GM-CSF及B7-1基因修饰的肿瘤细胞疫苗抗肿瘤的研究
作者：张清媛 李殿俊 王志华 张春艳
单位：张清媛 李殿俊 王志华 张春艳(哈尔滨医科大学肿瘤研究所 哈尔滨 150040)
关键词：GM-CSF；B7-1(CD80)；肿瘤疫苗；基因治疗
中国肿瘤生物治疗杂志000311 摘 要 目的： 研究GM-CSF及B7-1基因修饰的肿瘤细胞作为瘤苗的有效性。方法: 我们将小鼠GM-CSF及CD80基因通过逆转录病毒载体分别导入EL-4淋巴瘤细胞中，进而研究了EL-4/GM-CSF及EL-4/B7-1在同系C57BL/6小鼠中的成瘤性及其诱导抗肿瘤免疫的效果。结果： 转B7-1基因的肿瘤细胞诱发了CD80的高表达。转基因的肿瘤细胞在同源小鼠中的成瘤性下降，免疫原性增强。在肿瘤生长的早期对实验性荷瘤小鼠进行治疗，基因修饰的瘤苗作用明显增强，而在肿瘤生长的晚期未能显示出明显的治疗作用。射线灭活的EL-4/GM-CSF瘤苗能有效地保护野生型肿瘤细胞的攻击, 而射线灭活的EL-4/B7-1瘤苗作用减弱。将EL-4/GM-CSF和EL-4/B7-1瘤苗联合应用具有协同抗肿瘤效果。结论： GM-CSF及B7-1基因修饰的肿瘤疫苗可诱导抗肿瘤免疫反应，导致肿瘤的部分根除，此两种瘤苗联合应用效果更佳。
, 百拇医药
《中国图书资料分类法》分类号 R732.54
Anti-Tumor Effect of GM-CSF Gene or B7-1 Gene Modified Murine EL-4 Cell Vaccine
Zhang Qingyuan, Li Dianjun, Wang Zhihua, Zhang Cunyan
(Cancer Research Institute of Harbin Medical University, Harbin 150040)
Abstract Objective: To investigate the vaccine potency of GM-CSF or B7-1 gene-modified tumor cells. Methods: The EL-4 lymphoma cells were transduced with recombinant retrovirus containing the murine GM-CSF gene or B7-1 gene, respectively. Results: Flow cytometry analysis showed that expression of their surface marker between wild-type EL-4 cells and gene transduced tumor cells was the same except for CD80 positive in B7-1 gene transduced cells. GM-CSF gene or B7-1 gene transduced EL-4 cells resulted in remarkable loss of tumorigenicity in syngenetic mice. The systemic protective immunity was induced against the challenge with EL-4/wt cells. Therapeutic vaccine with EL-4/GM-CSF or EL-4/B7-1 cells could retard the growth of established early-stage EL-4/wt tumor significantly, but not retard the growth of late-stage EL-4/wt tumor. Irradiated GM-CSF gene transduced EL-4 cells showed strong vaccine effect against challenged EL-4 cells, but irradiated B7-1 gene transduced EL-4 cells showed weak vaccine effect. Remarkable cooperative anti-tumor effect against challenged EL-4 cells was observed when both irradiated EL-4/GM-CSF and EL-4/B7-1 were inoculated together. Conclusion: GM-CSF gene or B7-1 gene transduced EL-4 cells can be used as a good tumor vaccine. It suggested that the combination of the two kinds of vaccine has potential application value in human cancer treatment.
