碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素6促进大鼠血管平滑肌细胞增殖的协同作用
作者：潘晓宏 单江 罗建红
单位：潘晓宏(浙江大学医学院附属第二医院心内科， 浙江省杭州市 310009)；单江(浙江大学医学院附属第二医院心内科， 浙江省杭州市 310009)；罗建红(浙江大学医学院附属第二医院医学分子生物学实验室， 浙江省杭州市 310009)
关键词：成纤维细胞生长因子, 碱性；白细胞介素6；肌,平滑；细胞增殖；协同作用；动脉粥样硬化
中国动脉硬化杂志000312[摘 要] 为观察碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素6促进血管平滑肌细胞增殖的协同作用，采用大鼠主动脉贴块法培养血管平滑肌细胞，用5-溴-2-脱氧尿嘧啶掺入法和细胞计数法观察碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素6对平滑肌细胞增殖的影响。结果发现， 0～10.0 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子和0～100 μg/L白细胞介素6能促进平滑肌细胞增殖，且呈剂量依赖性，1.0 μg/L碱性成纤维细胞生长因子和1.0 μg/L白细胞介素6促进细胞增殖，且48 h内呈时效依赖性，作用高峰在24 h，两者合用促进细胞增殖作用大于两者单用作用之和，呈协同作用。
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[中图分类号] R364.3 [文献标识码] A
[文章编号] 1007-3949(2000)-03-0233-04
The Synergistic Effect of Basic Fibroblast Growth Factor and Interleukin-6 on Rat Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation
PAN Xiao-Hong，SHAN Jiang
(Cardiovascular Department, Second Affiliated Hospital of Medicine College, Zhejiang University, Hangzhou 310009, China)
, 百拇医药 LUO Jian-Hong
(Lab of Medical Molecular Biology, Medicine College, Zhejiang University, Hangzhou 310009, China)
ABSTRACT Aim To observe the synergistic effect of basic fibroblast growth factor and interleukin-6 on vascular smooth muscle cells proliferation. Methods BrdU incorporation and cell counting method were adopted to observe the effects of basic fibroblast growth factor and interleukin-6 on the proliferation of rat aortic cultured smooth muscle cells. Results 0～10.0 μg/L basic fibroblast growth factor and 0～100 μg/L interleukin-6 were able to promote smooth muscle cells proliferation separately, and synergistically in combination in dose- and time-dependent manner. The pro-proliferation effect reached climax at 24 hours. Conclusion Basic fibroblast growth factor and interleukin-6 had synergistic effect on vascular smooth muscle cells proliferation.
, 百拇医药
MeSH Fibroblast Growth Factor, Basic； Interleukin-6； Muscle, Smooth； Cell Division； Cooperative Behavior； Atherosclerosis
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)增殖是动脉粥样硬化、经皮冠状动脉腔内球囊成形术后再狭窄、心脏搭桥术和心脏移植血管吻合口再狭窄等多种心血管疾病的病理基础。病变局部内皮细胞、VSMC、局部浸润的T淋巴细胞、血小板和巨噬细胞合成分泌的各种生长因子、细胞因子和血管活性物质等均能影响VSMC增殖[1]。血管损伤后的VSMC增殖不是某一因子的结果，而是众多因子通过极其复杂的交谈作用网络共同发挥作用的[1,2]。近来研究发现，这些因子之间在促进VSMC增殖过程中起着协同作用，即大大上调其促VSMC增殖作用，加速病变进程[2,3]。在体内以VSMC增殖为特征的病变中，碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)[2]和白细胞介素6(interleukin, IL-6)[4]是比较重要的VSMC增殖促进因子，但是bFGF和IL-6之间对VSMC的增殖是否具有协同作用目前尚未见报道。本研究以培养的大鼠主动脉VSMC为材料，对此进行了探讨。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 实验材料
雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，150～250 g，购自本校实验动物中心；DMEM为Gibco公司产品；新生小牛血清为杭州四季青生物制品公司产品；胰蛋白酶为Serva公司产品；bFGF为Promega公司产品；IL-6为Promega公司产品；5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU)掺入标记试剂盒为Boehringer Mannheim 公司产品。
