观察细胞内药物浓度方法的比较
作者：王少东 张杏泉 樊代明
单位：张杏泉(第四军医大学唐都医院骨科研究所 西安 710038)；王少东 樊代明(第四军医大学西京医院消化病研究所 西安 710032)
关键词：多药耐药；药物浓度；方法比较
中国肿瘤生物治疗杂志000315 《中国图书资料分类法》分类号
肿瘤细胞对不同抗肿瘤药物发生交叉耐药, 称为多药耐药(multidrug resistance， MDR)。目前，正是由于肿瘤多药耐药现象的普遍存在，使得肿瘤化疗难以达到令人满意的效果。因此，对多药耐药现象的研究成为目前肿瘤研究的热点之一。
目前已发现与肿瘤耐药相关的机理是：①P-糖蛋白的表达;②耐药相关蛋白(MRP)的表达;③拓扑异构酶的减低;④谷胱苷肽转移酶的改变;⑤其他，包括蛋白激酶C(PKC)、肺相关蛋白(LRP)等。其中胞内药物浓度降低是发现最早并被认为是最重要的耐药机制。因此，观察胞内药物浓度的变化也成为观察耐药细胞、耐要机制和化疗预后的一个重要方法。本文作者在对肿瘤耐药进行多年研究中，曾运用一系列方法对细胞内药物浓度进行观察，现将几种较为成熟的方法对比如下。
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1 材料与方法
1.1 细胞及试剂
胃癌细胞SGC7901由军科院惠赠。胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR由我所蔡学君博士初步诱导。阿霉素购自Farmitalia Carlo Erba。 RPMI 1640购自Gibco。小牛血清购自浙江金华。[3H]-阿霉素购自New England Nuclear。 流式细胞分析仪，荧光倒置显微镜，荧光分光光度计，高速台式离心机，液体闪烁记数仪。
1.2 方法
1.2.1 流式细胞仪法
流式细胞仪检测细胞内药物的浓度[1]。在对数生长期的耐药细胞SGC7901/VCR08的培养皿中加入阿霉素，使其在培养液中的浓度达到5 μg/ml，在37℃，5%CO2的温箱中温育不同的时间段，随后收取细胞，冷PBS洗涤2次，重悬于冷PBS 中，40℃下保存至上样行流式细胞仪检测。检测激发波长为488 nm，接受波长为575 nm。
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1.2.2 荧光分光光度计法
FACS(贴壁细胞)SGC7901和SGC7901/VCR08消化、吹打下来后，离心,再悬浮呈1×105/ml的细胞悬液,在12孔板各加入1 ml细胞悬液, 每孔约1×105个细胞，加入RPMI 1640完全培养液培养，置37℃，5% CO2 孵箱中培养过夜。24 h后，待细胞贴壁后，依次加入阿霉素(ADM)至终浓度为5 μg/ml，10 μg/ml，15 μg/ml，20 μg/ml，37℃， 5%CO2 孵箱中继续培养1.5 h。弃去上清， 生理盐水洗涤3次，离心，计数后加预冷0.3 NHCl∶50%乙醇(1∶1)1 ml重悬, 置-20℃过夜。离心取上清,用荧光分光光度计测EXλ495 nm 和EXλ590 nm,同时绘制标准曲线[2]。
1.2.3 荧光倒置显微镜观察
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利用荧光倒置显微镜直接观察细胞内药物浓度的变化。取对数生长期的耐药细胞，分别加入阿霉素至其终浓度为5 μg/ml，5%CO2，37℃条件下温育1 h，弃去含药培养液，加入无药培养液，在荧光倒置显微镜下观察细胞形态及荧光物质在细胞内的聚集[3]。
1.2.4 [3H]-TdR法
收取对数生长期的耐药细胞，分别计数1×105个细胞接种于25 ml培养瓶中，加入RPMI 1640完全培养液培养过夜，24 h后，待细胞贴壁后，在无血清培养液中加入3.7 Ci/mmol的[3H]-阿霉素至其终浓度为5 μg/ml，5%CO2，37℃条件下温育1 h，使其到达稳定期，离心弃去含药培养液，用冷PBS将细胞洗3次。将细胞在0.2 ml含0.5%SDS 的PBS中重悬,裂解，用液闪仪测定其放射性[4]。
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2 结果与讨论
用不同浓度的阿霉素与上述2种细胞共温育不同时间后，用流式细胞仪分析细胞内药物浓度的变化。从实验中可见药物进入胞内后，在3 h时耐药细胞与药敏细胞均出现一个高峰，但以药敏细胞内的药物浓度高且细胞内的药物浓度蓄积较快，随后在3～9 h之间胞内药物浓度开始降低，又以耐药细胞中的药物浓度降低较快为特征。在9～24 h之间2种细胞的胞内药物浓度均开始上升。
用荧光分光光度计测得细胞内药物浓度，观察阿霉素从药敏细胞和耐药细胞中泵出的试验显示，细胞对阿霉素产生抗性后，在培养相同的时间后，阿霉素在耐药细胞内浓度降低速度较药敏细胞明显加快，尤以前10 min内降低最明显(χ2检验，P<0.05)。