, 百拇医药
Key words GM-CSF; B7-1(CD80); tumor vaccine; gene therapy
自90年代起开展了基因修饰的肿瘤疫苗的研究，许多文献报道，通过将一些对免疫功能具有调节作用的细胞因子及共刺激因子转入肿瘤细胞后制成肿瘤疫苗，可以有效地激活机体的抗肿瘤免疫反应[1,2]。本文分别将GM-CSF及B7-1基因转入鼠胸腺淋巴瘤细胞内以观察转基因的肿瘤细胞作为瘤苗激发宿主抗癌免疫的功能。
1 材料与方法
1.1 实验材料
雌性C57BL/6小鼠，购于中国医学科学院实验动物中心，所有实验均用8～12周龄的小鼠。EL-4胸腺淋巴瘤细胞从美国ATCC(Rochville,MD)获得，常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中。ΨCRIP-MFG鼠GM-CSF和CD80细胞系由日本东京大学医科院研究所提供，此重组逆转录病毒产生细胞在含有10%胎牛血清的DMEM培养液中常规培养。
, 百拇医药
1.2 基因转导
对数生长的EL-4细胞，分别加入转染了MFG-GM-CSF-Neu及MFG-CD80-Neu的包装细胞培养液上清，培养24～48 h，加入G418(800 μg/ml)继续培养12 d，得到转GM-CSF和B7-1基因的EL-4细胞株，应用有限稀释法和G418(800 μg/ml)筛选法进一步克隆高表达的EL-4/GM-CSF细胞和EL-4/B7-1细胞。
1.3 GM-CSF分泌水平测定与细胞表面标志分析
通过酶联免疫吸附实验(ELISA)方法测EL-4/GM-CSF细胞的GM-CSF表达量。EL-4/Wt及转基因肿瘤细胞经FITC联接的抗CD80，抗H-2Kb，抗H-2Db，抗IAb单克隆抗体作用后,用流式细胞仪检测细胞的CD80，MHCⅠ类和MHCⅡ类抗原的表达。
, 百拇医药
1.4 病毒转化细胞的体外增殖
分别取EL-4/Wt，EL-4/Neu, EL-4/B7-1和EL-4/GM-CSF细胞各1×104，微孔板培养6 d，MTT法测定每天细胞的增殖情况。
1.5 肿瘤原性测定
分别将1×105 EL-4/Wt，EL-4/Neu，EL-4/B7-1, EL-4/GM-CSF细胞注射于4组同系C57BL/6小鼠右侧背部皮下(每组10只)，观察肿瘤出现(直径约大于2 mm)的时间，每2 d用游标卡尺进行测量，肿瘤结节大小以肿瘤最大径×最小径的平方除以2计算。 28 d后,将1×105 EL-4/Wt细胞经皮下注射入接种了EL-4/GM-CSF或EL-4/B7-1细胞而未长出肿瘤的实验小鼠的左侧背部，观察是否有肿瘤出现。
, 百拇医药 1.6 转基因肿瘤细胞的实验性治疗
将1×105 EL-4/Wt肿瘤细胞皮下接种于6组(每组10只)小鼠的右侧背部(第0天),经亚致死量(5 000 rad)γ-射线照射的1×105 EL-4/Wt，EL-4/B7-1, EL-4/GM-CSF瘤苗在肿瘤生长的早期(第3， 6, 9天)及晚期(第14， 17， 20天)分3次分别注射于上述荷瘤小鼠的腹部皮下，观察肿瘤的生长情况及小鼠的生存时间。
1.7 转基因肿瘤细胞的免疫保护实验
将5×105 EL-4/Wt，EL-4/B7-1, EL-4/GM-CSF活细胞及射线灭活的EL-4/Wt, EL-4/B7-1, EL-4/GM-CSF瘤苗分别注射于6组(每组10只)小鼠的左侧背部皮下，14 d后再将3×105 EL-4/Wt细胞接种于小鼠的右侧背部皮下，再次攻击之日定为第0天，观察肿瘤的生长情况及小鼠的生存时间。
, 百拇医药
