含镧羟基磷灰石的细胞毒性研究
作者：张玉梅 付涛 徐可为 王勤涛
单位：张玉梅(西安交通大学金属材料强度国家重点实验室, 陕西 西安 710049)；付涛(西安交通大学金属材料强度国家重点实验室, 陕西 西安 710049)；徐可为(西安交通大学金属材料强度国家重点实验室, 陕西 西安 710049)；王勤涛(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)
关键词：含镧羟基磷灰石；细胞毒性
牙体牙髓牙周病学杂志000312 【摘 要】 目的：体外研究含镧羟基磷灰石的细胞 毒性。方法：选用建系的L929成纤维细胞和原代培养的SD大鼠头盖 骨细胞 进行实验；采用中性红测试法、MTT测试法及碱性磷酸酶(ALP)活性测试法研究含镧羟基磷 灰石浸提液对细胞活性、增殖及功能表达的影响。结果：中性红法、MTT法测试的活性细胞百分率(RGR)均高于75%； 不同浓度材料浸提液与成骨细胞作用后ALP活性的A值，与阴性对照组相比较各组间 无显著差异。结论：含镧羟基磷灰石无细胞毒性作用。
, 百拇医药
【中图号】 R318.08 【文献标识码】 A
【文章编号】 1005-2593(2 000)03-0152-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，2000，10(3)：152]
Cytotoxicity of lanthanum-substituted hydroxyapatite
ZHANG Yu-mei, FU Tao, XU Ke-wei， et al
State Key Laboratory for Mechanical Behavior of Metal Materials, Xi’an Ji aotong University, Xi'an 710049
【Abstract】 AIM: To evaluate the general cytotoxicity of lanthanum-substituted hydroxyapatites. METHODS: Two kin ds of cells were used in this study, one was L929 fibroblast, the other was oste ob lasts come from primary culture of rat calvaria. Neutral red test, MTT assay and Alkaline phosphatase (ALP) activity were carried out to establish cell viabilit y, proliferation and differentiation. RESULTS: According t o the neutral red test and MTT assay, the percentage of viable cells (RGR) was n ever lower than 75%; The OD value for ALP activity produced by osteoblast was si milar for the negative control and the extracts. CONCLUSION: The lanthanum-substituted hydroxyapatites do not induce any cytotoxic effect.
, 百拇医药
【Key words】 lanthanum-substituted hydroxyapatite; cyto toxicity
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 2000,10(3):152]
目前用于人体硬组织(骨和牙)修复和替换的生物活性陶瓷材料主要 是羟基磷灰石。而在骨组织 中的磷酸钙种类很多，某些微量离子在骨组织形成过程中起着非常重要的作用。在骨骼中稀 土元素属微量离子，已有学者发现镧、铈等稀土元素在牙齿矿化方面起一定的作用[1 ，2]。 因此深入研究这些离子的生物学效应，有助于了解磷酸钙生物陶瓷材料的成骨机制，从而开 发出更加适合骨修复的磷酸钙类生物活性材料。本研究在合成含镧羟基磷灰石的基础上 [3]对其细胞毒性进行检测，为进一步研究和应用此类材料提供生物学依据。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 制备含镧羟基磷灰石
将合成的两种组分(1La-HA和10La-HA)含镧羟基磷灰石200目 过筛制粉，900℃烧结， 60Co照射灭菌备用[3]。
