养液载脂蛋白测定法”，观察了胰高血糖素和双丁酰环腺苷酸对HepG2细胞分泌载脂蛋白AⅠ、AⅡ、CⅢ、B100及E的影响。结果表明，胰高血糖素浓度为4×10-7mol/L时，载脂蛋白AⅠ、AⅡ、B100及E的分泌分别减少47.7%、 54.1%、 32.7%和33.2%(P<0.01),载脂蛋白CⅢ的分泌增加89.1%(P<0.01)；双丁酰环腺苷酸的浓度为1×10-3mol/L时，载脂蛋白AⅠ、B100和E的分泌分别减少12.3%、 24.9%和16.1%(P<0.01)，载脂蛋白AⅡ和CⅢ的分泌分别增加66.1%和142.6%(P<0.01)。胰高血糖素和双丁酰环腺苷酸对HepG2细胞载脂蛋白分泌的影响基本一致。
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[中图分类号] Q513 [文献标识码] A
[文章编号] 1007-3949(2000)-03-0221-05
Effects of Glucagon and Dibutyryl cAMP on Secretion of Apolipoproteins AⅠ，AⅡ，B100，CⅢ and E by Cultured HepG2 Cells
LIU Hao，LIU Bing-Wen，WU Zhao-Feng
(Apolipoprotein Research Unit, West China University of Medical Science, Chengdu 610041, China)
ABSTRACT Aim To study the effects of glucagon, dibutyryl cAMP on secretion of apolipoproteins AⅠ，AⅡ，CⅢ，B100 and E by HepG2 cells. Methods The apolipoprotiens contents in culture media were measured by radioimmuodiffusion assay (RID) kits developed by authors' research laboratory. 20-fold lyophilizely condensed culture media were used for the assays. Results When the concentration of glucagon is 4×10-7mol/L in culture media, the secretion of apoAⅠ,AⅡ,B100 and E decreased 47.7%， 54.1%， 32.7% and 33.2%(P<0.01) respectively, while the secreation of apoCⅢ increased 89.1%(P<0.01); When the concentration of dibutyryl cAMP is 1×10-3mol/L in culture media, the secretion of apoAⅠ,B100 and E decreased 12.3%， 24.9% and 16.1% (P<0.01)respectively, while the secretion of apoAⅡ and CⅢ increased 66.1% and 142.6%(P<0.01). Conclusion Glucagon and dbcAMP had similar effects on the secretion of apolipoproteins by cultured HepG2 cells.
, 百拇医药
MeSH HepG2 Cells; Glucagon; Dibutyryl cAMP; Apolipoproteins
刘秉文等[1]从中国人膳食以高糖低脂为特点出发，对内源性高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia, HTG)发病机制进行了研究，设想高糖膳食可能是我国HTG发病的重要原因。在大鼠中的研究发现，高淀粉膳食诱发血胰岛素升高的同时，血浆cAMP下降，肝载脂蛋白(apolipoprotein )AI及CⅡ基因表达减少[2]，肠载脂蛋白CⅢ基因表达增加[3]，从而引起血浆中相应载脂蛋白改变。因此推测血浆载脂蛋白CⅡ含量的降低及CⅢ含量的升高可通过抑制脂蛋白脂酶的活性和/或肝脂蛋白受体功能而抑制极低密度脂蛋白的降解，导致HTG的形成。其后，王洪敏等[4]发现胰岛素能促进HepG2细胞分泌载脂蛋白CⅢ，这一结果亦支持上述设想。胰岛素、胰高血糖素和cAMP三者在体内的作用密切相关，但目前有关胰高血糖素对肝脏载脂蛋白代谢影响的报道仅限于载脂蛋白AⅠ和B100，对载脂蛋白AⅡ、CⅢ及E的影响则未见报道。因此我们对胰高血糖素和双丁酰环腺苷酸(dibutyryl cAMP， dbcAMP)对培养HepG2细胞分泌载脂蛋白AⅠ、AⅡ、B100、CⅢ及E的影响,进行了较为全面的观察。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