用荧光倒置显微镜观察细胞，可直观地发现耐药细胞中药物浓度明显低于药敏细胞。 在激发光的激发下，可发现药敏细胞的胞膜和部分胞浆中发出橙黄色较强的荧光， 形成对比的是在染色同样长时间的情况下耐药细胞中的荧光非常淡， 只可勉强辨认细胞的轮廓。
, 百拇医药
用放射性同位素测得的细胞内浓度，结果显示，耐药细胞与药敏细胞中药物储留有较大差距，尤其在用药温浴10 min后，差异越来越明显(χ2检验，P<0.05)。耐药细胞内的药物浓度呈快速下降趋势， 而药敏细胞中的药物浓度呈缓慢下降趋势。 在50 min内耐药细胞的药物浓度为最初的1/3，而药敏细胞中的药物浓度仍保持在80%左右。
1976年，Juliano发现耐药细胞膜表面蛋白发生变化，过度表达一种分子量为170 kD的糖蛋白，这种糖蛋白被称为P-gp，并认为它与胞内药物浓度的降低有关。研究表明，P-gp的主要作用是将胞内药物泵出细胞。
目前认为肿瘤细胞表面广泛表达的P-gp，由此导致的胞内药物浓度变化是影响肿瘤化疗效果的主要原因。因而研究胞内药物浓度的改变仍是一种观察肿瘤细胞耐药性及药物在细胞内分布的主要指标。阿霉素具有自发荧光，而且是P-糖蛋白的底物，利用各种方法检测胞内的荧光,从而作为药物浓度的一个指标。另外，也可利用罗决明作为指示剂，罗决明是一种荧光物质，同时也是P-糖蛋白的底物。在肿瘤的耐药中，多为多药耐药，其对阿霉素、长春新碱、5-氟尿嘧啶等一系列结构不相同的药物同时出现耐药，因而用阿霉素作为指示剂具有一定的普遍性。在本试验中，作者利用3种方法来检测阿霉素的荧光，它们之间的结果可以互相印证，从而使试验者更加确信试验的结果。流式细胞仪方法简单，可长期、重复观察同一样本或不同时间段的样本，其结果稳定，与其他方法所得结果的吻合性好；同时也是一种定量研究,在临床上有可能实现,且比较PCR和免疫组化来检验P-gp的基因或蛋白表达省时、快捷，可重复。荧光倒置显微镜检测属于一种定性试验，直观、可信，与其他的试验结果是一个很好的印证。虽然，荧光倒置显微镜价格昂贵、标本取材复杂不适于临床应用，但在实验研究上不失为一种重要的定性方法。荧光分光光度计检测其方法比较繁琐，其主要目的是检测细胞内的荧光强度，在检测之前需要清洗细胞、裂解细胞，影响因素较多，例如光化分解、荧光淬灭、pH的影响等。虽然这是一个定量试验，但试验结果的重复性较差，受试验条件的限制，但仍不失为一种可行的方法。用同位素标记药物来检测，定量准确，试验结果可靠，重复性好，操作简单，但是由于我国尚不能标记这一类同位素，所有药品都需进口，费用较高，对人体有一定的伤害,试验应在专用放射性实验室内按有关放射性操作规程进行。总之，以上的几种方法各有优缺点，试验者可根据试验条件和经费情况选择使用。
, 百拇医药
本课题受国家自然科学基金(39770665)资助
参 考 文 献
1，Guerci A, Louis J, Missoum J. Predictive value for treatment outcome in acute myeloid leukemia of cellular daunorubicin accumulation and P-glycoprotein expression simultaneously determined by flow cytometry. Blood, 1995, 85(8): 2147
2，Takeda Y, Nishio K, Niitani H. Reversal of multidrug resistance by tyrosine-kinase inhibitors in a non-P-glycoprotein-mediated multidrug-resistant cell line. Int J Cancer, 1994, 57: 229
, 百拇医药
3，Sognier MA, Zhang Y, Eberle RL. Sequestration of doxorubicin in vesicles in a multidrug-resistant cell line (LZ-100). Biochem Pharmacol， 1994, 48(2): 391
4，Chambers TC, Mcavoy EM, Jacobs JW. Protein kinase C phosphorylates P-glycoprotein in multidrug resistant human KB carcinoma cells. J Biol Chem, 1990, 265(13): 7679
(1999-07-13收稿； 2000-03-31修回), 百拇医药
