冻融抗原冲击致敏的树突状细胞对结肠癌小鼠的治疗作用
作者：唐华 银平章 孔令非 曹雪涛
单位：唐华 银平章 孔令非(河南省人民医院生物治疗中心 郑州 450003)；曹雪涛(第二军医大学免疫学教研究室 上海 200433)
关键词：树突状细胞；免疫治疗；结肠癌；冻融抗原；细胞毒性T淋巴细胞
中国肿瘤生物治疗杂志000310 摘 要 目的： 研究冻融的肿瘤抗原冲击致敏的骨髓来源的树突状细胞(DC)对结肠癌小鼠是否具有治疗作用。方法： 用小鼠结肠癌细胞株C26冻融抗原体外冲击致敏BALB/c小鼠骨髓来源的DC，观察其体外刺激荷瘤小鼠脾细胞增殖的能力及其诱导的CTL对C26肿瘤细胞的杀伤活性；体内以3×105 DC /只一次或多次接种于已荷瘤10 d结肠癌的小鼠同侧腹股沟皮下，观察抗原冲击的DC对肿瘤生长的抑制作用以及对荷瘤小鼠生存期的影响。结果： 体外抗原冲击致敏的DC能显著刺激荷瘤小鼠脾脏T细胞增殖，其诱导的CTL对C26肿瘤细胞具有显著的杀伤作用，在效靶比为10∶1，5∶1，2.5∶1时其杀伤率分别88.1%，71.4%和50.0%；抗原冲击致敏的DC体内多次皮下免疫后对肿瘤的生长具有显著的抑制作用，能显著延长荷瘤小鼠的生存期。一次性DC体内免疫接种对荷瘤小鼠的治疗作用不明显。结论： 肿瘤细胞冻融抗原体外冲击致敏的DC多次皮下免疫对结肠癌小鼠具有显著的治疗效果。
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《中国图书资料分类法》分类号 R730.50
Treatment of Established Colon Carcinoma-Bearing Mice by Vaccination with Dendritic Cells Pulsed with Tumor Cell Lysates
Tang Hua, Yin Pingzhang, Kong Lingfei, Cao Xuetao
(Cancer Biotherapy Center of Henan Provincial People's Hospital, Zhengzhou 450003)
Abstract Objective： To investigate whether vaccination with dendritic cells pulsed with C26 colon carcinoma cell lysates has the therapeutic effect on the established C26 colon carcinoma-bearing mice. Methods： Dendritic cells generated from murine bone marrow were pulsed with C26 tumor lysates. The T cell stimulating activity and CTL induction were detected. The dendritic cells were injected s.c (3 ×105/muose) only once on the day 10 or 4 times on the day 10, 15, 20, 29 repeatedly after the C26 tumor cells were inoculated. The therapeutic effect of DC was observed. Results： DC could stimulate proliferation of syngeneic T cells potently, and induce CTL activity markedly. The tumor growth was significantly suppressed and the survival time of tumor-bearing mice was prolonged when the DC pulsed with tumor lysates were injected s.c repeatedly. Conclusion: Vaccination with DC pulsed with tumor lysates has the potent therapeatic effect on the established colon carcinoma-bearing mice.
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Key words dendritic cell； immunotherapy； colon carcinoma； tumorlysate； cytotoxic T lymphocyte
树突状细胞(dendritic cells, DC)是机体功能最强的专职抗原提呈细胞(antigen-presenting cell, APC)，也是唯一能激活初始型T细胞(naive T cell)的APC，处于免疫反应的中心地位。DC有摄取抗原的能力，具有从外周向淋巴器官迁移的特性，成熟的DC高表达MHCⅠ，Ⅱ类分子、共刺激分子和其他粘附分子，最后定位于次级淋巴器官的T细胞依赖区启动特异性免疫反应[1]。DC在机体内含量极少，但自从1992年Inaba[2]建立了从小鼠骨髓诱导扩增大量DC的方法以后，DC的研究日渐深入，人们已经开始将其应用于恶性肿瘤的免疫治疗。在以前的工作中，我们证明肿瘤抗原冲击致敏的(pulsed)DC免疫过的小鼠具有抵抗致死剂量的肿瘤细胞再攻击的能力[3]。在本研究中，我们用小鼠结肠癌细胞株C26作为模型，试图探讨C26肿瘤细胞冻融抗原(lysate)体外冲击致敏的DC对已经荷瘤小鼠的治疗作用。