1.8 L-4/GM-CSF和EL-4/B7-1联合抗肿瘤免疫效应
两种经射线灭活的EL-4/Wt，EL-4/GM-CSF，EL-4/B7-1瘤苗按1∶1混合(每种2.5×105)，接种小鼠的左侧胁部皮下，14 d后，用3×105非照射的EL-4/Wt细胞再次接种于鼠的右侧胁部皮下，测量肿瘤的大小并观察小鼠的生存情况，将照射灭活的EL-4/Wt，EL-4/GM-CSF，EL-4/B7-1每种肿瘤疫苗的量提高到5×106按1∶1混合进行免疫，14 d后用1×106 EL-4/Wt细胞再次接种，再次接种之日定为第0天，观察肿瘤的生长及消退情况，总计100 d。
以上实验均重复2次，所有用于再次攻击的细胞均经台盼蓝染色证实95%以上为活细胞。
2 结 果
, 百拇医药
2.1 转基因EL-4细胞株的建立
转基因肿瘤细胞在体外培养中的形态、生长速度与其亲代细胞相同，流式细胞分析表明，转基因肿瘤细胞表面MHCⅠ类抗原H-2Kb，H-2Db表达为阳性，MHCⅡ类抗原Ⅰ-Ab表达为阴性，与亲代细胞相同，仅转B7-1基因的肿瘤细胞诱发了CD80的高表达，经ELISA方法检测EL-4/GM-CSF表达量每24 h为24 ng/106细胞。
2.2 转基因肿瘤细胞的成瘤性
将EL-4/Wt，EL-4/Neu肿瘤细胞接种于小鼠皮下，100%成瘤。而接种同样量EL-4/B7-1, EL-4/GM-CSF细胞的鼠肿瘤检出时间延长，生长速度减慢，大约50%小鼠能无瘤生存, 3只接种EL-4/GM-CSF细胞的小鼠在最初10 d长出肿瘤，但在接种后20 d肿瘤开始消退, 说明机体产生了抗肿瘤的免疫反应,(图1)。28 d后，再将1×105 EL-4/Wt细胞分别经皮下注射于接种EL-4/GM-CSF细胞而未长出肿瘤的9只小鼠左侧背部，未见肿瘤生长, 注射于接种EL-4/B7-1细胞而未长出肿瘤的10只小鼠左侧背部，有5只小鼠未见肿瘤生长。
, 百拇医药
图1 转GM-CSF基因及转CD80基因的EL-4
肿瘤细胞成瘤性下降
Fig. 1 GM-CSF gene or CD80 gene transduced EL-4 cell
resultedin remarkable loss of tumorigenesis
2.3 转基因肿瘤细胞的实验性治疗作用
在肿瘤生长早期进行治疗，能有效地延长荷瘤宿主的存活时间，用EL-4/B7-1, EL-4/GM-CSF瘤苗进行治疗的中位生存期分别是(30.4±1.8)d和(33.1±1.8)d明显优于用野生型瘤苗进行治疗[中位生存期(23.2±1.5)d],有显著统计学差异(P<0.01)；在肿瘤生长的晚期进行治疗，荷瘤小鼠中位生存期EL-4/Wt 组(19.4±1.7)d, EL-4/B7-1组(20.8±1.5)d, EL-4/GM-CSF组(20.1±2.1)d, 未能显示出明显治疗作用。
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2.4 转基因肿瘤细胞在同源小鼠内的疫苗作用
分别用EL-4/Wt，EL-4/B7-1, EL-4/GM-CSF活细胞及射线灭活的瘤苗免疫小鼠(每组总计20只)，14 d后再用EL-4/Wt细胞再次攻击。用EL-4/Wt活疫苗或灭活疫苗免疫的小鼠,每组均存活4只;用EL-4/B7-1活疫苗免疫的小鼠有9只存活,而用EL-4/B7-1灭活疫苗免疫的小鼠仅有4只存活; 用EL-4/GM-CSF活疫苗免疫的小鼠有12只存活,用EL-4/GM-CSF灭活疫苗免疫的小鼠有11只存活,可见转GM-CSF及B7-1基因的肿瘤细胞疫苗作用明显增强。灭活的EL-4/GM-CSF瘤苗显示出强的保护性作用，而灭活的EL-4/B7-1瘤苗保护性作用减弱。