1.2 材料浸提液的制备
将两种粉按重量/浸提介质=1g/10ml, 用DMEM培养液在37℃浸提120h待用。
1.3 细胞培养
选用两种细胞，一是建系的L929成纤维细胞(第四军医大学口腔生物学教 研室提供)。另一种是原代培养的SD大鼠头盖骨细胞：取刚出生的SD大鼠6只，无菌环境中 取出头盖骨，无血清DMEM培养液洗3遍；去净骨缝及骨片表面的软组织，剪碎骨片；置入4m l 2.5g/L胰蛋白酶中37℃消化2h，弃去含消化细胞的上清液。用骨消化液(含10g/L Ⅰ型胶 原酶，2.5g/L胰蛋白酶)4ml 继续消化2遍，每次1h，收集含消化细胞上清。离心，弃上清 ，将 沉淀的细胞置培养瓶中，DMEM，37℃，50ml/L CO2环境中培养；收集第三代细胞进行实验 。将上述两种细胞按浓度2×107/L分别接种到96孔板中。每孔重复4遍。
, 百拇医药
1.4 浸提液作用培养细胞
将浸提液按100%、50%、10%、1%浓度稀释，阳性对照为6.4ml/L苯酚，阴性对照为细胞培养 液。细胞贴壁24h后，移去上清。取上述实验组分别加入100μl, 37℃，50ml/L CO2环境 中培养。
1.5 细胞活性检测——中性红法
细胞培养3d后，取浸提液与L929作用的培养板，移去上清，每孔加入100ml/L甲醛200μl， 继 续培养15min；移去上清，每孔加入100ml/L醋酸200μl，继续培养30min。酶联免疫仪上，4 90nm波长下测吸光值(A1)，取平均值。
1.6 细胞代谢活性检测——MTT法
细胞培养3d后，取浸提液与L929作用的培养板，每孔加5g/L的MTT 20μl，37℃孵育4h 。弃上清，每孔加纯DMSO 150μl，震荡10min。酶联免疫仪上，490nm波长下测吸光值(A2)，取平均值。
, 百拇医药
1.7 细胞分化功能检测——ALP活性
细胞培养5d后，取浸提液与成骨细胞作用的培养板，弃上清，0.01mol/L PBS(pH7.4)洗 各培养孔3次，加入3g/L triton-X100 100μl，4℃过夜，再加入150μl碱性磷酸酶底物液 ， 37℃孵育40 min ，加入50μl 的1mol/L NaOH终止反应，在酶联免疫仪上，410nm波长测吸 光收值(A3)，取平均值。
2 结果 (表1、2)
表1 两种材料各浓度浸提液与细胞作用后的吸光值 (
±s)
1La-HA
10La-HA
, 百拇医药
阴性对照
阳性对照
100%
50%
10%
1%
100%
50%
10%
1%
A1
0.46±0.10
0.55±0.02
, 百拇医药
0.60±0.03
0.59±0.03
0.45±0.09
0.56±0.03
0.58±0.02
0.56±0.02
0.55±0.03
0.09±0.05
A2
1.27±0.04
1.43±0.03
1.47±0.05
, http://www.100md.com
1.33±0.35
1.30±0.01
1.53±0.06
1.56±0.05
1.36±0.30
1.39±0.09
0.11±0.03
A3
0.42±0.05
0.39±0.01
0.43±0.03
0.41±0.02
, 百拇医药
0. 40 ±0.01
0.36±0.05
0.44±0.02
0.44±0.05
0.44±0.01
0.03±0.01)
表2 两种材料各浓度浸提液组的活细胞百分率 (±s)(%)
1La-HA
10La-HA
阴性对照
, http://www.100md.com
阳性对照
100%
50%
10%
1%
100%
50%
10%
1%
中性红法
84±0.22
100±0.07
109±0.08
, 百拇医药
107±0.08
82 ±0.20
102±0.08
105±0.07
102±0.08
100
16±0.56
MTT法
91±0.07
103±0.07
106±0.08
96±0.27
, http://www.100md.com
94±0.0 6
110±0.08
112±0.08
98±0.23
100
8±0.27
在中性红法及MTT法检测的细胞活性实验中，不同浓度的材料浸提液与 L929细胞作用后，活 性细胞百分率按下式计算[4]：活性细胞百分率(RGR)=E/C×100%±s，s =[s2E×1/E2+(s2C×E2/C4)]1/2。其中E为实验组的吸 光值，C为阴性对照组的吸光均值，s为标准差，sE为E的标准差，sC为C的 标准差。
, 百拇医药