单位：张杏泉(第四军医大学唐都医院骨科研究所 西安 710038)；王少东 樊代明(第四军医大学西京医院消化病研究所 西安 710032)
关键词：多药耐药；药物浓度；方法比较
中国肿瘤生物治疗杂志000315 《中国图书资料分类法》分类号
肿瘤细胞对不同抗肿瘤药物发生交叉耐药, 称为多药耐药(multidrug resistance， MDR)。目前，正是由于肿瘤多药耐药现象的普遍存在，使得肿瘤化疗难以达到令人满意的效果。因此，对多药耐药现象的研究成为目前肿瘤研究的热点之一。
目前已发现与肿瘤耐药相关的机理是：①P-糖蛋白的表达;②耐药相关蛋白(MRP)的表达;③拓扑异构酶的减低;④谷胱苷肽转移酶的改变;⑤其他，包括蛋白激酶C(PKC)、肺相关蛋白(LRP)等。其中胞内药物浓度降低是发现最早并被认为是最重要的耐药机制。因此，观察胞内药物浓度的变化也成为观察耐药细胞、耐要机制和化疗预后的一个重要方法。本文作者在对肿瘤耐药进行多年研究中，曾运用一系列方法对细胞内药物浓度进行观察，现将几种较为成熟的方法对比如下。
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1 材料与方法
1.1 细胞及试剂
胃癌细胞SGC7901由军科院惠赠。胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR由我所蔡学君博士初步诱导。阿霉素购自Farmitalia Carlo Erba。 RPMI 1640购自Gibco。小牛血清购自浙江金华。[3H]-阿霉素购自New England Nuclear。 流式细胞分析仪，荧光倒置显微镜，荧光分光光度计，高速台式离心机，液体闪烁记数仪。
1.2 方法
1.2.1 流式细胞仪法
流式细胞仪检测细胞内药物的浓度[1]。在对数生长期的耐药细胞SGC7901/VCR08的培养皿中加入阿霉素，使其在培养液中的浓度达到5 μg/ml，在37℃，5%CO2的温箱中温育不同的时间段，随后收取细胞，冷PBS洗涤2次，重悬于冷PBS 中，40℃下保存至上样行流式细胞仪检测。检测激发波长为488 nm，接受波长为575 nm。
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1.2.2 荧光分光光度计法
FACS(贴壁细胞)SGC7901和SGC7901/VCR08消化、吹打下来后，离心,再悬浮呈1×105/ml的细胞悬液,在12孔板各加入1 ml细胞悬液, 每孔约1×105个细胞，加入RPMI 1640完全培养液培养，置37℃，5% CO2 孵箱中培养过夜。24 h后，待细胞贴壁后，依次加入阿霉素(ADM)至终浓度为5 μg/ml，10 μg/ml，15 μg/ml，20 μg/ml，37℃， 5%CO2 孵箱中继续培养1.5 h。弃去上清， 生理盐水洗涤3次，离心，计数后加预冷0.3 NHCl∶50%乙醇(1∶1)1 ml重悬, 置-20℃过夜。离心取上清,用荧光分光光度计测EXλ495 nm 和EXλ590 nm,同时绘制标准曲线[2]。
1.2.3 荧光倒置显微镜观察
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利用荧光倒置显微镜直接观察细胞内药物浓度的变化。取对数生长期的耐药细胞，分别加入阿霉素至其终浓度为5 μg/ml，5%CO2，37℃条件下温育1 h，弃去含药培养液，加入无药培养液，在荧光倒置显微镜下观察细胞形态及荧光物质在细胞内的聚集[3]。
1.2.4 [3H]-TdR法
收取对数生长期的耐药细胞，分别计数1×105个细胞接种于25 ml培养瓶中，加入RPMI 1640完全培养液培养过夜，24 h后，待细胞贴壁后，在无血清培养液中加入3.7 Ci/mmol的[3H]-阿霉素至其终浓度为5 μg/ml，5%CO2，37℃条件下温育1 h，使其到达稳定期，离心弃去含药培养液，用冷PBS将细胞洗3次。将细胞在0.2 ml含0.5%SDS 的PBS中重悬,裂解，用液闪仪测定其放射性[4]。
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2 结果与讨论
用不同浓度的阿霉素与上述2种细胞共温育不同时间后，用流式细胞仪分析细胞内药物浓度的变化。从实验中可见药物进入胞内后，在3 h时耐药细胞与药敏细胞均出现一个高峰，但以药敏细胞内的药物浓度高且细胞内的药物浓度蓄积较快，随后在3～9 h之间胞内药物浓度开始降低，又以耐药细胞中的药物浓度降低较快为特征。在9～24 h之间2种细胞的胞内药物浓度均开始上升。
用荧光分光光度计测得细胞内药物浓度，观察阿霉素从药敏细胞和耐药细胞中泵出的试验显示，细胞对阿霉素产生抗性后，在培养相同的时间后，阿霉素在耐药细胞内浓度降低速度较药敏细胞明显加快，尤以前10 min内降低最明显(χ2检验，P<0.05)。