2.5 EL-4/GM-CSF和EL-4/B7-1联合接种增加抗肿瘤免疫效果
EL-4/GM-CSF和EL-4/B7-1瘤苗联合接种组小鼠的生存率(低剂量组15/20, 高剂量组11/20)优于EL-4/Wt+EL-4/GM-CSF组小鼠的生存率(低剂量组7/20, 高剂量组5/20)及EL-4/Wt+EL-4/B7-1组的生存率(低剂量组3/20, 高剂量组2/20)。经χ2检验，3组间有显著统计学差异(P<0.05),接种EL-4/GM-CSF+EL-4/B7-1瘤苗动物的肿瘤生长也明显减慢。
, http://www.100md.com
3 讨 论
肿瘤细胞的抗原性较弱，通常不能有效地激活机体的免疫反应，通过向肿瘤细胞内转导GM-CSF基因肿瘤细胞免疫原性得到增强，使免疫系统更易于识别[3]。GM-CSF具有激活专职APC的作用，使抗原特异的辅助T淋巴细胞和抗肿瘤效应细胞增生,在体内能激活较强的抗肿瘤免疫反应[4]。
许多肿瘤细胞表面缺乏共刺激分子的表达，是肿瘤细胞能够逃避机体免疫防御系统的原因之一。本研究表明，B7-1基因修饰的肿瘤细胞可以诱导机体产生抗肿瘤免疫应答，且一旦机体产生了针对肿瘤抗原的免疫，其效应过程可以不需要B7-1分子的参与。
转GM-CSF及B7-1基因的瘤苗在肿瘤生长的早期进行治疗，可有效地延长荷瘤宿主的存活时间。说明在肿瘤生长的早期并没有使机体产生免疫无反应性，或者是B7-1的存在所提供的协同刺激及GM-CSF的刺激增加了APC对肿瘤抗原的提呈,打破了机体已存在的免疫无反应性，可获得比较理想的治疗效果。而在肿瘤生长的晚期进行治疗，未能显示出明显的治疗作用，说明在肿瘤高负荷状态下，机体处于一种免疫无反应状态，对一些免疫治疗效果极差。
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转GM-CSF基因的肿瘤细胞疫苗作用最强，原因是能通过激活CD4+ T细胞和CD8+ T细胞来介导较强的抗肿瘤免疫反应。转B7-1基因的肿瘤细胞主要通过CD8+CTL介导抗肿瘤免疫反应，缺乏CD4+辅助T细胞的激活[5]，效果次之，GM-CSF基因转导的EL-4细胞无论是活疫苗，还是死疫苗均能提高机体的保护性免疫，原因可能是转基因后肿瘤细胞的抗原性得到了增强，经5 000 rad亚致死量射线照射后肿瘤细胞停止分裂增殖，但还需经历一段时间逐渐走向死亡。GM-CSF分泌量虽有下降，但仍足以诱导机体的保护性免疫反应。B7-1基因转导的EL-4活疫苗能增加保护性免疫，但经射线照射后效果减低，其确切机制尚不清楚。
EL-4/GM-CSF和EL-4/B7-1瘤苗联合应用具有协同抗肿瘤免疫效果，其机理可能是GM-CSF基因转导的瘤苗主要通过APC介导的间接途径影响辅助T淋巴细胞进而激活CTL，而B7-1基因转导的瘤苗是通过直接途径影响CTL[6]，同时也说明尽管B7-1基因转导的瘤苗GM-CSF基因转导的瘤苗共同接种能激活机体较强的免疫反应，是一种很有前景的肿瘤疫苗。
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总之，转GM-CSF基因及转B7-1基因的肿瘤疫苗可诱发系统性抗肿瘤免疫反应，导致肿瘤的部分根除，转GM-CSF及转B7-1基因的瘤苗联合应用效果最佳。
本课题受黑龙江省自然科学基金项目资助
张清媛,女,35岁,博士副教授,主要从事肿瘤化疗及肿瘤免疫方面的研究.