对表1数值计算后，各浸提液浓度组活性细胞百分率均大于75%(表2)。根据RGR 和细胞毒性分级[4，5]，可以认为两种含镧羟基磷灰石无细胞毒性。表1还显示不 同浓度材料 浸提液与成骨细胞作用后ALP活性的吸光值(A3)，与阴性对照组相比较，各组间无显 著差异。
3 讨论
对于生物材料进行细胞毒性研究是检测材料生物相容性的一项基本内容。体外细胞培养法具 有简捷、快速、灵敏、重复性好等优点。本实验选用L929成纤维细胞和成骨细 胞对含镧羟基磷灰石的细胞毒性进行了综合评价。选用非植入部位的细胞(L929)与材料浸 提液相互作用，可以反映出细胞对材料可能存在的毒性物质的反应，充分体现材料可能的毒 性；选用植入部位的主要功能细胞(成骨细胞)不仅反映材料的毒性，同时可以反映出材料 对细胞增殖、分化等功能的影响，更能体现体内的状况。本实验中性红法是通过活细胞的染 色来对活细胞的量进行分析；MTT 法是通过检测活细胞的数量和其新陈代谢强度来对活细胞的代谢活性进行评价[6] 。通过这两种实验可以反映出材料对细胞活性的数量及代谢功能的影响，无疑可以较综合、 灵敏地反映出被测试材料对细胞造成的毒性损害程度。碱性磷酸酶是成骨细胞分化的主要特 征酶之一，对碱性磷酸酶活性的检测是鉴定成骨细胞和评价其功能活性的重要指标之一 [7]。因此，本实验即通过材料浸提液来观察体外培养条件下新材料是否对成骨细胞碱 性磷酸酶活性的表达有所影响，从一个侧面反映材料对成骨细胞功能的效应。
, 百拇医药
元素镧系稀土元素，在骨组织中属微量元素。镧的原子半径及电荷数决定了其取代羟基磷灰 石中的Ca2+形成较羟基磷灰石更加稳定的晶体结构[8]。因此其浸提液中 溶出的离子浓度较小，产生的毒性也较小。下村博武等[9]对镧等稀土元素进行了 急性细胞毒性研究，亦认为镧的细胞毒性很小。许多学者认为镧具有抑制牙齿脱矿的作 用，将其制成防龋制剂[10]。但镧作为骨组织中的微量元素其在骨组织代谢过 程中的作用尚不清楚。
因此对含镧羟基磷灰石的细胞毒性进行研究，将为进一步研究其生物学性能提供一定的实验 数据和基础。本实验结果表明，各浓度组的两种含镧羟基磷灰石材料浸提液对成纤维细胞均 未 产生毒性反应，也未对成骨细胞的碱性磷酸酶活性表达有抑制性作用；说明新合成的含镧羟 基磷灰石材料符合生物体应用的基本要求，可以进行活体组织内的植入实验，以进一步全面 评价其修复效应。
国家自然科学基金资助项目(95070770)
, 百拇医药
【参考文献】
[1] Zhang WG, Jin H, Liu AR. A comparison of the preventive effect of l anthnides and fluoride on human experimental root surface carious-like lesions. The Chinese Journal of Dental Research, 1999,2(1):36
[2] 金晖，张伟国，刘瑷如. 镧、铈、氟在抑制人离体牙根面脱矿中作用的 比较研究. 上海口腔医学,1995,4(3)：151
[3] 张玉梅，付涛，徐可为. 含镧羟基磷灰石的合成及性能研究. 牙体牙髓牙 周病学杂志，2000，10(3)：149
[4] Dion I, Bordenave L, Lefebvre F, et al. Physico-chemistry and cytotoxicity of ceramics. J Mater Sci Mater Med, 1994,5:18
, 百拇医药
[5] GB/16886-1. 生物材料和医疗器材生物学评价技术要求. 1997
[6] 吕晓迎，Kappert H F. 牙科材料细胞毒性评价的新方法(MTT试验). 中华口腔医学杂志,1995,30：377
[7] Attawia MA. Uhrich KE, Botchwey E. et al. Cytotoxiciyty tes ting of poly(anhydride-co-imides) for orthopedic applications. J Biomed Mater R es, 1995,29:1233
[8] Nicholas D, Priest Frank I, Van De Vyver. Trace metals and fluor ide bones and teeth. The united states: CPC press INC, 1990. 136
[9] 下村博武， 堤 璋二，田熊庄三郎，等. 稀土类元素の急性毒性实验. 齿 科学报, 1980,80(9)：1303
[10] 金晖，张伟国，刘瑷如. 不同处理程序的镧、铈、氟对人牙根面防龋作用 研究. 中华口腔医学杂志. 1997,32(3)：143
收稿日期：2000-02-12, http://www.100md.com