1.2 平滑肌细胞培养和鉴定
用贴块法[5]进行细胞培养。20%新生小牛血清+DMEM培养基培养大鼠胸主动脉VSMC，15～20天细胞融合，以0.25%胰蛋白酶+0.20% EDTA消化液消化细胞，离心法传代，10%新生小牛血清+DMEM培养基传代。平滑肌特异性抗肌动蛋白抗体免疫组织化学染色鉴定细胞。实验均采用6代以内的VSMC。
, 百拇医药
1.3 BrdU掺入法
血管平滑肌细胞以5.0×106/L×100 μL/孔的密度种于96孔板，培养72 h后长至次融合。0.4%新生小牛血清+DMEM静息48 h，换成DMEM液，以不同剂量的bFGF(0、 0.1、 0.5、 1.0、 5.0和10.0 μg/L)和IL-6(0、 0.01、 0.10、 1.0、 10.0和100 μg/L)刺激不同时间，最后加入BrdU标记工作液10 μL/孔，按照试剂盒说明书操作，即依次加入预冷细胞固定液、核酸酶工作液、抗BrdU-POD Fab片断工作液、工作缓冲液和过氧化物酶底物/增强剂，以490 nm为参照，于405 nm波长测定光密度值。并分别观察bFGF 1.0 μg/L和IL-6 1.0 μg/L作用0、 2、 6、 12、 24和48 h时，对血管平滑肌细胞2 h BrdU掺入量的影响。
1.4 细胞生长曲线绘制
, 百拇医药
血管平滑肌细胞以1.0×107个/L×1 L/孔的密度种于24孔板，培养12 h后以0.4% 新生小牛血清+DMEM静息48 h，换成DMEM液，加入5.0 μg/L bFGF和10 μg/L IL-6共同刺激，隔天换DMEM液和刺激因子，每天以0.25%胰蛋白酶+ 0.20% EDTA液消化4孔细胞，置于血球计数板内计数，每孔重复3次，取平均值，共持续7天。
1.5 统计方法
所有实验重复3遍，数据以
±s表示，组间比较如方差齐采用t检验，方差不齐用t'检验。
2 结 果
2.1 不同浓度碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素6对平滑肌细胞DNA合成的影响
, 百拇医药
碱性成纤维细胞生长因子和IL-6分别在0.10～10.0 μg/L和0.01～100 μg/L的浓度范围内均能显著增加VSMC BrdU掺入量，且BrdU掺入量随剂量的增加而增加，呈典型的量效关系，说明bFGF和IL-6促进VSMC DNA合成均具有剂量依赖性(图1，Figure 1)。同时以1.0 μg/L IL-6+0.10～10.0 μg/L bFGF和1.0 μg/L bFGF+0.01～100 μg/L IL-6共同刺激培养VSMC，发现IL-6和bFGF两者之间具有协同作用。例如单用1.0 μg/L bFGF刺激培养的VSMC与空白对照组相比，其VSMC BrdU掺入量增加1.317±0.093倍，1.0 μg/L浓度的IL-6能使VSMC BrdU掺入量增加0.647±0.031倍，而相同浓度两者合用时VSMC的BrdU掺入量增加4.225±0.390倍(实测值)，与两者单用时的倍数之和2.328±0.151(相加值)相比差异具有显著性(P<0.01)。同样1.0 μg/L bFGF和不同浓度(0.01～100 μg/L)IL-6合用刺激VSMC，其BrdU掺入量的增加倍数与相同浓度单用时增加倍数之和相比增加(P<0.001)。
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图1 碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素6促进大鼠血管平滑肌细胞BrdU掺入量的协同作用
Figure 1 The synergistic effect of bFGF and IL-6 on rat VSMC BrdU incorporation(n=4)
2.2 不同作用时间碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素6对平滑肌细胞DNA合成的影响
研究发现，bFGF和IL-6在所予浓度下能显著促进VSMC BrdU掺入，2 h BrdU掺入量开始增加，24 h时达到高峰，其后减弱。bFGF 1.0 μg/L和IL-6 1.0 μg/L共存24 h时细胞BrdU掺入量增加1.23±0.26倍，与两者相同剂量下单独刺激时VSMC BrdU掺入量之和相比增加(P<0.01)。两者共同作用12和48 h时也有差异(P<0.05) (表1, Table 1) 。
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表1 碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素6协同促进大鼠血管平滑肌细胞BrdU掺入量的时效关系
Table 1 The time-effect relationship of the synergistic effect of bFGF and IL-6 on rat VSMC BrdU incorporation (±s) Time(h)
n
bFGF
IL-6
Additive Value
Actual Value
, http://www.100md.com 0
4
0±0.040
0±0.096
0±0.116
0±0.035
2
4
0.249±0.055
0.225±0.076
0.474±0.131
0.567±0.070
, 百拇医药 6
4
0.316±0.072
0.148±0.061
0.463±0.141
0.588±0.079
12
4
0.235±0.062
0.225±0.020
0.460±0.068
0.595±0.052a
, 百拇医药
24
4
0.508±0.101
0.246±0.070
0.754±0.085
1.232±0.259b
48
4
0.224±0.085
0.230±0.026
0.454±0.104
0.626±0.061a
, 百拇医药
a: P<0.05, b: P<0.01， compared with additive value.