人肝癌细胞系HepG2细胞由华西医科大学免疫教研室章崇杰教授馈赠;RPMI-1640培养基(Gibco)；L-谷氨酰胺(EMK进口分装)；新生小牛血清(成都华西生化制品厂)；青霉素G钠、硫酸链霉素(华北制药厂)；胰蛋白酶(1∶250，Difco进口分装)；牛胰岛素(Sigma)；胰高血糖素(Gibco)；双丁酰环腺苷酸(Sigma)；载脂蛋白试剂盒(载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白AⅡ、载脂蛋白B100、载脂蛋白CⅢ、载脂蛋白E)为华西医科大学载脂蛋白研究室研制；其它试剂均为国产分析纯。二氧化碳孵箱(Queue, USA)。
1.2 人肝癌细胞系HepG2的培养
复苏的HepG2细胞种入100 mL培养瓶中，其中加入约5 mL完全培养基(90%RPMI1640、10%新生小牛血清、4 mmol/L谷氨酰胺、100 mg/L硫酸链霉素和1.0×105 u/L青霉素G钠)，水平静置于二氧化碳孵箱内，在5%CO2、95%空气和37℃下静置培养。2～3天更换一次新鲜培养液，6～7天按1∶3传代一次。
, 百拇医药
1.3 HepG2细胞培养液的收集和冻干
取约80%单层铺满的HepG2细胞，用pH7.4的PBS液洗涤三次，随机分组(每组各含6瓶细胞)，按组别加入不同的实验培养基(均不含小牛血清)5 mL。分别培养一定的时间后，收集细胞培养液离心，准确吸取1.5 mL上清液三份，冻干。
1.3.1 加入不同浓度的胰高血糖素(或dbcAMP) 将细胞随机分成5组，对照组中不加胰高血糖素(或dbcAMP)，其余各组均加入不同浓度的胰高血糖素(或dbcAMP)，48 h后终止培养。
1.3.2 37℃培养不同时间的影响 将细胞随机分成4大组，其中每大组又分为对照组和实验组，加入实验培养基(不含小牛血清)。对照组中不加胰高血糖素(或dbcAMP)，实验组中均加入同一浓度的胰高血糖素(或dbcAMP)，使其终浓度为4×10-7mol/L(或1×10-3mol/L)。每大组分别培养5 h、16 h、24 h和48 h。
, 百拇医药
1.4 冻干浓缩培养液中载脂蛋白的测定
准确加入样品稀释液75 μL，使冻干的样品重新溶解。经此操作，样品被浓缩20倍。用本室研制的RID试剂盒[5]测定样品中载脂蛋白AⅠ、AⅡ、CⅢ、B100及E的含量。
1.5 细胞总蛋白的测定
培养瓶内贴壁的HepG2细胞以0.1 mol/L的NaOH 6.0 mL混匀,室温放置2 h。按改良Lowry法[6]测定细胞总蛋白。
2 结 果
2.1 不同浓度胰高血糖素对HepG2细胞载脂蛋白分泌的影响
由表1(Table 1)可见，胰高血糖素对HepG2细胞载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白AⅡ、载脂蛋白B100及载脂蛋白E的分泌均有抑制作用，而对载脂蛋白CⅢ的分泌则有促进作用，且这种作用随胰高血糖素浓度的增加而增强。在本实验条件下，当胰高血糖素浓度为4×10-7mol/L时，其使载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白AⅡ、载脂蛋白B100及载脂蛋白E的分泌分别减少47.7%、54.1%、32.7%和33.2%(P<0.01),使载脂蛋白CⅢ的分泌增加89.1%(P<0.01)。
, 百拇医药
表1 不同浓度的胰高血糖素(mol/L)对HepG2细胞载脂蛋白AⅠ、 AⅡ、 B100、 CⅢ 和 E分泌的影响
Table 1 Effect of glucagon (mol/L) on secretion of apolipoproteinAⅠ, AⅡ, B100, CⅢ and E by cultured HepG2 cell(μg/g cell protein,
±s, n=6) Groups
ApoAⅠ
ApoAⅡ
ApoB100
ApoCⅢ
ApoE
, http://www.100md.com
Control
1 182±59
196±9
2 343±46
110±3
238±5
4×10-10
946±69a
195±18
1 878±65a
104±8
, http://www.100md.com 212±9a
4×10-9
930±59a
171±7a
1 737±84a
122±5a
187±13a
4×10-8
693±25a
142±6a
, 百拇医药
1 617±42a
162±5a
168±9a
4×10-7
618±22a
90±6a
1 577±47a
208±9a
159±7a
a: P<0.01, compared with control group.