单位：张玉梅(西安交通大学金属材料强度国家重点实验室, 陕西 西安 710049)；付涛(西安交通大学金属材料强度国家重点实验室, 陕西 西安 710049)；徐可为(西安交通大学金属材料强度国家重点实验室, 陕西 西安 710049)；王勤涛(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)
关键词：含镧羟基磷灰石；细胞毒性
牙体牙髓牙周病学杂志000312 【摘 要】 目的：体外研究含镧羟基磷灰石的细胞 毒性。方法：选用建系的L929成纤维细胞和原代培养的SD大鼠头盖 骨细胞 进行实验；采用中性红测试法、MTT测试法及碱性磷酸酶(ALP)活性测试法研究含镧羟基磷 灰石浸提液对细胞活性、增殖及功能表达的影响。结果：中性红法、MTT法测试的活性细胞百分率(RGR)均高于75%； 不同浓度材料浸提液与成骨细胞作用后ALP活性的A值，与阴性对照组相比较各组间 无显著差异。结论：含镧羟基磷灰石无细胞毒性作用。
, 百拇医药
【中图号】 R318.08 【文献标识码】 A
【文章编号】 1005-2593(2 000)03-0152-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，2000，10(3)：152]
Cytotoxicity of lanthanum-substituted hydroxyapatite
ZHANG Yu-mei, FU Tao, XU Ke-wei， et al
State Key Laboratory for Mechanical Behavior of Metal Materials, Xi’an Ji aotong University, Xi'an 710049
【Abstract】 AIM: To evaluate the general cytotoxicity of lanthanum-substituted hydroxyapatites. METHODS: Two kin ds of cells were used in this study, one was L929 fibroblast, the other was oste ob lasts come from primary culture of rat calvaria. Neutral red test, MTT assay and Alkaline phosphatase (ALP) activity were carried out to establish cell viabilit y, proliferation and differentiation. RESULTS: According t o the neutral red test and MTT assay, the percentage of viable cells (RGR) was n ever lower than 75%; The OD value for ALP activity produced by osteoblast was si milar for the negative control and the extracts. CONCLUSION: The lanthanum-substituted hydroxyapatites do not induce any cytotoxic effect.
, 百拇医药
【Key words】 lanthanum-substituted hydroxyapatite; cyto toxicity
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 2000,10(3):152]
目前用于人体硬组织(骨和牙)修复和替换的生物活性陶瓷材料主要 是羟基磷灰石。而在骨组织 中的磷酸钙种类很多，某些微量离子在骨组织形成过程中起着非常重要的作用。在骨骼中稀 土元素属微量离子，已有学者发现镧、铈等稀土元素在牙齿矿化方面起一定的作用[1 ，2]。 因此深入研究这些离子的生物学效应，有助于了解磷酸钙生物陶瓷材料的成骨机制，从而开 发出更加适合骨修复的磷酸钙类生物活性材料。本研究在合成含镧羟基磷灰石的基础上 [3]对其细胞毒性进行检测，为进一步研究和应用此类材料提供生物学依据。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 制备含镧羟基磷灰石
将合成的两种组分(1La-HA和10La-HA)含镧羟基磷灰石200目 过筛制粉，900℃烧结， 60Co照射灭菌备用[3]。