2.3 碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素6对血管平滑肌细胞数目的影响
图2 (Figure 2)显示IL-6和bFGF均能增加VSMC数目，且呈时效关系，说明IL-6和bFGF促进VSMC增殖在1周内具有时间依赖性 。同时发现bFGF 较IL-6促增殖作用更为明显，而且两者具有协同作用(P<0.001)。
图2 碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素6对血管平滑肌细胞计数的影响(n=4)
Figure 2 The effect of bFGF and IL-6 on VSMC cell number
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3 讨 论
碱性成纤维细胞生长因子是肝素结合生长因子家族成员之一，在体内分布广泛[2]。近来研究表明，碱性成纤维细胞生长因子促进血管平滑肌细胞增殖是动脉粥样硬化和再狭窄等诸多心血管疾病的发病机制之一。球囊损伤大鼠主动脉内膜后即刻注射碱性成纤维细胞生长因子能增加血管平滑肌细胞增殖率，增厚内膜。而损伤时静注碱性成纤维细胞生长因子抗体或腔内转染反义碱性成纤维细胞生长因子均能抑制血管平滑肌细胞增殖和内膜增生，减少内膜中层面积比例[6]。血管平滑肌细胞和内皮细胞是血管壁合成碱性成纤维细胞生长因子的主要细胞，在一些病理状态下进入血管壁的细胞，如动脉粥样硬化斑块浸润的T淋巴细胞和单核/巨噬细胞也能合成碱性成纤维细胞生长因子。巨噬细胞还能释放硫酸乙酰肝素降解酶等细胞外基质降解酶，动员细胞外基质结合碱性成纤维细胞生长因子。碱性成纤维细胞生长因子能促进人、牛、大鼠等各种来源的血管平滑肌细胞增殖，DNA合成明显增加，细胞数目显著增多[2]。本研究发现，碱性成纤维细胞生长因子能呈剂量、时间依赖性地促进血管平滑肌细胞 DNA合成，增加细胞数目，其明显的促血管平滑肌细胞 增殖作用与已报道的研究结果相一致。
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动脉粥样硬化发生过程中炎症机制和免疫机制的作用已有大量研究。细胞成份(T细胞、B细胞和单核/巨噬细胞)和体液成份(免疫球蛋白和激活的补体蛋白)存在于动脉粥样硬化的病灶中，炎症细胞由血液进入血管壁，合成分泌炎症过程中的重要介质细胞因子，促进病变进展，其中包括白细胞介素6[1,4]。白细胞介素6又称B细胞刺激因子2、β2干扰素或杂交瘤/浆细胞生长因子。白细胞介素6作用多样，对血液系统、免疫系统、内分泌系统和机体代谢均有影响。近来研究发现，白细胞介素6还参与动脉粥样硬化的发生。Rus等[7]免疫组织化学研究表明，正常动脉壁即有白细胞介素6蛋白沉积，动脉粥样硬化组织白细胞介素6表达明显增加。动脉粥样硬化病灶的主要细胞血管平滑肌细胞、巨噬细胞、内皮细胞和T细胞均能分泌白细胞介素6[7,8]，并可被血管内血流冲击血管壁产生的剪切力、血小板、凝血酶和血小板激活因子所上调[9]。
与以往报道相似[4,9]，本实验发现白细胞介素6能促进血管平滑肌细胞增殖，但其促细胞增殖活性相对碱性成纤维细胞生长因子较弱。白细胞介素6也能协同促进血管平滑肌细胞DNA合成，细胞数目增多，并在一定浓度、时间范围内呈剂量、时间依赖性，即白细胞介素6能大大增强碱性成纤维细胞生长因子促血管平滑肌细胞增殖作用。
, 百拇医药
本研究采用的BrdU掺入法是近年发展起来的DNA合成检测方法，BrdU能代替 3 H-胸腺嘧啶掺入细胞DNA，与BrdU单抗结合后再与酶或荧光色素联接的二抗结合，相应仪器检测后即可得到DNA合成信息。与 3 H-胸腺嘧啶掺入法相比，BrdU掺入法同样敏感可靠，但是更经济安全，无需液闪液，现已得到广泛应用[10]。
协同作用是近年来较受关注的因子之间的相互作用方式，其中对血管平滑肌细胞增殖的协同作用研究较多。血管紧张素Ⅱ和上皮生长因子对牛血管平滑肌细胞增殖存在协同促进作用。较弱的丝裂原胰岛素样生长因子I能显著提高碱性成纤维细胞生长因子促进血管平滑肌细胞分裂的能力。三磷酸腺苷是血管平滑肌细胞的丝裂原，与碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素6一样都具有协同促进增殖作用。碱性成纤维细胞生长因子通过上调血小板源性生长因子受体亚基与血小板源性生长因子-A协同促进牛血管平滑肌细胞增殖。白细胞介素6与表皮生长因子对血管平滑肌细胞增殖具有协同作用，但是白细胞介素1和血小板源性生长因子则为相加作用[2,3]。本研究应用BrdU掺入法和细胞计数法观察了碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素6对大鼠主动脉血管平滑肌细胞DNA合成和细胞数目的影响，首次报道两者对血管平滑肌细胞增殖具有协同作用。