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2.2 胰高血糖素培养不同时间对HepG2细胞载脂蛋白分泌的影响
由表2(Table 2)可见，对照组和实验组中，HepG2细胞各载脂蛋白的分泌量均随培养时间的延长而增加。与对照组相比，HepG2细胞在分别培养5、16、24和48 h后，实验组中载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白AⅡ、载脂蛋白B100及载脂蛋白E分泌的增加程度逐渐减少，而载脂蛋白CⅢ分泌的增加程度逐渐增加。48 h后，载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白AⅡ、载脂蛋白B100及载脂蛋白E的分泌分别减少38.8%、53.4%、31.1%和47.5%(P<0.01)，而载脂蛋白CⅢ的分泌增加88.4%(P<0.01)。
表2 胰高血糖素培养不同时间对HepG2细胞载脂蛋白AⅠ、 AⅡ、 B100、 CⅢ 和 E分泌的影响
Table 2 Time course of effect of glucagon on secretion of apolipoproteinAⅠ， AⅡ， B100， CⅢ and E by cultured HepG2 cell (μg/g cell protein,±s, n=6) Groups
, 百拇医药
0 h
5 h
16 h
24 h
48 h
ApoAI
control
exp.
0
0
0
0
362±15
, 百拇医药
343±10a
471±30
430±21b
1 109±76
679±25b
ApoAⅡ
control
exp.
0
0
0
0
, 百拇医药
68±5
64±2
107±12
84±2b
223±25
104±12b
ApoCⅢ
control
exp.
0
0
65±5
, 百拇医药
85±6b
87±8
124±4b
98±11
162±12b
121±17
228±32b
ApoB100
control
exp.
0
0
, 百拇医药
1 279±55
1 124±72b
1 353±82
1 282±63b
1 481±74
1 380±61b
2 227±115
1 535±90b
ApoE
control
exp.
, 百拇医药
0
0
0
0
77±6
72±2
107±15
96±7
259±36
136±14b
a: P<0.05, b: P<0.01, compared with control group.
2.3 不同浓度双丁酰环腺苷酸对HepG2细胞载脂蛋白分泌的影响
, 百拇医药
由表3(Table 3)可知，dbcAMP对HepG2细胞载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白B100和载脂蛋白E的分泌有抑制作用，对载脂蛋白AⅡ和载脂蛋白CⅢ的分泌有促进作用，且这种作用随dbcAMP浓度的增加而增强。在本实验条件下，当培养液中dbcAMP的浓度为1×10-3mol/L时，载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白B100和载脂蛋白E的分泌分别减少12.3%、24.9%和16.1%(P<0.01)，载脂蛋白AⅡ和载脂蛋白CⅢ的分泌分别增加66.1%和142.6%(P<0.01)。
表3 不同浓度的双丁酰环腺苷酸(mol/L)对HepG2细胞载脂蛋白AⅠ、 AⅡ、 B100、 CⅢ 和 E分泌的影响
Table 3 Effect of dbcAMP(mol/L) on secretion of apolipoproteinAⅠ， AⅡ， B100， C and E by cultured HepG2 cell(μg/g cell protein,±s, n=6) Groups
, 百拇医药
ApoAⅠ
ApoAⅡ
ApoB100
ApoCⅢ
ApoE
Control
803±26
174±10
2 535±98
108±6
211±8
1×10-6
, http://www.100md.com
809±39
227±11b
2 526±61
120±11a
219±5
1×10-5
813±30
240±15b
2 379±56b
162±7b
193±8b
, 百拇医药
1×10-4
778±25
284±10b
2 169±134b
200±2b
191±2b
1×10-3
704±17b
289±7b
1 905±97b
, 百拇医药
262±11b
177±5b
a: P<0.05, b: P<0.01, compared with control group.
2.4 双丁酰环腺苷酸培养不同时间对HepG2细胞载脂蛋白分泌的影响
由表4(Table 4)可见，对照组和实验组中，HepG2细胞各载脂蛋白的分泌量均随培养时间的延长而增加。与对照组相比，HepG2细胞在分别培养5、16、24和48 h后，实验组中载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白B100及载脂蛋白E的分泌逐渐减少，载脂蛋白AⅡ和载脂蛋白CⅢ的分泌逐渐增加。48 h后，载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白B100及载脂蛋白E的分泌分别减少17.1%、24.9%和20.7%(P<0.01)，而载脂蛋白AⅡ和载脂蛋白CⅢ的分泌分别增加57.4%和98.5%(P<0.01)。表4 双丁酰环腺苷酸培养不同时间对HepG2细胞载脂蛋白AⅠ、 AⅡ、 B100、 CⅢ 和 E分泌的影响
, 百拇医药
Table 4 Time course of effect of glucagon on the secretion of apolipoproteinAⅠ， AⅡ， B100， CⅢ and E by culturedHepG2 cell (μg/g cell protein,±s, n=6) Groups
0 h
5 h
16 h
24 h
48 h
ApoAI
Control
, 百拇医药
exp.
0
0
0
0
711±27
633±14b
817±44
707±31b
908±52
750±18b
ApoAII
, 百拇医药
Control
exp.