用荧光倒置显微镜观察细胞，可直观地发现耐药细胞中药物浓度明显低于药敏细胞。 在激发光的激发下，可发现药敏细胞的胞膜和部分胞浆中发出橙黄色较强的荧光， 形成对比的是在染色同样长时间的情况下耐药细胞中的荧光非常淡， 只可勉强辨认细胞的轮廓。
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用放射性同位素测得的细胞内浓度，结果显示，耐药细胞与药敏细胞中药物储留有较大差距，尤其在用药温浴10 min后，差异越来越明显(χ2检验，P<0.05)。耐药细胞内的药物浓度呈快速下降趋势， 而药敏细胞中的药物浓度呈缓慢下降趋势。 在50 min内耐药细胞的药物浓度为最初的1/3，而药敏细胞中的药物浓度仍保持在80%左右。
1976年，Juliano发现耐药细胞膜表面蛋白发生变化，过度表达一种分子量为170 kD的糖蛋白，这种糖蛋白被称为P-gp，并认为它与胞内药物浓度的降低有关。研究表明，P-gp的主要作用是将胞内药物泵出细胞。
目前认为肿瘤细胞表面广泛表达的P-gp，由此导致的胞内药物浓度变化是影响肿瘤化疗效果的主要原因。因而研究胞内药物浓度的改变仍是一种观察肿瘤细胞耐药性及药物在细胞内分布的主要指标。阿霉素具有自发荧光，而且是P-糖蛋白的底物，利用各种方法检测胞内的荧光,从而作为药物浓度的一个指标。另外，也可利用罗决明作为指示剂，罗决明是一种荧光物质，同时也是P-糖蛋白的底物。在肿瘤的耐药中，多为多药耐药，其对阿霉素、长春新碱、5-氟尿嘧啶等一系列结构不相同的药物同时出现耐药，因而用阿霉素作为指示剂具有一定的普遍性。在本试验中，作者利用3种方法来检测阿霉素的荧光，它们之间的结果可以互相印证，从而使试验者更加确信试验的结果。流式细胞仪方法简单，可长期、重复观察同一样本或不同时间段的样本，其结果稳定，与其他方法所得结果的吻合性好；同时也是一种定量研究,在临床上有可能实现,且比较PCR和免疫组化来检验P-gp的基因或蛋白表达省时、快捷，可重复。荧光倒置显微镜检测属于一种定性试验，直观、可信，与其他的试验结果是一个很好的印证。虽然，荧光倒置显微镜价格昂贵、标本取材复杂不适于临床应用，但在实验研究上不失为一种重要的定性方法。荧光分光光度计检测其方法比较繁琐，其主要目的是检测细胞内的荧光强度，在检测之前需要清洗细胞、裂解细胞，影响因素较多，例如光化分解、荧光淬灭、pH的影响等。虽然这是一个定量试验，但试验结果的重复性较差，受试验条件的限制，但仍不失为一种可行的方法。用同位素标记药物来检测，定量准确，试验结果可靠，重复性好，操作简单，但是由于我国尚不能标记这一类同位素，所有药品都需进口，费用较高，对人体有一定的伤害,试验应在专用放射性实验室内按有关放射性操作规程进行。总之，以上的几种方法各有优缺点，试验者可根据试验条件和经费情况选择使用。
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本课题受国家自然科学基金(39770665)资助
参 考 文 献
1，Guerci A, Louis J, Missoum J. Predictive value for treatment outcome in acute myeloid leukemia of cellular daunorubicin accumulation and P-glycoprotein expression simultaneously determined by flow cytometry. Blood, 1995, 85(8): 2147
2，Takeda Y, Nishio K, Niitani H. Reversal of multidrug resistance by tyrosine-kinase inhibitors in a non-P-glycoprotein-mediated multidrug-resistant cell line. Int J Cancer, 1994, 57: 229
, 百拇医药
3，Sognier MA, Zhang Y, Eberle RL. Sequestration of doxorubicin in vesicles in a multidrug-resistant cell line (LZ-100). Biochem Pharmacol， 1994, 48(2): 391
4，Chambers TC, Mcavoy EM, Jacobs JW. Protein kinase C phosphorylates P-glycoprotein in multidrug resistant human KB carcinoma cells. J Biol Chem, 1990, 265(13): 7679
(1999-07-13收稿； 2000-03-31修回), 百拇医药