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协同作用机理尚未清楚，可能与其互相促进内源性生长因子和/或特异性受体和/或受体配体结合效价上调有关。有报道碱性成纤维细胞生长因子能增加成骨样细胞MC3T3-E1细胞株白细胞介素6合成，这可能是碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素6协同作用机制之一。而碱性成纤维细胞生长因子对白细胞介素6受体，白细胞介素6对碱性成纤维细胞生长因子及其受体，以及相互结合效价的影响，均有待于进一步研究探明。
[作者简介] 潘晓宏，男，1972年出生,浙江大学医学院附属第二医院心内科博士。单 江,男,1939年出生,教授,博士生导师。
参考文献
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(此文1999-12-21收到，2000-07-05修回), http://www.100md.com
单位：潘晓宏(浙江大学医学院附属第二医院心内科， 浙江省杭州市 310009)；单江(浙江大学医学院附属第二医院心内科， 浙江省杭州市 310009)；罗建红(浙江大学医学院附属第二医院医学分子生物学实验室， 浙江省杭州市 310009)
关键词：成纤维细胞生长因子, 碱性；白细胞介素6；肌,平滑；细胞增殖；协同作用；动脉粥样硬化
中国动脉硬化杂志000312[摘 要] 为观察碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素6促进血管平滑肌细胞增殖的协同作用，采用大鼠主动脉贴块法培养血管平滑肌细胞，用5-溴-2-脱氧尿嘧啶掺入法和细胞计数法观察碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素6对平滑肌细胞增殖的影响。结果发现， 0～10.0 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子和0～100 μg/L白细胞介素6能促进平滑肌细胞增殖，且呈剂量依赖性，1.0 μg/L碱性成纤维细胞生长因子和1.0 μg/L白细胞介素6促进细胞增殖，且48 h内呈时效依赖性，作用高峰在24 h，两者合用促进细胞增殖作用大于两者单用作用之和，呈协同作用。
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[中图分类号] R364.3 [文献标识码] A
[文章编号] 1007-3949(2000)-03-0233-04
The Synergistic Effect of Basic Fibroblast Growth Factor and Interleukin-6 on Rat Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation
PAN Xiao-Hong，SHAN Jiang
(Cardiovascular Department, Second Affiliated Hospital of Medicine College, Zhejiang University, Hangzhou 310009, China)
, 百拇医药 LUO Jian-Hong
(Lab of Medical Molecular Biology, Medicine College, Zhejiang University, Hangzhou 310009, China)
ABSTRACT Aim To observe the synergistic effect of basic fibroblast growth factor and interleukin-6 on vascular smooth muscle cells proliferation. Methods BrdU incorporation and cell counting method were adopted to observe the effects of basic fibroblast growth factor and interleukin-6 on the proliferation of rat aortic cultured smooth muscle cells. Results 0～10.0 μg/L basic fibroblast growth factor and 0～100 μg/L interleukin-6 were able to promote smooth muscle cells proliferation separately, and synergistically in combination in dose- and time-dependent manner. The pro-proliferation effect reached climax at 24 hours. Conclusion Basic fibroblast growth factor and interleukin-6 had synergistic effect on vascular smooth muscle cells proliferation.