0
0
0
0
113±5
174±8b
134±3
195±7b
190±14
299±28b
, 百拇医药
ApoCIII
Control
exp.
0
0
0
0
69±5
91±2b
102±11
143±16b
131±12
, http://www.100md.com 259±18b
ApoB100
Control
exp.
0
0
705±20
671±14a
1 632±73
1 552±54b
1 932±64
1 859±82b
, http://www.100md.com
2 660±143
1 998±138b
ApoE
Control
exp.
0
0
0
0
118±6
114±4
156±17
139±14
, 百拇医药
232±24
184±15b
a: P<0.05, b: P<0.01, compared with control group.
3 讨 论
本研究观察了胰高血糖素和双丁酰环腺苷酸对人肝癌细胞系HepG2分泌5种载脂蛋白的影响，发现胰高血糖素和dbcAMP均对HepG2细胞载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白B100及载脂蛋白E的分泌有抑制作用，而对载脂蛋白CⅢ的分泌则有促进作用，且这种作用随胰高血糖素和dbcAMP浓度的增加而增强。大量研究已证实cAMP是胰高血糖素等肽类激素的第二信使；Joan等[7]在研究胰高血糖素和cAMP对原代培养的成年大鼠肝细胞DNA合成的影响时也发现，胰高血糖素的作用可被cAMP所“复制”。胰高血糖素对HepG2细胞载脂蛋白分泌的影响是否也通过cAMP来实现，值得进一步的研究。本研究结果表明，胰高血糖素可抑制HepG2细胞载脂蛋白AⅠ和载脂蛋白B100的分泌。以往在大鼠肝细胞中的实验发现，胰高血糖素可抑制载脂蛋白AⅠ[8]和极低密度脂蛋白[9]的分泌；活体实验也证实，胰高血糖素可抑制肝脏极低密度脂蛋白的合成和分泌[10]。其主要原因是胰高血糖素抑制了极低密度脂蛋白载脂蛋白B100的合成，后者是极低密度脂蛋白合成的限速步骤[10]。显然，本研究结果与从大鼠肝细胞中所得的结果一致。
, 百拇医药
本研究还表明，胰高血糖素和dbcAMP均可抑制HepG2细胞载脂蛋白E的分泌。1996年Andreani等[11]报道，在载脂蛋白E启动子近端有一正性cAMP反应元件，在载脂蛋白E基因-614～+804区域有多个负性调节和正性调节元件，它们对载脂蛋白E基因转录总的影响是抑制性的，dbcAMP可通过抑制载脂蛋白E基因转录，使载脂蛋白E mRNA水平下降，从而抑制载脂蛋白E的分泌。我们的结果与之相符。本研究初期，作者也曾观察了胰岛素对HepG2细胞载脂蛋白分泌的影响，其结果与王洪敏等[4]的结果基本一致。一般认为，胰岛素和胰高血糖素是体内两种相互拮抗的激素。但从我们的结果看来，这两种激素在对HepG2细胞分泌载脂蛋白的影响上，未见彼此互相拮抗的作用。这和国外报道胰岛素、胰高血糖素及dbcAMP对载脂蛋白AI[4、8、12]、载脂蛋白B100[4、9、12]和载脂蛋白E[4、11、12]的分泌均有抑制作用一致，他们也未观察到这两种激素对肝细胞这几种载脂蛋白的分泌有互相拮抗的作用。
, http://www.100md.com
本研究还表明胰高血糖素和dbcAMP均可显著促进HepG2细胞载脂蛋白CⅢ的分泌，迄今尚未见国内外有类似报道。本室以往的研究发现，内源性高甘油三酯血症患者血浆胰岛素水平升高的同时，常伴有血浆载脂蛋白CⅢ水平升高。曾设想HTG患者血载脂蛋白CⅢ水平升高可能与胰岛素促进肝脏合成及分泌载脂蛋白CⅢ增加有关[1]。在本研究中，胰高血糖素及dbcAMP也显著刺激HepG2细胞合成及分泌载脂蛋白CⅢ，由此可见除胰岛素外，胰高血糖素也刺激肝细胞载脂蛋白CⅢ的分泌。因此胰高血糖素在HTG中的作用值得重视。
[作者简介] 刘皓，女，1973年出生，华西医科大学在读博士研究生。
参考文献
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(此文2000-03-21收到，2000-06-10修回), 百拇医药
单位：刘皓(华西医科大学载脂蛋白研究室， 四川省成都市 610041)；刘秉文(华西医科大学载脂蛋白研究室， 四川省成都市 610041)；吴兆丰(华西医科大学载脂蛋白研究室， 四川省成都市 610041)
关键词：HepG2细胞；胰高血糖素；双丁酰环腺苷酸；载脂蛋白
中国动脉硬化杂志000309[摘 要] 为了解胰高血糖素和双丁酰环腺苷酸在肝脏载脂蛋白代谢中的作用，以培养的人肝癌细胞系HepG2细胞为研究对象，采用“冻干浓缩培养液载脂蛋白测定法”，观察了胰高血糖素和双丁酰环腺苷酸对HepG2细胞分泌载脂蛋白AⅠ、AⅡ、CⅢ、B100及E的影响。结果表明，胰高血糖素浓度为4×10-7mol/L时，载脂蛋白AⅠ、AⅡ、B100及E的分泌分别减少47.7%、 54.1%、 32.7%和33.2%(P<0.01),载脂蛋白CⅢ的分泌增加89.1%(P<0.01)；双丁酰环腺苷酸的浓度为1×10-3mol/L时，载脂蛋白AⅠ、B100和E的分泌分别减少12.3%、 24.9%和16.1%(P<0.01)，载脂蛋白AⅡ和CⅢ的分泌分别增加66.1%和142.6%(P<0.01)。胰高血糖素和双丁酰环腺苷酸对HepG2细胞载脂蛋白分泌的影响基本一致。