参 考 文 献
1，Morita T, Ikeda K, Douzona M, et al. Tumor vaccination with mac-rophage colony-stimulating factor-producing Lewis lung carcinoma in mice. Blood, 1996, 88: 955
2，Hellstrom KE, Hellstrom I, Chen L. Can co-stimulated tumor immunity be therapeutically efficacious. Immunol Rev, 1995, 145: 123
, 百拇医药
3，Wakimoto H, Abe J, Tsunoda R, et al. Intensified antitumor immunity by a cancer vaccine that produces granulocyte-macrophage colony-stimulating facter plus interleukin 4. Cancer Res, 1996, 56: 1828
4，Lu L, Hsieh M, Oriss TB, et al. Generation of DC from mouse spleen cell culture in response to GM-CSF: Immunophenotypic and functional analyses. Immunology, 1995, 84: 127
5，Ding L， Shevach EM. Activation of CD4+ T cells by delivery of the B7-1 costimulatory signal on bystander antigen-presenting cells (trans-costimulation). Eur J Immunol, 1994, 24: 859
6，Nakazaki Y, Tani K, Lin ZT, et al. Vaccine effect of granulocyte-macrophage colony-stimulating facter or CD80 gene transduced murine leukemia/lyphoma cells and their cooperative enhancement of antitumor immunity. Gene Ther, 1998, 5(10): 1355
(2000-05-02收稿； 2000-08-18修回), http://www.100md.com
单位：张清媛 李殿俊 王志华 张春艳(哈尔滨医科大学肿瘤研究所 哈尔滨 150040)
关键词：GM-CSF；B7-1(CD80)；肿瘤疫苗；基因治疗
中国肿瘤生物治疗杂志000311 摘 要 目的： 研究GM-CSF及B7-1基因修饰的肿瘤细胞作为瘤苗的有效性。方法: 我们将小鼠GM-CSF及CD80基因通过逆转录病毒载体分别导入EL-4淋巴瘤细胞中，进而研究了EL-4/GM-CSF及EL-4/B7-1在同系C57BL/6小鼠中的成瘤性及其诱导抗肿瘤免疫的效果。结果： 转B7-1基因的肿瘤细胞诱发了CD80的高表达。转基因的肿瘤细胞在同源小鼠中的成瘤性下降，免疫原性增强。在肿瘤生长的早期对实验性荷瘤小鼠进行治疗，基因修饰的瘤苗作用明显增强，而在肿瘤生长的晚期未能显示出明显的治疗作用。射线灭活的EL-4/GM-CSF瘤苗能有效地保护野生型肿瘤细胞的攻击, 而射线灭活的EL-4/B7-1瘤苗作用减弱。将EL-4/GM-CSF和EL-4/B7-1瘤苗联合应用具有协同抗肿瘤效果。结论： GM-CSF及B7-1基因修饰的肿瘤疫苗可诱导抗肿瘤免疫反应，导致肿瘤的部分根除，此两种瘤苗联合应用效果更佳。
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Anti-Tumor Effect of GM-CSF Gene or B7-1 Gene Modified Murine EL-4 Cell Vaccine
Zhang Qingyuan, Li Dianjun, Wang Zhihua, Zhang Cunyan
(Cancer Research Institute of Harbin Medical University, Harbin 150040)
Abstract Objective: To investigate the vaccine potency of GM-CSF or B7-1 gene-modified tumor cells. Methods: The EL-4 lymphoma cells were transduced with recombinant retrovirus containing the murine GM-CSF gene or B7-1 gene, respectively. Results: Flow cytometry analysis showed that expression of their surface marker between wild-type EL-4 cells and gene transduced tumor cells was the same except for CD80 positive in B7-1 gene transduced cells. GM-CSF gene or B7-1 gene transduced EL-4 cells resulted in remarkable loss of tumorigenicity in syngenetic mice. The systemic protective immunity was induced against the challenge with EL-4/wt cells. Therapeutic vaccine with EL-4/GM-CSF or EL-4/B7-1 cells could retard the growth of established early-stage EL-4/wt tumor significantly, but not retard the growth of late-stage EL-4/wt tumor. Irradiated GM-CSF gene transduced EL-4 cells showed strong vaccine effect against challenged EL-4 cells, but irradiated B7-1 gene transduced EL-4 cells showed weak vaccine effect. Remarkable cooperative anti-tumor effect against challenged EL-4 cells was observed when both irradiated EL-4/GM-CSF and EL-4/B7-1 were inoculated together. Conclusion: GM-CSF gene or B7-1 gene transduced EL-4 cells can be used as a good tumor vaccine. It suggested that the combination of the two kinds of vaccine has potential application value in human cancer treatment.