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MeSH Fibroblast Growth Factor, Basic； Interleukin-6； Muscle, Smooth； Cell Division； Cooperative Behavior； Atherosclerosis
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)增殖是动脉粥样硬化、经皮冠状动脉腔内球囊成形术后再狭窄、心脏搭桥术和心脏移植血管吻合口再狭窄等多种心血管疾病的病理基础。病变局部内皮细胞、VSMC、局部浸润的T淋巴细胞、血小板和巨噬细胞合成分泌的各种生长因子、细胞因子和血管活性物质等均能影响VSMC增殖[1]。血管损伤后的VSMC增殖不是某一因子的结果，而是众多因子通过极其复杂的交谈作用网络共同发挥作用的[1,2]。近来研究发现，这些因子之间在促进VSMC增殖过程中起着协同作用，即大大上调其促VSMC增殖作用，加速病变进程[2,3]。在体内以VSMC增殖为特征的病变中，碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)[2]和白细胞介素6(interleukin, IL-6)[4]是比较重要的VSMC增殖促进因子，但是bFGF和IL-6之间对VSMC的增殖是否具有协同作用目前尚未见报道。本研究以培养的大鼠主动脉VSMC为材料，对此进行了探讨。
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1 材料和方法
1.1 实验材料
雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，150～250 g，购自本校实验动物中心；DMEM为Gibco公司产品；新生小牛血清为杭州四季青生物制品公司产品；胰蛋白酶为Serva公司产品；bFGF为Promega公司产品；IL-6为Promega公司产品；5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU)掺入标记试剂盒为Boehringer Mannheim 公司产品。
1.2 平滑肌细胞培养和鉴定
用贴块法[5]进行细胞培养。20%新生小牛血清+DMEM培养基培养大鼠胸主动脉VSMC，15～20天细胞融合，以0.25%胰蛋白酶+0.20% EDTA消化液消化细胞，离心法传代，10%新生小牛血清+DMEM培养基传代。平滑肌特异性抗肌动蛋白抗体免疫组织化学染色鉴定细胞。实验均采用6代以内的VSMC。
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1.3 BrdU掺入法
血管平滑肌细胞以5.0×106/L×100 μL/孔的密度种于96孔板，培养72 h后长至次融合。0.4%新生小牛血清+DMEM静息48 h，换成DMEM液，以不同剂量的bFGF(0、 0.1、 0.5、 1.0、 5.0和10.0 μg/L)和IL-6(0、 0.01、 0.10、 1.0、 10.0和100 μg/L)刺激不同时间，最后加入BrdU标记工作液10 μL/孔，按照试剂盒说明书操作，即依次加入预冷细胞固定液、核酸酶工作液、抗BrdU-POD Fab片断工作液、工作缓冲液和过氧化物酶底物/增强剂，以490 nm为参照，于405 nm波长测定光密度值。并分别观察bFGF 1.0 μg/L和IL-6 1.0 μg/L作用0、 2、 6、 12、 24和48 h时，对血管平滑肌细胞2 h BrdU掺入量的影响。
1.4 细胞生长曲线绘制
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血管平滑肌细胞以1.0×107个/L×1 L/孔的密度种于24孔板，培养12 h后以0.4% 新生小牛血清+DMEM静息48 h，换成DMEM液，加入5.0 μg/L bFGF和10 μg/L IL-6共同刺激，隔天换DMEM液和刺激因子，每天以0.25%胰蛋白酶+ 0.20% EDTA液消化4孔细胞，置于血球计数板内计数，每孔重复3次，取平均值，共持续7天。
1.5 统计方法
所有实验重复3遍，数据以
±s表示，组间比较如方差齐采用t检验，方差不齐用t'检验。2 结 果
2.1 不同浓度碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素6对平滑肌细胞DNA合成的影响