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[中图分类号] Q513 [文献标识码] A
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Effects of Glucagon and Dibutyryl cAMP on Secretion of Apolipoproteins AⅠ，AⅡ，B100，CⅢ and E by Cultured HepG2 Cells
LIU Hao，LIU Bing-Wen，WU Zhao-Feng
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ABSTRACT Aim To study the effects of glucagon, dibutyryl cAMP on secretion of apolipoproteins AⅠ，AⅡ，CⅢ，B100 and E by HepG2 cells. Methods The apolipoprotiens contents in culture media were measured by radioimmuodiffusion assay (RID) kits developed by authors' research laboratory. 20-fold lyophilizely condensed culture media were used for the assays. Results When the concentration of glucagon is 4×10-7mol/L in culture media, the secretion of apoAⅠ,AⅡ,B100 and E decreased 47.7%， 54.1%， 32.7% and 33.2%(P<0.01) respectively, while the secreation of apoCⅢ increased 89.1%(P<0.01); When the concentration of dibutyryl cAMP is 1×10-3mol/L in culture media, the secretion of apoAⅠ,B100 and E decreased 12.3%， 24.9% and 16.1% (P<0.01)respectively, while the secretion of apoAⅡ and CⅢ increased 66.1% and 142.6%(P<0.01). Conclusion Glucagon and dbcAMP had similar effects on the secretion of apolipoproteins by cultured HepG2 cells.
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MeSH HepG2 Cells; Glucagon; Dibutyryl cAMP; Apolipoproteins
刘秉文等[1]从中国人膳食以高糖低脂为特点出发，对内源性高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia, HTG)发病机制进行了研究，设想高糖膳食可能是我国HTG发病的重要原因。在大鼠中的研究发现，高淀粉膳食诱发血胰岛素升高的同时，血浆cAMP下降，肝载脂蛋白(apolipoprotein )AI及CⅡ基因表达减少[2]，肠载脂蛋白CⅢ基因表达增加[3]，从而引起血浆中相应载脂蛋白改变。因此推测血浆载脂蛋白CⅡ含量的降低及CⅢ含量的升高可通过抑制脂蛋白脂酶的活性和/或肝脂蛋白受体功能而抑制极低密度脂蛋白的降解，导致HTG的形成。其后，王洪敏等[4]发现胰岛素能促进HepG2细胞分泌载脂蛋白CⅢ，这一结果亦支持上述设想。胰岛素、胰高血糖素和cAMP三者在体内的作用密切相关，但目前有关胰高血糖素对肝脏载脂蛋白代谢影响的报道仅限于载脂蛋白AⅠ和B100，对载脂蛋白AⅡ、CⅢ及E的影响则未见报道。因此我们对胰高血糖素和双丁酰环腺苷酸(dibutyryl cAMP， dbcAMP)对培养HepG2细胞分泌载脂蛋白AⅠ、AⅡ、B100、CⅢ及E的影响,进行了较为全面的观察。
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1 材料与方法
1.1 材料
