重组人白介素2腺病毒对腹水癌的治疗作用
作者：魏海燕 郑常文 童晋 孙雪奇 彭旭东
单位：魏海燕 郑常文 童晋 孙雪奇 彭旭东(四川华神集团企业技术中心 成都 610075)
关键词：AdvIL-2；IL-2；Math A
中国肿瘤生物治疗杂志000313 摘 要 目的：为鉴定已构建的重组hIL-2腺病毒(AdvIL-2)活性，在体外转导人多种癌细胞系，以及观察重组病毒对小鼠腹水癌的治疗作用。方法： 通过ELISA法测定所表达hIL-2 的量，MTT法测定所表达IL-2的活性。从注射后24 h后，每日称量试验小鼠的体重，并观察小鼠的存活情况。结果： 发现AdvIL-2在体外能高效转导多种癌细胞，并检测到有10 ng水平hIL-2表达，持续时间为3周左右。腹腔注射治疗小鼠腹水癌(Math A)，总剂量为5×108 PFU，注射AdvIL-2组小鼠腹水增加明显低于对照组：重组荧光酶腺病毒(AdvLuc)、培养基，在观察结束时，试验小鼠的平均体重分别为：26.5 g，39 g和36.5 g。在注射后第30天时观察存活率，AdvIL-2注射组存活率达62.5%，而AdvLuc对照组在30 d时存活率仅为25%，培养基注射组动物则在第25天时全部死亡。结论： 表明AdvIL-2用于腹水癌的治疗效果良好，具有较好前景。
, 百拇医药
《中国图书资料分类法》分类号 R730.5
The Therapeutic Effects of Recombinant hIL-2 Adenovirus on Ascites Tumors
Wei Haiyan， Zheng Changwen， Tong Jing， Sun Xueqi, Peng Xudong
(Technology Center of Sichuan Hoist Group，Chengdu 610075)
Abstract Objective: To identify the activity of recombinant hIL-2 adenovirus(AdvIL-2)， a wide variety of human tumor cell lines were transduced in vitro, and mice with ascites tumors mouse were treated with AdvIL-2. Methods: Expressed IL-2 can be measured by ELISA. The activity of expressed IL-2 was tested with MTT method. The mice were weighted everyday, and the living situation was observed. Results: AdvIL-2 can transduce a wide variety of human tumor cell line in vitro efficiently. As hight as 10 ng hIL-2 was expressed, and the expression can last 3 weeks or so. 5×108 PFU AdvIL-2 was injected i.p. to ascites mice. At the end of therapy, the average weight of AdvIL-2 injected group was lower than the AdvLuc and medium injected groups. The bodyweight were 26.5 g, 39, 36.5 g respectively. The survival rate ascites of treat group is 62.5% at 30th day, while the control group (AdvLuc injected) is 25%. Mice in medium injected group all died at 25th day. Conclusion: AdvIL-2 is effective in cancer therapy.
, 百拇医药
Key words AdvIL-2； IL-2； Math A