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碱性成纤维细胞生长因子和IL-6分别在0.10～10.0 μg/L和0.01～100 μg/L的浓度范围内均能显著增加VSMC BrdU掺入量，且BrdU掺入量随剂量的增加而增加，呈典型的量效关系，说明bFGF和IL-6促进VSMC DNA合成均具有剂量依赖性(图1，Figure 1)。同时以1.0 μg/L IL-6+0.10～10.0 μg/L bFGF和1.0 μg/L bFGF+0.01～100 μg/L IL-6共同刺激培养VSMC，发现IL-6和bFGF两者之间具有协同作用。例如单用1.0 μg/L bFGF刺激培养的VSMC与空白对照组相比，其VSMC BrdU掺入量增加1.317±0.093倍，1.0 μg/L浓度的IL-6能使VSMC BrdU掺入量增加0.647±0.031倍，而相同浓度两者合用时VSMC的BrdU掺入量增加4.225±0.390倍(实测值)，与两者单用时的倍数之和2.328±0.151(相加值)相比差异具有显著性(P<0.01)。同样1.0 μg/L bFGF和不同浓度(0.01～100 μg/L)IL-6合用刺激VSMC，其BrdU掺入量的增加倍数与相同浓度单用时增加倍数之和相比增加(P<0.001)。
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图1 碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素6促进大鼠血管平滑肌细胞BrdU掺入量的协同作用
Figure 1 The synergistic effect of bFGF and IL-6 on rat VSMC BrdU incorporation(n=4)
2.2 不同作用时间碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素6对平滑肌细胞DNA合成的影响
研究发现，bFGF和IL-6在所予浓度下能显著促进VSMC BrdU掺入，2 h BrdU掺入量开始增加，24 h时达到高峰，其后减弱。bFGF 1.0 μg/L和IL-6 1.0 μg/L共存24 h时细胞BrdU掺入量增加1.23±0.26倍，与两者相同剂量下单独刺激时VSMC BrdU掺入量之和相比增加(P<0.01)。两者共同作用12和48 h时也有差异(P<0.05) (表1, Table 1) 。
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表1 碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素6协同促进大鼠血管平滑肌细胞BrdU掺入量的时效关系
Table 1 The time-effect relationship of the synergistic effect of bFGF and IL-6 on rat VSMC BrdU incorporation (
±s) Time(h)n
bFGF
IL-6
Additive Value
Actual Value
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4
0±0.040
0±0.096
0±0.116
0±0.035
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0.249±0.055
0.225±0.076
0.474±0.131
0.567±0.070
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0.316±0.072
0.148±0.061
0.463±0.141
0.588±0.079
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4
0.235±0.062
0.225±0.020
0.460±0.068
0.595±0.052a
, 百拇医药
24
4
0.508±0.101
0.246±0.070
0.754±0.085
1.232±0.259b
48
4
0.224±0.085
0.230±0.026
0.454±0.104
0.626±0.061a
, 百拇医药
a: P<0.05, b: P<0.01， compared with additive value.
2.3 碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素6对血管平滑肌细胞数目的影响
图2 (Figure 2)显示IL-6和bFGF均能增加VSMC数目，且呈时效关系，说明IL-6和bFGF促进VSMC增殖在1周内具有时间依赖性 。同时发现bFGF 较IL-6促增殖作用更为明显，而且两者具有协同作用(P<0.001)。
图2 碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素6对血管平滑肌细胞计数的影响(n=4)
Figure 2 The effect of bFGF and IL-6 on VSMC cell number
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3 讨 论