人肝癌细胞系HepG2细胞由华西医科大学免疫教研室章崇杰教授馈赠;RPMI-1640培养基(Gibco)；L-谷氨酰胺(EMK进口分装)；新生小牛血清(成都华西生化制品厂)；青霉素G钠、硫酸链霉素(华北制药厂)；胰蛋白酶(1∶250，Difco进口分装)；牛胰岛素(Sigma)；胰高血糖素(Gibco)；双丁酰环腺苷酸(Sigma)；载脂蛋白试剂盒(载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白AⅡ、载脂蛋白B100、载脂蛋白CⅢ、载脂蛋白E)为华西医科大学载脂蛋白研究室研制；其它试剂均为国产分析纯。二氧化碳孵箱(Queue, USA)。
1.2 人肝癌细胞系HepG2的培养
复苏的HepG2细胞种入100 mL培养瓶中，其中加入约5 mL完全培养基(90%RPMI1640、10%新生小牛血清、4 mmol/L谷氨酰胺、100 mg/L硫酸链霉素和1.0×105 u/L青霉素G钠)，水平静置于二氧化碳孵箱内，在5%CO2、95%空气和37℃下静置培养。2～3天更换一次新鲜培养液，6～7天按1∶3传代一次。
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1.3 HepG2细胞培养液的收集和冻干
取约80%单层铺满的HepG2细胞，用pH7.4的PBS液洗涤三次，随机分组(每组各含6瓶细胞)，按组别加入不同的实验培养基(均不含小牛血清)5 mL。分别培养一定的时间后，收集细胞培养液离心，准确吸取1.5 mL上清液三份，冻干。
1.3.1 加入不同浓度的胰高血糖素(或dbcAMP) 将细胞随机分成5组，对照组中不加胰高血糖素(或dbcAMP)，其余各组均加入不同浓度的胰高血糖素(或dbcAMP)，48 h后终止培养。
1.3.2 37℃培养不同时间的影响 将细胞随机分成4大组，其中每大组又分为对照组和实验组，加入实验培养基(不含小牛血清)。对照组中不加胰高血糖素(或dbcAMP)，实验组中均加入同一浓度的胰高血糖素(或dbcAMP)，使其终浓度为4×10-7mol/L(或1×10-3mol/L)。每大组分别培养5 h、16 h、24 h和48 h。
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1.4 冻干浓缩培养液中载脂蛋白的测定
准确加入样品稀释液75 μL，使冻干的样品重新溶解。经此操作，样品被浓缩20倍。用本室研制的RID试剂盒[5]测定样品中载脂蛋白AⅠ、AⅡ、CⅢ、B100及E的含量。
1.5 细胞总蛋白的测定
培养瓶内贴壁的HepG2细胞以0.1 mol/L的NaOH 6.0 mL混匀,室温放置2 h。按改良Lowry法[6]测定细胞总蛋白。
2 结 果
2.1 不同浓度胰高血糖素对HepG2细胞载脂蛋白分泌的影响
由表1(Table 1)可见，胰高血糖素对HepG2细胞载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白AⅡ、载脂蛋白B100及载脂蛋白E的分泌均有抑制作用，而对载脂蛋白CⅢ的分泌则有促进作用，且这种作用随胰高血糖素浓度的增加而增强。在本实验条件下，当胰高血糖素浓度为4×10-7mol/L时，其使载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白AⅡ、载脂蛋白B100及载脂蛋白E的分泌分别减少47.7%、54.1%、32.7%和33.2%(P<0.01),使载脂蛋白CⅢ的分泌增加89.1%(P<0.01)。
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表1 不同浓度的胰高血糖素(mol/L)对HepG2细胞载脂蛋白AⅠ、 AⅡ、 B100、 CⅢ 和 E分泌的影响
Table 1 Effect of glucagon (mol/L) on secretion of apolipoproteinAⅠ, AⅡ, B100, CⅢ and E by cultured HepG2 cell(μg/g cell protein,
±s, n=6) GroupsApoAⅠ
ApoAⅡ
ApoB100
ApoCⅢ
ApoE
, http://www.100md.com
Control
1 182±59
196±9
2 343±46
110±3
238±5
4×10-10
946±69a
195±18
1 878±65a
104±8
, http://www.100md.com 212±9a
4×10-9
930±59a
171±7a
1 737±84a
122±5a
187±13a
4×10-8
693±25a
142±6a
, 百拇医药
1 617±42a
162±5a
168±9a
4×10-7
618±22a
90±6a
1 577±47a
208±9a
159±7a
a: P<0.01, compared with control group.