人白细胞介素2(IL-2)为广泛用于临床治疗的细胞因子，由于它能激活多种淋巴细胞，因此主要用于癌症的治疗。而利用AdvIL-2(重组人白介素2腺病毒)进行癌症基因治疗的报道不多。法国的Transgene公司开发的AdvIL-2 治疗胃肠道癌和肺癌，现已处于Ⅰ期临床阶段。国内第二军医大学免疫学教研室的曹雪涛，构建了AdvIL-2，体外转导人肿瘤细胞能检测到每24 h 400～2 600 U/106细胞的表达活性[1]。Cordier L.报道瘤内注射AdvIL-2小鼠肥大细胞癌，检测到每24 h 200 pg/106细胞[2]。Toloza体外转导小鼠纤维肉瘤细胞时，IL-2表达量与MOI(感染倍数)有线性关系，MOI=100～1 000时，IL-2表达量为每24 h 10～100 ng/106细胞[3]。临床及临床前实验表明，持续1周ng级的IL-2足以产生免疫调节效应[3]。本文目的在于观察所构建的AdvIL-2在多种人癌细胞中IL-2表达产量及表达周期，以及对腹水癌的治疗作用。
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1 材料与方法
1.1 AdvIL-2来源
AdvIL-2由本室构建，并已申请了国家发明专利。
1.2 AdvIL-2和AdvLuc扩增及纯化
AdvIL-2和AdvLuc扩增是在293细胞中，待大部分细胞表现出病变效应(CPE)后，收获细胞，超声波破碎细胞以释放病毒，细胞裂解液经高速离心澄清后，经2次CsCl超离心得到纯化病毒，第1次离心条件是，36 000 r/min(SW41 rotor)、离心时间为1 h，梯度组成为1.25 g/ml CsCl和1.40 g/ml CsCl，第2次离心条件是:36 000 r/min(SW41 rotor)、离心时间为18 h，将第1次离心抽取的病毒带与1.33 g/ml CsCl混合后离心，所得到的纯病毒纯度达95%以上，滴度为1011 pfu/ml。
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1.3 AdvIL-2滴度测定[4]
采用CPE法。
1.4 动物及细胞系
成年BALB/c小鼠，体重约15 g，由成都中医药大学动物实验中心提供。人肺癌细胞(A549)，人结肠癌细胞(SW480)，人宫颈癌细胞(HeLa)，鼠腹水癌细胞(Math A),CTLL-2细胞购于中国典型培养物保藏中心，由本实验室维持传代。
1.5 体外转导细胞[5]
在细胞培养板中，以MOI=100加入AdvIL-2于单层细胞上，37℃下感染2 h，加入3倍体积的培养液继续培养，24 h后，以无血清的DMEM清洗两次，换新鲜培养基常规培养。以台盼蓝染色确定细胞存活率。对于悬浮长的Math A细胞，离心收集后，以1×106/ml悬浮于感染培养基中，同上加入病毒液，清洗及悬浮于新鲜培养基培养。
, 百拇医药
1.6 IL-2 ELISA测定
由AdvIL-2转导癌细胞表达产生的IL-2利用ELISA法测定。IL-2的ELISA测定方法参照R＆D system公司的IL-2 Quantikine Assay试剂盒说明书。采用双抗夹心法。
1.7 IL-2生物活性测定[6]
IL-2活性检测采用IL-2依赖的CTLL-2细胞作为靶细胞的MTT法。
1.8 小鼠Math A转导模型
BALB/c小鼠分为3组，每组8只，每只腹腔注射1×106 Math A细胞，在接种癌细胞后第3天，分别对每组小鼠注射5×108 pfu AdvIL-2 100 μl；5×108 pfu AdvLuc 100 μl；100 μl培养基，从注射24 h起每日称量体重，并观察肿瘤发展及小鼠存活情况。
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2 结 果
2.1 AdvIL-2构建
首先将真核表达质粒CMV-mcs-polyA序列插入含有部分野生型腺病毒基因质粒的位点,再利用BamHⅠ将hIL-2 cDNA插入到穿梭质粒pAC-CMV puc18多克隆位点，得到重组hIL-2的表达载体。通过重组hIL-2的表达载体与超过包装限制的，含有全部野生型腺病毒基因质粒之间的同源重组，利用PCR法筛选产生的重组病毒，通过空斑法纯化重组病毒。
2.2 AdvIL-2表达动力学