碱性成纤维细胞生长因子是肝素结合生长因子家族成员之一，在体内分布广泛[2]。近来研究表明，碱性成纤维细胞生长因子促进血管平滑肌细胞增殖是动脉粥样硬化和再狭窄等诸多心血管疾病的发病机制之一。球囊损伤大鼠主动脉内膜后即刻注射碱性成纤维细胞生长因子能增加血管平滑肌细胞增殖率，增厚内膜。而损伤时静注碱性成纤维细胞生长因子抗体或腔内转染反义碱性成纤维细胞生长因子均能抑制血管平滑肌细胞增殖和内膜增生，减少内膜中层面积比例[6]。血管平滑肌细胞和内皮细胞是血管壁合成碱性成纤维细胞生长因子的主要细胞，在一些病理状态下进入血管壁的细胞，如动脉粥样硬化斑块浸润的T淋巴细胞和单核/巨噬细胞也能合成碱性成纤维细胞生长因子。巨噬细胞还能释放硫酸乙酰肝素降解酶等细胞外基质降解酶，动员细胞外基质结合碱性成纤维细胞生长因子。碱性成纤维细胞生长因子能促进人、牛、大鼠等各种来源的血管平滑肌细胞增殖，DNA合成明显增加，细胞数目显著增多[2]。本研究发现，碱性成纤维细胞生长因子能呈剂量、时间依赖性地促进血管平滑肌细胞 DNA合成，增加细胞数目，其明显的促血管平滑肌细胞 增殖作用与已报道的研究结果相一致。
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动脉粥样硬化发生过程中炎症机制和免疫机制的作用已有大量研究。细胞成份(T细胞、B细胞和单核/巨噬细胞)和体液成份(免疫球蛋白和激活的补体蛋白)存在于动脉粥样硬化的病灶中，炎症细胞由血液进入血管壁，合成分泌炎症过程中的重要介质细胞因子，促进病变进展，其中包括白细胞介素6[1,4]。白细胞介素6又称B细胞刺激因子2、β2干扰素或杂交瘤/浆细胞生长因子。白细胞介素6作用多样，对血液系统、免疫系统、内分泌系统和机体代谢均有影响。近来研究发现，白细胞介素6还参与动脉粥样硬化的发生。Rus等[7]免疫组织化学研究表明，正常动脉壁即有白细胞介素6蛋白沉积，动脉粥样硬化组织白细胞介素6表达明显增加。动脉粥样硬化病灶的主要细胞血管平滑肌细胞、巨噬细胞、内皮细胞和T细胞均能分泌白细胞介素6[7,8]，并可被血管内血流冲击血管壁产生的剪切力、血小板、凝血酶和血小板激活因子所上调[9]。
与以往报道相似[4,9]，本实验发现白细胞介素6能促进血管平滑肌细胞增殖，但其促细胞增殖活性相对碱性成纤维细胞生长因子较弱。白细胞介素6也能协同促进血管平滑肌细胞DNA合成，细胞数目增多，并在一定浓度、时间范围内呈剂量、时间依赖性，即白细胞介素6能大大增强碱性成纤维细胞生长因子促血管平滑肌细胞增殖作用。
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本研究采用的BrdU掺入法是近年发展起来的DNA合成检测方法，BrdU能代替 3 H-胸腺嘧啶掺入细胞DNA，与BrdU单抗结合后再与酶或荧光色素联接的二抗结合，相应仪器检测后即可得到DNA合成信息。与 3 H-胸腺嘧啶掺入法相比，BrdU掺入法同样敏感可靠，但是更经济安全，无需液闪液，现已得到广泛应用[10]。
协同作用是近年来较受关注的因子之间的相互作用方式，其中对血管平滑肌细胞增殖的协同作用研究较多。血管紧张素Ⅱ和上皮生长因子对牛血管平滑肌细胞增殖存在协同促进作用。较弱的丝裂原胰岛素样生长因子I能显著提高碱性成纤维细胞生长因子促进血管平滑肌细胞分裂的能力。三磷酸腺苷是血管平滑肌细胞的丝裂原，与碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素6一样都具有协同促进增殖作用。碱性成纤维细胞生长因子通过上调血小板源性生长因子受体亚基与血小板源性生长因子-A协同促进牛血管平滑肌细胞增殖。白细胞介素6与表皮生长因子对血管平滑肌细胞增殖具有协同作用，但是白细胞介素1和血小板源性生长因子则为相加作用[2,3]。本研究应用BrdU掺入法和细胞计数法观察了碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素6对大鼠主动脉血管平滑肌细胞DNA合成和细胞数目的影响，首次报道两者对血管平滑肌细胞增殖具有协同作用。
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协同作用机理尚未清楚，可能与其互相促进内源性生长因子和/或特异性受体和/或受体配体结合效价上调有关。有报道碱性成纤维细胞生长因子能增加成骨样细胞MC3T3-E1细胞株白细胞介素6合成，这可能是碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素6协同作用机制之一。而碱性成纤维细胞生长因子对白细胞介素6受体，白细胞介素6对碱性成纤维细胞生长因子及其受体，以及相互结合效价的影响，均有待于进一步研究探明。
[作者简介] 潘晓宏，男，1972年出生,浙江大学医学院附属第二医院心内科博士。单 江,男,1939年出生,教授,博士生导师。
参考文献
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(此文1999-12-21收到，2000-07-05修回), http://www.100md.com