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2.2 胰高血糖素培养不同时间对HepG2细胞载脂蛋白分泌的影响
由表2(Table 2)可见，对照组和实验组中，HepG2细胞各载脂蛋白的分泌量均随培养时间的延长而增加。与对照组相比，HepG2细胞在分别培养5、16、24和48 h后，实验组中载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白AⅡ、载脂蛋白B100及载脂蛋白E分泌的增加程度逐渐减少，而载脂蛋白CⅢ分泌的增加程度逐渐增加。48 h后，载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白AⅡ、载脂蛋白B100及载脂蛋白E的分泌分别减少38.8%、53.4%、31.1%和47.5%(P<0.01)，而载脂蛋白CⅢ的分泌增加88.4%(P<0.01)。
表2 胰高血糖素培养不同时间对HepG2细胞载脂蛋白AⅠ、 AⅡ、 B100、 CⅢ 和 E分泌的影响
Table 2 Time course of effect of glucagon on secretion of apolipoproteinAⅠ， AⅡ， B100， CⅢ and E by cultured HepG2 cell (μg/g cell protein,
±s, n=6) Groups, 百拇医药
0 h
5 h
16 h
24 h
48 h
ApoAI
control
exp.
0
0
0
0
362±15
, 百拇医药
343±10a
471±30
430±21b
1 109±76
679±25b
ApoAⅡ
control
exp.
0
0
0
0
, 百拇医药
68±5
64±2
107±12
84±2b
223±25
104±12b
ApoCⅢ
control
exp.
0
0
65±5
, 百拇医药
85±6b
87±8
124±4b
98±11
162±12b
121±17
228±32b
ApoB100
control
exp.
0
0
, 百拇医药
1 279±55
1 124±72b
1 353±82
1 282±63b
1 481±74
1 380±61b
2 227±115
1 535±90b
ApoE
control
exp.
, 百拇医药
0
0
0
0
77±6
72±2
107±15
96±7
259±36
136±14b
a: P<0.05, b: P<0.01, compared with control group.
2.3 不同浓度双丁酰环腺苷酸对HepG2细胞载脂蛋白分泌的影响
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由表3(Table 3)可知，dbcAMP对HepG2细胞载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白B100和载脂蛋白E的分泌有抑制作用，对载脂蛋白AⅡ和载脂蛋白CⅢ的分泌有促进作用，且这种作用随dbcAMP浓度的增加而增强。在本实验条件下，当培养液中dbcAMP的浓度为1×10-3mol/L时，载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白B100和载脂蛋白E的分泌分别减少12.3%、24.9%和16.1%(P<0.01)，载脂蛋白AⅡ和载脂蛋白CⅢ的分泌分别增加66.1%和142.6%(P<0.01)。
表3 不同浓度的双丁酰环腺苷酸(mol/L)对HepG2细胞载脂蛋白AⅠ、 AⅡ、 B100、 CⅢ 和 E分泌的影响
Table 3 Effect of dbcAMP(mol/L) on secretion of apolipoproteinAⅠ， AⅡ， B100， C and E by cultured HepG2 cell(μg/g cell protein,
±s, n=6) Groups, 百拇医药
ApoAⅠ
ApoAⅡ
ApoB100
ApoCⅢ
ApoE
Control
803±26
174±10
2 535±98
108±6
211±8
1×10-6
, http://www.100md.com
809±39
227±11b
2 526±61
120±11a
219±5
1×10-5
813±30
240±15b
2 379±56b
162±7b
193±8b
, 百拇医药
1×10-4
778±25
284±10b
2 169±134b
200±2b
191±2b
1×10-3
704±17b
289±7b
1 905±97b
, 百拇医药
262±11b
177±5b
a: P<0.05, b: P<0.01, compared with control group.
2.4 双丁酰环腺苷酸培养不同时间对HepG2细胞载脂蛋白分泌的影响
由表4(Table 4)可见，对照组和实验组中，HepG2细胞各载脂蛋白的分泌量均随培养时间的延长而增加。与对照组相比，HepG2细胞在分别培养5、16、24和48 h后，实验组中载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白B100及载脂蛋白E的分泌逐渐减少，载脂蛋白AⅡ和载脂蛋白CⅢ的分泌逐渐增加。48 h后，载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白B100及载脂蛋白E的分泌分别减少17.1%、24.9%和20.7%(P<0.01)，而载脂蛋白AⅡ和载脂蛋白CⅢ的分泌分别增加57.4%和98.5%(P<0.01)。表4 双丁酰环腺苷酸培养不同时间对HepG2细胞载脂蛋白AⅠ、 AⅡ、 B100、 CⅢ 和 E分泌的影响
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Table 4 Time course of effect of glucagon on the secretion of apolipoproteinAⅠ， AⅡ， B100， CⅢ and E by culturedHepG2 cell (μg/g cell protein,
±s, n=6) Groups0 h
5 h
16 h
24 h
48 h
ApoAI
Control
, 百拇医药
exp.