以AdvIL-2(MOI=100)感染2 h后，测定不同天数转导细胞分泌的IL-2。转导细胞分泌的IL-2均在ng级，达到治疗用量(图1)。IL-2的表达主要集中在5～10 d，在此期间多数细胞的表达产量在10 ng/ml左右。IL-2的表达最长可维持3周左右。实验结果表明，AdvIL-2能够在体外高效转导多种癌细胞并高水平表达IL-2。
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图1 AdvIL-2 体外表达动力学
Fig.1 AdvIL-2 expression dynamics in vitro
2.3 IL-2生物学活性测定
利用IL-2依赖性的CTLL-2增殖实验测定经AdvIL-2转导后各种癌细胞所释放的IL-2，均具有生物学活性(图2)。转导细胞产生的IL-2活性大小与ELISA法测定的IL-2产量基本成正比，约为0.2 IU/pg。在5～10 d达到表达高峰期，IL-2平均产量约为2 000 IU/ml。
图2 转导肿瘤细胞表达的hIL-2活性
Fig.2 The bioactivity of the hIL-2 produced
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by transduced cell in vitro
2.4 对小鼠腹水癌的治疗作用
通过腹腔注射AdvIL-2观察AdvIL-2对小鼠腹水癌的治疗作用(图3)。注射AdvLuc和培养基小鼠在30天中的生长期平均体重增长明显大于 AdvIL-2 注射小鼠(分别从相同起始体重7.5 g增至 39 g，36.2g和 26.5g)。在30天的生长期中，注射培养基的小鼠于第25天全部死亡，注射AdvIL-2的小鼠在第30天时仍有5只存活。对所有小鼠荷瘤状况分析发现，所有注射AdvLuc和培养基的小鼠均长出腹水型肿瘤(以小鼠腹部明显增大并可抽出乳白色腹水为准)。而AdvIL-2 注射小鼠只有2只出现肿瘤(其中1只于30天死亡)。
图3 经腹腔注射AdvIL-2后小鼠的抑瘤率和延命率情况
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Fig.3 The effect on mouse ascites by i.p. injection of AdvIL-2
A: The development of tumor in each group；
B: The survival rate of each group after injection
3 讨 论
研究表明，AdvIL-2在体外高效转导人癌细胞系，能持续表达ng级的hIL-2，达到hIL-2发挥生物学效应的剂量。所表达的hIL-2高峰时间在感染后第7天表达量达12 ng/ml左右，且可持续3周表达，同时也对所释放的hIL-2作了生物学活性分析。表达的hIL-2活性的变化趋势与hIL-2表达动力学曲线基本一致，即在第7天达到最高活性为2 000 IU/ml。实验中还发现AdvIL-2在各种细胞系表达产量有所不同。在人细胞系中IL-2表达量均高于鼠细胞系，推测其原因是采用人巨细胞病毒启动子驱动的重组载体在人类细胞系中表达效率高于动物细胞系。对小鼠腹水癌治疗证实了AdvIL-2用于治疗腹水的确切疗效，注射AdvIL-2小鼠在30 d的观察期内，体重增长速度明显低于两个对照组(培养基注射组和AdvLuc注射组)，分别从同样的起始体重增加到26.5 g，36.2 g和39 g。在给药后第30天，AdvIL-2注射组存活率高达62.5%，AdvLuc治疗组存活率为25%，而培养基注射组小鼠在给药后第25天全部死亡。AdvLuc治疗组对腹水癌有一定的疗效，其原因是外源性目的基因Luc(荧火虫光化酶)表达引起宿主的免疫反应，而清除感染细胞，因此表现出一定的肿瘤抑制效应，表明注射AdvIL-2后能够控制实验小鼠腹水增加，延长荷瘤动物的生存时间，AdvIL-2对小鼠腹水癌有一定的治疗效果。今后我们将研究AdvIL-2对其它类型肿瘤的治疗作用。
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本课题受863计划生物工程领域中试开发项目(102-12-02-04)资助
魏海燕,女,28岁,助研,硕士,主要研究利用重组腺病进行基因治疗.