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Key words GM-CSF; B7-1(CD80); tumor vaccine; gene therapy
自90年代起开展了基因修饰的肿瘤疫苗的研究，许多文献报道，通过将一些对免疫功能具有调节作用的细胞因子及共刺激因子转入肿瘤细胞后制成肿瘤疫苗，可以有效地激活机体的抗肿瘤免疫反应[1,2]。本文分别将GM-CSF及B7-1基因转入鼠胸腺淋巴瘤细胞内以观察转基因的肿瘤细胞作为瘤苗激发宿主抗癌免疫的功能。
1 材料与方法
1.1 实验材料
雌性C57BL/6小鼠，购于中国医学科学院实验动物中心，所有实验均用8～12周龄的小鼠。EL-4胸腺淋巴瘤细胞从美国ATCC(Rochville,MD)获得，常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中。ΨCRIP-MFG鼠GM-CSF和CD80细胞系由日本东京大学医科院研究所提供，此重组逆转录病毒产生细胞在含有10%胎牛血清的DMEM培养液中常规培养。
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1.2 基因转导
对数生长的EL-4细胞，分别加入转染了MFG-GM-CSF-Neu及MFG-CD80-Neu的包装细胞培养液上清，培养24～48 h，加入G418(800 μg/ml)继续培养12 d，得到转GM-CSF和B7-1基因的EL-4细胞株，应用有限稀释法和G418(800 μg/ml)筛选法进一步克隆高表达的EL-4/GM-CSF细胞和EL-4/B7-1细胞。
1.3 GM-CSF分泌水平测定与细胞表面标志分析
通过酶联免疫吸附实验(ELISA)方法测EL-4/GM-CSF细胞的GM-CSF表达量。EL-4/Wt及转基因肿瘤细胞经FITC联接的抗CD80，抗H-2Kb，抗H-2Db，抗IAb单克隆抗体作用后,用流式细胞仪检测细胞的CD80，MHCⅠ类和MHCⅡ类抗原的表达。
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1.4 病毒转化细胞的体外增殖
分别取EL-4/Wt，EL-4/Neu, EL-4/B7-1和EL-4/GM-CSF细胞各1×104，微孔板培养6 d，MTT法测定每天细胞的增殖情况。
1.5 肿瘤原性测定
分别将1×105 EL-4/Wt，EL-4/Neu，EL-4/B7-1, EL-4/GM-CSF细胞注射于4组同系C57BL/6小鼠右侧背部皮下(每组10只)，观察肿瘤出现(直径约大于2 mm)的时间，每2 d用游标卡尺进行测量，肿瘤结节大小以肿瘤最大径×最小径的平方除以2计算。 28 d后,将1×105 EL-4/Wt细胞经皮下注射入接种了EL-4/GM-CSF或EL-4/B7-1细胞而未长出肿瘤的实验小鼠的左侧背部，观察是否有肿瘤出现。
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将1×105 EL-4/Wt肿瘤细胞皮下接种于6组(每组10只)小鼠的右侧背部(第0天),经亚致死量(5 000 rad)γ-射线照射的1×105 EL-4/Wt，EL-4/B7-1, EL-4/GM-CSF瘤苗在肿瘤生长的早期(第3， 6, 9天)及晚期(第14， 17， 20天)分3次分别注射于上述荷瘤小鼠的腹部皮下，观察肿瘤的生长情况及小鼠的生存时间。
1.7 转基因肿瘤细胞的免疫保护实验
将5×105 EL-4/Wt，EL-4/B7-1, EL-4/GM-CSF活细胞及射线灭活的EL-4/Wt, EL-4/B7-1, EL-4/GM-CSF瘤苗分别注射于6组(每组10只)小鼠的左侧背部皮下，14 d后再将3×105 EL-4/Wt细胞接种于小鼠的右侧背部皮下，再次攻击之日定为第0天，观察肿瘤的生长情况及小鼠的生存时间。
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1.8 L-4/GM-CSF和EL-4/B7-1联合抗肿瘤免疫效应
两种经射线灭活的EL-4/Wt，EL-4/GM-CSF，EL-4/B7-1瘤苗按1∶1混合(每种2.5×105)，接种小鼠的左侧胁部皮下，14 d后，用3×105非照射的EL-4/Wt细胞再次接种于鼠的右侧胁部皮下，测量肿瘤的大小并观察小鼠的生存情况，将照射灭活的EL-4/Wt，EL-4/GM-CSF，EL-4/B7-1每种肿瘤疫苗的量提高到5×106按1∶1混合进行免疫，14 d后用1×106 EL-4/Wt细胞再次接种，再次接种之日定为第0天，观察肿瘤的生长及消退情况，总计100 d。