0
0
0
0
711±27
633±14b
817±44
707±31b
908±52
750±18b
ApoAII
, 百拇医药
Control
exp.
0
0
0
0
113±5
174±8b
134±3
195±7b
190±14
299±28b
, 百拇医药
ApoCIII
Control
exp.
0
0
0
0
69±5
91±2b
102±11
143±16b
131±12
, http://www.100md.com 259±18b
ApoB100
Control
exp.
0
0
705±20
671±14a
1 632±73
1 552±54b
1 932±64
1 859±82b
, http://www.100md.com
2 660±143
1 998±138b
ApoE
Control
exp.
0
0
0
0
118±6
114±4
156±17
139±14
, 百拇医药
232±24
184±15b
a: P<0.05, b: P<0.01, compared with control group.
3 讨 论
本研究观察了胰高血糖素和双丁酰环腺苷酸对人肝癌细胞系HepG2分泌5种载脂蛋白的影响，发现胰高血糖素和dbcAMP均对HepG2细胞载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白B100及载脂蛋白E的分泌有抑制作用，而对载脂蛋白CⅢ的分泌则有促进作用，且这种作用随胰高血糖素和dbcAMP浓度的增加而增强。大量研究已证实cAMP是胰高血糖素等肽类激素的第二信使；Joan等[7]在研究胰高血糖素和cAMP对原代培养的成年大鼠肝细胞DNA合成的影响时也发现，胰高血糖素的作用可被cAMP所“复制”。胰高血糖素对HepG2细胞载脂蛋白分泌的影响是否也通过cAMP来实现，值得进一步的研究。本研究结果表明，胰高血糖素可抑制HepG2细胞载脂蛋白AⅠ和载脂蛋白B100的分泌。以往在大鼠肝细胞中的实验发现，胰高血糖素可抑制载脂蛋白AⅠ[8]和极低密度脂蛋白[9]的分泌；活体实验也证实，胰高血糖素可抑制肝脏极低密度脂蛋白的合成和分泌[10]。其主要原因是胰高血糖素抑制了极低密度脂蛋白载脂蛋白B100的合成，后者是极低密度脂蛋白合成的限速步骤[10]。显然，本研究结果与从大鼠肝细胞中所得的结果一致。
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本研究还表明，胰高血糖素和dbcAMP均可抑制HepG2细胞载脂蛋白E的分泌。1996年Andreani等[11]报道，在载脂蛋白E启动子近端有一正性cAMP反应元件，在载脂蛋白E基因-614～+804区域有多个负性调节和正性调节元件，它们对载脂蛋白E基因转录总的影响是抑制性的，dbcAMP可通过抑制载脂蛋白E基因转录，使载脂蛋白E mRNA水平下降，从而抑制载脂蛋白E的分泌。我们的结果与之相符。本研究初期，作者也曾观察了胰岛素对HepG2细胞载脂蛋白分泌的影响，其结果与王洪敏等[4]的结果基本一致。一般认为，胰岛素和胰高血糖素是体内两种相互拮抗的激素。但从我们的结果看来，这两种激素在对HepG2细胞分泌载脂蛋白的影响上，未见彼此互相拮抗的作用。这和国外报道胰岛素、胰高血糖素及dbcAMP对载脂蛋白AI[4、8、12]、载脂蛋白B100[4、9、12]和载脂蛋白E[4、11、12]的分泌均有抑制作用一致，他们也未观察到这两种激素对肝细胞这几种载脂蛋白的分泌有互相拮抗的作用。
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本研究还表明胰高血糖素和dbcAMP均可显著促进HepG2细胞载脂蛋白CⅢ的分泌，迄今尚未见国内外有类似报道。本室以往的研究发现，内源性高甘油三酯血症患者血浆胰岛素水平升高的同时，常伴有血浆载脂蛋白CⅢ水平升高。曾设想HTG患者血载脂蛋白CⅢ水平升高可能与胰岛素促进肝脏合成及分泌载脂蛋白CⅢ增加有关[1]。在本研究中，胰高血糖素及dbcAMP也显著刺激HepG2细胞合成及分泌载脂蛋白CⅢ，由此可见除胰岛素外，胰高血糖素也刺激肝细胞载脂蛋白CⅢ的分泌。因此胰高血糖素在HTG中的作用值得重视。
[作者简介] 刘皓，女，1973年出生，华西医科大学在读博士研究生。
参考文献
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(此文2000-03-21收到，2000-06-10修回), 百拇医药