参 考 文 献
1，章卫平， 曹雪涛， 滨田洋文. 复制缺陷型人IL-2重组腺病毒的制备与鉴定.中华微生物学和免疫学杂志， 1998， 18(2)： 152
2，Cordier L, Duffour MT, Sabourin JC. Complete recovery of mice from a pre-established tumor by direct intratumoral delivery of an adenovirus vector harboring the murine IL-2 gene. Gene Ther， 1995， 2： 16
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3，Toloza EM, Hunt K, Swisher S, et al. in vivo cancer gene therapy with a recombinant IL-2 adenovirus vector. Cancer Gene Ther, 1996， 1: 11
4，Leimig T, High-efficiency transduction of freshly isolated human tumor cells using aclenoviral IL-2 vector. Hum Gene Ther， 1996, 7: 1233
5，Mosmann T. Rapid colorimetric assay for celluler growth and survival, applicetion to proliferation and cytotoxing assayo. J Immunol Methods， 1983, 65： 55
6，Addison CL, Braciak T, Ralston R, et al. Intratumoral injection of an adenovirus expressing IL-2 induces regression and imunity in a murine breast cancer model. Proc Nat1 Acad Sci USA, 1992, 92: 852
(2000-02-29收稿； 2000-05-12修回), http://www.100md.com
单位：魏海燕 郑常文 童晋 孙雪奇 彭旭东(四川华神集团企业技术中心 成都 610075)
关键词：AdvIL-2；IL-2；Math A
中国肿瘤生物治疗杂志000313 摘 要 目的：为鉴定已构建的重组hIL-2腺病毒(AdvIL-2)活性，在体外转导人多种癌细胞系，以及观察重组病毒对小鼠腹水癌的治疗作用。方法： 通过ELISA法测定所表达hIL-2 的量，MTT法测定所表达IL-2的活性。从注射后24 h后，每日称量试验小鼠的体重，并观察小鼠的存活情况。结果： 发现AdvIL-2在体外能高效转导多种癌细胞，并检测到有10 ng水平hIL-2表达，持续时间为3周左右。腹腔注射治疗小鼠腹水癌(Math A)，总剂量为5×108 PFU，注射AdvIL-2组小鼠腹水增加明显低于对照组：重组荧光酶腺病毒(AdvLuc)、培养基，在观察结束时，试验小鼠的平均体重分别为：26.5 g，39 g和36.5 g。在注射后第30天时观察存活率，AdvIL-2注射组存活率达62.5%，而AdvLuc对照组在30 d时存活率仅为25%，培养基注射组动物则在第25天时全部死亡。结论： 表明AdvIL-2用于腹水癌的治疗效果良好，具有较好前景。
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《中国图书资料分类法》分类号 R730.5
The Therapeutic Effects of Recombinant hIL-2 Adenovirus on Ascites Tumors
Wei Haiyan， Zheng Changwen， Tong Jing， Sun Xueqi, Peng Xudong
(Technology Center of Sichuan Hoist Group，Chengdu 610075)
Abstract Objective: To identify the activity of recombinant hIL-2 adenovirus(AdvIL-2)， a wide variety of human tumor cell lines were transduced in vitro, and mice with ascites tumors mouse were treated with AdvIL-2. Methods: Expressed IL-2 can be measured by ELISA. The activity of expressed IL-2 was tested with MTT method. The mice were weighted everyday, and the living situation was observed. Results: AdvIL-2 can transduce a wide variety of human tumor cell line in vitro efficiently. As hight as 10 ng hIL-2 was expressed, and the expression can last 3 weeks or so. 5×108 PFU AdvIL-2 was injected i.p. to ascites mice. At the end of therapy, the average weight of AdvIL-2 injected group was lower than the AdvLuc and medium injected groups. The bodyweight were 26.5 g, 39, 36.5 g respectively. The survival rate ascites of treat group is 62.5% at 30th day, while the control group (AdvLuc injected) is 25%. Mice in medium injected group all died at 25th day. Conclusion: AdvIL-2 is effective in cancer therapy.