1.2 材料浸提液的制备
将两种粉按重量/浸提介质=1g/10ml, 用DMEM培养液在37℃浸提120h待用。
1.3 细胞培养
选用两种细胞，一是建系的L929成纤维细胞(第四军医大学口腔生物学教 研室提供)。另一种是原代培养的SD大鼠头盖骨细胞：取刚出生的SD大鼠6只，无菌环境中 取出头盖骨，无血清DMEM培养液洗3遍；去净骨缝及骨片表面的软组织，剪碎骨片；置入4m l 2.5g/L胰蛋白酶中37℃消化2h，弃去含消化细胞的上清液。用骨消化液(含10g/L Ⅰ型胶 原酶，2.5g/L胰蛋白酶)4ml 继续消化2遍，每次1h，收集含消化细胞上清。离心，弃上清 ，将 沉淀的细胞置培养瓶中，DMEM，37℃，50ml/L CO2环境中培养；收集第三代细胞进行实验 。将上述两种细胞按浓度2×107/L分别接种到96孔板中。每孔重复4遍。
, 百拇医药
1.4 浸提液作用培养细胞
将浸提液按100%、50%、10%、1%浓度稀释，阳性对照为6.4ml/L苯酚，阴性对照为细胞培养 液。细胞贴壁24h后，移去上清。取上述实验组分别加入100μl, 37℃，50ml/L CO2环境 中培养。
1.5 细胞活性检测——中性红法
细胞培养3d后，取浸提液与L929作用的培养板，移去上清，每孔加入100ml/L甲醛200μl， 继 续培养15min；移去上清，每孔加入100ml/L醋酸200μl，继续培养30min。酶联免疫仪上，4 90nm波长下测吸光值(A1)，取平均值。
1.6 细胞代谢活性检测——MTT法
细胞培养3d后，取浸提液与L929作用的培养板，每孔加5g/L的MTT 20μl，37℃孵育4h 。弃上清，每孔加纯DMSO 150μl，震荡10min。酶联免疫仪上，490nm波长下测吸光值(A2)，取平均值。
, 百拇医药
1.7 细胞分化功能检测——ALP活性
细胞培养5d后，取浸提液与成骨细胞作用的培养板，弃上清，0.01mol/L PBS(pH7.4)洗 各培养孔3次，加入3g/L triton-X100 100μl，4℃过夜，再加入150μl碱性磷酸酶底物液 ， 37℃孵育40 min ，加入50μl 的1mol/L NaOH终止反应，在酶联免疫仪上，410nm波长测吸 光收值(A3)，取平均值。
2 结果 (表1、2)
表1 两种材料各浓度浸提液与细胞作用后的吸光值 (
±s)1La-HA
10La-HA
, 百拇医药
阴性对照
阳性对照
100%
50%
10%
1%
100%
50%
10%
1%
A1
0.46±0.10
0.55±0.02
, 百拇医药
0.60±0.03
0.59±0.03
0.45±0.09
0.56±0.03
0.58±0.02
0.56±0.02
0.55±0.03
0.09±0.05
A2
1.27±0.04
1.43±0.03
1.47±0.05
, http://www.100md.com
1.33±0.35
1.30±0.01
1.53±0.06
1.56±0.05
1.36±0.30
1.39±0.09
0.11±0.03
A3
0.42±0.05
0.39±0.01
0.43±0.03
0.41±0.02
, 百拇医药
0. 40 ±0.01
0.36±0.05
0.44±0.02
0.44±0.05
0.44±0.01
0.03±0.01)
表2 两种材料各浓度浸提液组的活细胞百分率 (
±s)(%)1La-HA
10La-HA
阴性对照
, http://www.100md.com
阳性对照
100%
50%
10%
1%
100%
50%
10%
1%
中性红法
84±0.22
100±0.07
109±0.08
, 百拇医药
107±0.08
82 ±0.20
102±0.08
105±0.07
102±0.08
100
16±0.56
MTT法
91±0.07
103±0.07
106±0.08
96±0.27
, http://www.100md.com
94±0.0 6
110±0.08
112±0.08
98±0.23
100
8±0.27
在中性红法及MTT法检测的细胞活性实验中，不同浓度的材料浸提液与 L929细胞作用后，活 性细胞百分率按下式计算[4]：活性细胞百分率(RGR)=E/C×100%±s，s =[s2E×1/E2+(s2C×E2/C4)]1/2。其中E为实验组的吸 光值，C为阴性对照组的吸光均值，s为标准差，sE为E的标准差，sC为C的 标准差。
, 百拇医药
对表1数值计算后，各浸提液浓度组活性细胞百分率均大于75%(表2)。根据RGR 和细胞毒性分级[4，5]，可以认为两种含镧羟基磷灰石无细胞毒性。表1还显示不 同浓度材料 浸提液与成骨细胞作用后ALP活性的吸光值(A3)，与阴性对照组相比较，各组间无显 著差异。