以上实验均重复2次，所有用于再次攻击的细胞均经台盼蓝染色证实95%以上为活细胞。
2 结 果
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2.1 转基因EL-4细胞株的建立
转基因肿瘤细胞在体外培养中的形态、生长速度与其亲代细胞相同，流式细胞分析表明，转基因肿瘤细胞表面MHCⅠ类抗原H-2Kb，H-2Db表达为阳性，MHCⅡ类抗原Ⅰ-Ab表达为阴性，与亲代细胞相同，仅转B7-1基因的肿瘤细胞诱发了CD80的高表达，经ELISA方法检测EL-4/GM-CSF表达量每24 h为24 ng/106细胞。
2.2 转基因肿瘤细胞的成瘤性
将EL-4/Wt，EL-4/Neu肿瘤细胞接种于小鼠皮下，100%成瘤。而接种同样量EL-4/B7-1, EL-4/GM-CSF细胞的鼠肿瘤检出时间延长，生长速度减慢，大约50%小鼠能无瘤生存, 3只接种EL-4/GM-CSF细胞的小鼠在最初10 d长出肿瘤，但在接种后20 d肿瘤开始消退, 说明机体产生了抗肿瘤的免疫反应,(图1)。28 d后，再将1×105 EL-4/Wt细胞分别经皮下注射于接种EL-4/GM-CSF细胞而未长出肿瘤的9只小鼠左侧背部，未见肿瘤生长, 注射于接种EL-4/B7-1细胞而未长出肿瘤的10只小鼠左侧背部，有5只小鼠未见肿瘤生长。
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图1 转GM-CSF基因及转CD80基因的EL-4
肿瘤细胞成瘤性下降
Fig. 1 GM-CSF gene or CD80 gene transduced EL-4 cell
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2.3 转基因肿瘤细胞的实验性治疗作用
在肿瘤生长早期进行治疗，能有效地延长荷瘤宿主的存活时间，用EL-4/B7-1, EL-4/GM-CSF瘤苗进行治疗的中位生存期分别是(30.4±1.8)d和(33.1±1.8)d明显优于用野生型瘤苗进行治疗[中位生存期(23.2±1.5)d],有显著统计学差异(P<0.01)；在肿瘤生长的晚期进行治疗，荷瘤小鼠中位生存期EL-4/Wt 组(19.4±1.7)d, EL-4/B7-1组(20.8±1.5)d, EL-4/GM-CSF组(20.1±2.1)d, 未能显示出明显治疗作用。
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2.4 转基因肿瘤细胞在同源小鼠内的疫苗作用
分别用EL-4/Wt，EL-4/B7-1, EL-4/GM-CSF活细胞及射线灭活的瘤苗免疫小鼠(每组总计20只)，14 d后再用EL-4/Wt细胞再次攻击。用EL-4/Wt活疫苗或灭活疫苗免疫的小鼠,每组均存活4只;用EL-4/B7-1活疫苗免疫的小鼠有9只存活,而用EL-4/B7-1灭活疫苗免疫的小鼠仅有4只存活; 用EL-4/GM-CSF活疫苗免疫的小鼠有12只存活,用EL-4/GM-CSF灭活疫苗免疫的小鼠有11只存活,可见转GM-CSF及B7-1基因的肿瘤细胞疫苗作用明显增强。灭活的EL-4/GM-CSF瘤苗显示出强的保护性作用，而灭活的EL-4/B7-1瘤苗保护性作用减弱。
2.5 EL-4/GM-CSF和EL-4/B7-1联合接种增加抗肿瘤免疫效果
EL-4/GM-CSF和EL-4/B7-1瘤苗联合接种组小鼠的生存率(低剂量组15/20, 高剂量组11/20)优于EL-4/Wt+EL-4/GM-CSF组小鼠的生存率(低剂量组7/20, 高剂量组5/20)及EL-4/Wt+EL-4/B7-1组的生存率(低剂量组3/20, 高剂量组2/20)。经χ2检验，3组间有显著统计学差异(P<0.05),接种EL-4/GM-CSF+EL-4/B7-1瘤苗动物的肿瘤生长也明显减慢。
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3 讨 论
肿瘤细胞的抗原性较弱，通常不能有效地激活机体的免疫反应，通过向肿瘤细胞内转导GM-CSF基因肿瘤细胞免疫原性得到增强，使免疫系统更易于识别[3]。GM-CSF具有激活专职APC的作用，使抗原特异的辅助T淋巴细胞和抗肿瘤效应细胞增生,在体内能激活较强的抗肿瘤免疫反应[4]。
许多肿瘤细胞表面缺乏共刺激分子的表达，是肿瘤细胞能够逃避机体免疫防御系统的原因之一。本研究表明，B7-1基因修饰的肿瘤细胞可以诱导机体产生抗肿瘤免疫应答，且一旦机体产生了针对肿瘤抗原的免疫，其效应过程可以不需要B7-1分子的参与。