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人白细胞介素2(IL-2)为广泛用于临床治疗的细胞因子，由于它能激活多种淋巴细胞，因此主要用于癌症的治疗。而利用AdvIL-2(重组人白介素2腺病毒)进行癌症基因治疗的报道不多。法国的Transgene公司开发的AdvIL-2 治疗胃肠道癌和肺癌，现已处于Ⅰ期临床阶段。国内第二军医大学免疫学教研室的曹雪涛，构建了AdvIL-2，体外转导人肿瘤细胞能检测到每24 h 400～2 600 U/106细胞的表达活性[1]。Cordier L.报道瘤内注射AdvIL-2小鼠肥大细胞癌，检测到每24 h 200 pg/106细胞[2]。Toloza体外转导小鼠纤维肉瘤细胞时，IL-2表达量与MOI(感染倍数)有线性关系，MOI=100～1 000时，IL-2表达量为每24 h 10～100 ng/106细胞[3]。临床及临床前实验表明，持续1周ng级的IL-2足以产生免疫调节效应[3]。本文目的在于观察所构建的AdvIL-2在多种人癌细胞中IL-2表达产量及表达周期，以及对腹水癌的治疗作用。
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1 材料与方法
1.1 AdvIL-2来源
AdvIL-2由本室构建，并已申请了国家发明专利。
1.2 AdvIL-2和AdvLuc扩增及纯化
AdvIL-2和AdvLuc扩增是在293细胞中，待大部分细胞表现出病变效应(CPE)后，收获细胞，超声波破碎细胞以释放病毒，细胞裂解液经高速离心澄清后，经2次CsCl超离心得到纯化病毒，第1次离心条件是，36 000 r/min(SW41 rotor)、离心时间为1 h，梯度组成为1.25 g/ml CsCl和1.40 g/ml CsCl，第2次离心条件是:36 000 r/min(SW41 rotor)、离心时间为18 h，将第1次离心抽取的病毒带与1.33 g/ml CsCl混合后离心，所得到的纯病毒纯度达95%以上，滴度为1011 pfu/ml。
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1.3 AdvIL-2滴度测定[4]
采用CPE法。
1.4 动物及细胞系
成年BALB/c小鼠，体重约15 g，由成都中医药大学动物实验中心提供。人肺癌细胞(A549)，人结肠癌细胞(SW480)，人宫颈癌细胞(HeLa)，鼠腹水癌细胞(Math A),CTLL-2细胞购于中国典型培养物保藏中心，由本实验室维持传代。
1.5 体外转导细胞[5]
在细胞培养板中，以MOI=100加入AdvIL-2于单层细胞上，37℃下感染2 h，加入3倍体积的培养液继续培养，24 h后，以无血清的DMEM清洗两次，换新鲜培养基常规培养。以台盼蓝染色确定细胞存活率。对于悬浮长的Math A细胞，离心收集后，以1×106/ml悬浮于感染培养基中，同上加入病毒液，清洗及悬浮于新鲜培养基培养。
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1.6 IL-2 ELISA测定
由AdvIL-2转导癌细胞表达产生的IL-2利用ELISA法测定。IL-2的ELISA测定方法参照R＆D system公司的IL-2 Quantikine Assay试剂盒说明书。采用双抗夹心法。
1.7 IL-2生物活性测定[6]
IL-2活性检测采用IL-2依赖的CTLL-2细胞作为靶细胞的MTT法。
1.8 小鼠Math A转导模型
BALB/c小鼠分为3组，每组8只，每只腹腔注射1×106 Math A细胞，在接种癌细胞后第3天，分别对每组小鼠注射5×108 pfu AdvIL-2 100 μl；5×108 pfu AdvLuc 100 μl；100 μl培养基，从注射24 h起每日称量体重，并观察肿瘤发展及小鼠存活情况。
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2 结 果
2.1 AdvIL-2构建
首先将真核表达质粒CMV-mcs-polyA序列插入含有部分野生型腺病毒基因质粒的位点,再利用BamHⅠ将hIL-2 cDNA插入到穿梭质粒pAC-CMV puc18多克隆位点，得到重组hIL-2的表达载体。通过重组hIL-2的表达载体与超过包装限制的，含有全部野生型腺病毒基因质粒之间的同源重组，利用PCR法筛选产生的重组病毒，通过空斑法纯化重组病毒。
2.2 AdvIL-2表达动力学
以AdvIL-2(MOI=100)感染2 h后，测定不同天数转导细胞分泌的IL-2。转导细胞分泌的IL-2均在ng级，达到治疗用量(图1)。IL-2的表达主要集中在5～10 d，在此期间多数细胞的表达产量在10 ng/ml左右。IL-2的表达最长可维持3周左右。实验结果表明，AdvIL-2能够在体外高效转导多种癌细胞并高水平表达IL-2。
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图1 AdvIL-2 体外表达动力学
Fig.1 AdvIL-2 expression dynamics in vitro
2.3 IL-2生物学活性测定
利用IL-2依赖性的CTLL-2增殖实验测定经AdvIL-2转导后各种癌细胞所释放的IL-2，均具有生物学活性(图2)。转导细胞产生的IL-2活性大小与ELISA法测定的IL-2产量基本成正比，约为0.2 IU/pg。在5～10 d达到表达高峰期，IL-2平均产量约为2 000 IU/ml。