3 讨论
对于生物材料进行细胞毒性研究是检测材料生物相容性的一项基本内容。体外细胞培养法具 有简捷、快速、灵敏、重复性好等优点。本实验选用L929成纤维细胞和成骨细 胞对含镧羟基磷灰石的细胞毒性进行了综合评价。选用非植入部位的细胞(L929)与材料浸 提液相互作用，可以反映出细胞对材料可能存在的毒性物质的反应，充分体现材料可能的毒 性；选用植入部位的主要功能细胞(成骨细胞)不仅反映材料的毒性，同时可以反映出材料 对细胞增殖、分化等功能的影响，更能体现体内的状况。本实验中性红法是通过活细胞的染 色来对活细胞的量进行分析；MTT 法是通过检测活细胞的数量和其新陈代谢强度来对活细胞的代谢活性进行评价[6] 。通过这两种实验可以反映出材料对细胞活性的数量及代谢功能的影响，无疑可以较综合、 灵敏地反映出被测试材料对细胞造成的毒性损害程度。碱性磷酸酶是成骨细胞分化的主要特 征酶之一，对碱性磷酸酶活性的检测是鉴定成骨细胞和评价其功能活性的重要指标之一 [7]。因此，本实验即通过材料浸提液来观察体外培养条件下新材料是否对成骨细胞碱 性磷酸酶活性的表达有所影响，从一个侧面反映材料对成骨细胞功能的效应。
, 百拇医药
元素镧系稀土元素，在骨组织中属微量元素。镧的原子半径及电荷数决定了其取代羟基磷灰 石中的Ca2+形成较羟基磷灰石更加稳定的晶体结构[8]。因此其浸提液中 溶出的离子浓度较小，产生的毒性也较小。下村博武等[9]对镧等稀土元素进行了 急性细胞毒性研究，亦认为镧的细胞毒性很小。许多学者认为镧具有抑制牙齿脱矿的作 用，将其制成防龋制剂[10]。但镧作为骨组织中的微量元素其在骨组织代谢过 程中的作用尚不清楚。
因此对含镧羟基磷灰石的细胞毒性进行研究，将为进一步研究其生物学性能提供一定的实验 数据和基础。本实验结果表明，各浓度组的两种含镧羟基磷灰石材料浸提液对成纤维细胞均 未 产生毒性反应，也未对成骨细胞的碱性磷酸酶活性表达有抑制性作用；说明新合成的含镧羟 基磷灰石材料符合生物体应用的基本要求，可以进行活体组织内的植入实验，以进一步全面 评价其修复效应。
国家自然科学基金资助项目(95070770)
, 百拇医药
【参考文献】
[1] Zhang WG, Jin H, Liu AR. A comparison of the preventive effect of l anthnides and fluoride on human experimental root surface carious-like lesions. The Chinese Journal of Dental Research, 1999,2(1):36
[2] 金晖，张伟国，刘瑷如. 镧、铈、氟在抑制人离体牙根面脱矿中作用的 比较研究. 上海口腔医学,1995,4(3)：151
[3] 张玉梅，付涛，徐可为. 含镧羟基磷灰石的合成及性能研究. 牙体牙髓牙 周病学杂志，2000，10(3)：149
[4] Dion I, Bordenave L, Lefebvre F, et al. Physico-chemistry and cytotoxicity of ceramics. J Mater Sci Mater Med, 1994,5:18
, 百拇医药
[5] GB/16886-1. 生物材料和医疗器材生物学评价技术要求. 1997
[6] 吕晓迎，Kappert H F. 牙科材料细胞毒性评价的新方法(MTT试验). 中华口腔医学杂志,1995,30：377
[7] Attawia MA. Uhrich KE, Botchwey E. et al. Cytotoxiciyty tes ting of poly(anhydride-co-imides) for orthopedic applications. J Biomed Mater R es, 1995,29:1233
[8] Nicholas D, Priest Frank I, Van De Vyver. Trace metals and fluor ide bones and teeth. The united states: CPC press INC, 1990. 136
[9] 下村博武， 堤 璋二，田熊庄三郎，等. 稀土类元素の急性毒性实验. 齿 科学报, 1980,80(9)：1303
[10] 金晖，张伟国，刘瑷如. 不同处理程序的镧、铈、氟对人牙根面防龋作用 研究. 中华口腔医学杂志. 1997,32(3)：143
收稿日期：2000-02-12, http://www.100md.com