转GM-CSF及B7-1基因的瘤苗在肿瘤生长的早期进行治疗，可有效地延长荷瘤宿主的存活时间。说明在肿瘤生长的早期并没有使机体产生免疫无反应性，或者是B7-1的存在所提供的协同刺激及GM-CSF的刺激增加了APC对肿瘤抗原的提呈,打破了机体已存在的免疫无反应性，可获得比较理想的治疗效果。而在肿瘤生长的晚期进行治疗，未能显示出明显的治疗作用，说明在肿瘤高负荷状态下，机体处于一种免疫无反应状态，对一些免疫治疗效果极差。
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转GM-CSF基因的肿瘤细胞疫苗作用最强，原因是能通过激活CD4+ T细胞和CD8+ T细胞来介导较强的抗肿瘤免疫反应。转B7-1基因的肿瘤细胞主要通过CD8+CTL介导抗肿瘤免疫反应，缺乏CD4+辅助T细胞的激活[5]，效果次之，GM-CSF基因转导的EL-4细胞无论是活疫苗，还是死疫苗均能提高机体的保护性免疫，原因可能是转基因后肿瘤细胞的抗原性得到了增强，经5 000 rad亚致死量射线照射后肿瘤细胞停止分裂增殖，但还需经历一段时间逐渐走向死亡。GM-CSF分泌量虽有下降，但仍足以诱导机体的保护性免疫反应。B7-1基因转导的EL-4活疫苗能增加保护性免疫，但经射线照射后效果减低，其确切机制尚不清楚。
EL-4/GM-CSF和EL-4/B7-1瘤苗联合应用具有协同抗肿瘤免疫效果，其机理可能是GM-CSF基因转导的瘤苗主要通过APC介导的间接途径影响辅助T淋巴细胞进而激活CTL，而B7-1基因转导的瘤苗是通过直接途径影响CTL[6]，同时也说明尽管B7-1基因转导的瘤苗GM-CSF基因转导的瘤苗共同接种能激活机体较强的免疫反应，是一种很有前景的肿瘤疫苗。
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总之，转GM-CSF基因及转B7-1基因的肿瘤疫苗可诱发系统性抗肿瘤免疫反应，导致肿瘤的部分根除，转GM-CSF及转B7-1基因的瘤苗联合应用效果最佳。
本课题受黑龙江省自然科学基金项目资助
张清媛,女,35岁,博士副教授,主要从事肿瘤化疗及肿瘤免疫方面的研究.
参 考 文 献
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2，Hellstrom KE, Hellstrom I, Chen L. Can co-stimulated tumor immunity be therapeutically efficacious. Immunol Rev, 1995, 145: 123
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3，Wakimoto H, Abe J, Tsunoda R, et al. Intensified antitumor immunity by a cancer vaccine that produces granulocyte-macrophage colony-stimulating facter plus interleukin 4. Cancer Res, 1996, 56: 1828
4，Lu L, Hsieh M, Oriss TB, et al. Generation of DC from mouse spleen cell culture in response to GM-CSF: Immunophenotypic and functional analyses. Immunology, 1995, 84: 127
5，Ding L， Shevach EM. Activation of CD4+ T cells by delivery of the B7-1 costimulatory signal on bystander antigen-presenting cells (trans-costimulation). Eur J Immunol, 1994, 24: 859
6，Nakazaki Y, Tani K, Lin ZT, et al. Vaccine effect of granulocyte-macrophage colony-stimulating facter or CD80 gene transduced murine leukemia/lyphoma cells and their cooperative enhancement of antitumor immunity. Gene Ther, 1998, 5(10): 1355
(2000-05-02收稿； 2000-08-18修回), http://www.100md.com