图2 转导肿瘤细胞表达的hIL-2活性
Fig.2 The bioactivity of the hIL-2 produced
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2.4 对小鼠腹水癌的治疗作用
通过腹腔注射AdvIL-2观察AdvIL-2对小鼠腹水癌的治疗作用(图3)。注射AdvLuc和培养基小鼠在30天中的生长期平均体重增长明显大于 AdvIL-2 注射小鼠(分别从相同起始体重7.5 g增至 39 g，36.2g和 26.5g)。在30天的生长期中，注射培养基的小鼠于第25天全部死亡，注射AdvIL-2的小鼠在第30天时仍有5只存活。对所有小鼠荷瘤状况分析发现，所有注射AdvLuc和培养基的小鼠均长出腹水型肿瘤(以小鼠腹部明显增大并可抽出乳白色腹水为准)。而AdvIL-2 注射小鼠只有2只出现肿瘤(其中1只于30天死亡)。
图3 经腹腔注射AdvIL-2后小鼠的抑瘤率和延命率情况
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Fig.3 The effect on mouse ascites by i.p. injection of AdvIL-2
A: The development of tumor in each group；
B: The survival rate of each group after injection
3 讨 论
研究表明，AdvIL-2在体外高效转导人癌细胞系，能持续表达ng级的hIL-2，达到hIL-2发挥生物学效应的剂量。所表达的hIL-2高峰时间在感染后第7天表达量达12 ng/ml左右，且可持续3周表达，同时也对所释放的hIL-2作了生物学活性分析。表达的hIL-2活性的变化趋势与hIL-2表达动力学曲线基本一致，即在第7天达到最高活性为2 000 IU/ml。实验中还发现AdvIL-2在各种细胞系表达产量有所不同。在人细胞系中IL-2表达量均高于鼠细胞系，推测其原因是采用人巨细胞病毒启动子驱动的重组载体在人类细胞系中表达效率高于动物细胞系。对小鼠腹水癌治疗证实了AdvIL-2用于治疗腹水的确切疗效，注射AdvIL-2小鼠在30 d的观察期内，体重增长速度明显低于两个对照组(培养基注射组和AdvLuc注射组)，分别从同样的起始体重增加到26.5 g，36.2 g和39 g。在给药后第30天，AdvIL-2注射组存活率高达62.5%，AdvLuc治疗组存活率为25%，而培养基注射组小鼠在给药后第25天全部死亡。AdvLuc治疗组对腹水癌有一定的疗效，其原因是外源性目的基因Luc(荧火虫光化酶)表达引起宿主的免疫反应，而清除感染细胞，因此表现出一定的肿瘤抑制效应，表明注射AdvIL-2后能够控制实验小鼠腹水增加，延长荷瘤动物的生存时间，AdvIL-2对小鼠腹水癌有一定的治疗效果。今后我们将研究AdvIL-2对其它类型肿瘤的治疗作用。
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魏海燕,女,28岁,助研,硕士,主要研究利用重组腺病进行基因治疗.
参 考 文 献
1，章卫平， 曹雪涛， 滨田洋文. 复制缺陷型人IL-2重组腺病毒的制备与鉴定.中华微生物学和免疫学杂志， 1998， 18(2)： 152
2，Cordier L, Duffour MT, Sabourin JC. Complete recovery of mice from a pre-established tumor by direct intratumoral delivery of an adenovirus vector harboring the murine IL-2 gene. Gene Ther， 1995， 2： 16
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3，Toloza EM, Hunt K, Swisher S, et al. in vivo cancer gene therapy with a recombinant IL-2 adenovirus vector. Cancer Gene Ther, 1996， 1: 11
4，Leimig T, High-efficiency transduction of freshly isolated human tumor cells using aclenoviral IL-2 vector. Hum Gene Ther， 1996, 7: 1233
5，Mosmann T. Rapid colorimetric assay for celluler growth and survival, applicetion to proliferation and cytotoxing assayo. J Immunol Methods， 1983, 65： 55
6，Addison CL, Braciak T, Ralston R, et al. Intratumoral injection of an adenovirus expressing IL-2 induces regression and imunity in a murine breast cancer model. Proc Nat1 Acad Sci USA, 1992, 92: 852
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