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1 材料与方法
1.1 实验动物与细胞株
BALB/c(H-2d)小鼠，6～8周龄，雌性，购自河南医科大学实验动物中心。小鼠结肠癌细胞株C26(H-2d)和小鼠肾癌细胞株Renca(H-2d)，从第二军医大学免疫学教研室引进，于本室常规传代培养。
1.2 主要试剂及仪器
重组小鼠GM-CSF、 重组小鼠IL-4、MTT均购自Sigma公司。[3H]-TdR购自中国原子能研究院。RPMI 1640培养基购自GIBCO。DG3022A型酶联免疫检测仪，为国营华东电子管厂生产。
1.3 骨髓树突状细胞的培养
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参照Inaba[2]的方法稍加修改。无菌取小鼠后肢股骨的骨髓细胞，用Tris-NH4Cl溶去红细胞后，PBS洗2次，用含mGM-CSF(3.3 ng/ml)、mIL-4(1 ng/ml)和10%小牛血清的RPMI 1640完全培养基重悬至1.0×106/ml，铺于24孔培养板上，1 ml/孔，于37℃， 5%CO2培养箱中培养，第3天轻轻晃动培养板，吸弃全部上清，及时补入含细胞因子浓度相同的完全培养基，第6天轻轻吹吸下疏松粘附于培养板底的聚集体，置于培养瓶中并加入等量的上述完全培养基，继续培养24 h。
1.4 C26肿瘤细胞冻融抗原的制备
收集处于对数生长期的C26肿瘤细胞，洗2次，用RPMI 1640培养基调整细胞浓度至2×107/ml，反复冻融(-20℃/37℃)4次，4 500 r/min离心1 h，吸上清，过滤除菌。
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1.5 C26冻融抗原对DC的体外冲击致敏
第7天收集上述DC，以DC与抗原的比例1∶10(抗原的量以冻融前肿瘤细胞的量计)加入C26肿瘤冻融抗原，DC的终浓度为2×106/ml，于6孔培养板中继续培养16 h，第8天收集，并补入含细胞因子的完全培养基及肿瘤冻融抗原，使细胞浓度为1×106/ml，DC与抗原的比例为1∶20，继续培养4～6 h。收集备用。
1.6 C26冻融抗原冲击致敏的DC的抗原提呈能力
无菌取已经荷瘤1周或未荷瘤的小鼠脾脏，于200目钢网上，研磨至单细胞，溶去红细胞，洗2次，用RPMI 1640重悬，注入尼龙毛柱，置37℃孵育1 h，预热RPMI 1640冲出非粘附细胞，收集，作为T细胞即反应细胞。该细胞与上述抗原冲击致敏的DC或未冲击致敏的DC (经25 μg/ml的丝裂霉素C 37℃45 min灭活)一起铺于96孔培养板上，各100 μl/孔，使DC与反应细胞的比例分别为1∶100，1∶330，1∶1 000，置于37℃,5%CO2培养3 d。于培养结束前16 h加入[3H]-TdR(37 kBq/孔)，常规收集细胞，置液闪仪上检测，计算cpm值。
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1.7 CTL的体外诱导
无菌取上述荷瘤1周小鼠脾脏的T细胞，用含10%小牛血清的RPMI 1640重悬，与上述抗原冲击致敏的DC以500∶1的比例一起混合，并加入IL-2 10 U/ml，置于5%CO2，37℃中培养7 d，于第7天收集活细胞作为效应细胞，备用。
1.8 用MTT法检测CTL杀伤活性
参照Hussain[4]的方法稍加修改，收集处于对数生长期的C26或Renca肿瘤细胞作为靶细胞，以效靶比分别为10∶1，5∶1，2.5∶1比例置于96孔平底培养板上，于37℃作用4 h后，加入MTT 20 μl(终浓度0.5 mg/ml)，37℃孵育3 h后，轻轻吸弃100 μl上清，补入100 μl 10%SDS，37℃孵育2 h，用酶联免疫检测仪检测OD值，以下述公式计算杀伤效率。
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1.9 C26冻融抗原冲击致敏的DC对肿瘤生长的抑制作用
每组7只小鼠，皆于右后肢股外侧皮下接种处于对数生长期的C26细胞(1.5×105/只)。分别在肿瘤细胞接种后一次(第10天)或多次(第10，15，20，29天) 于同侧腹股沟皮下接种C26肿瘤细胞冻融抗原冲击致敏的DC(3×105/只/次)。于肿瘤可触及后，每天测量肿瘤的纵径和横径，用公式1/6 πab2计算肿瘤体积，其中a表示纵径，b表示横径。
1.10 C26冻融抗原冲击致敏的DC对荷瘤小鼠生存期的影响
观察荷瘤小鼠的生存期和存活率，以肿瘤的体积大于10 cm3或肿瘤出现溃疡为小鼠死亡。
2 结 果
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2.1 DC的抗原提呈功能
倒置显微镜下观察发现，C26肿瘤细胞冻融抗原冲击致敏的DC能与荷瘤小鼠T细胞形成特征性的聚集体，而且随着培养时间的延长，大而圆的细胞会逐渐从聚集体上释放出来(可能是被激活的T细胞)；而抗原冲击致敏的DC和正常鼠T细胞以及未用肿瘤抗原冲击致敏的DC与荷瘤鼠T细胞的培养体系中都没有上述现象出现。进一步用[3H]-TdR掺入法检测发现，各种梯度的冻融抗原冲击致敏的DC皆可刺激荷瘤鼠脾T细胞显著增殖(图1)。
2.2 DC诱导的CTL杀伤活性
C26肿瘤细胞冻融抗原冲击致敏的DC可诱导产生杀伤活性较强的CTL，在效靶比为10∶1，5∶1和2.5∶1时，杀伤率分别为88.1%，71.4%和50.0%，而此CTL对Renca肿瘤细胞没有杀伤作用，说明抗原冲击致敏的DC诱导的CTL具有抗原特异性。
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2.3 DC免疫对肿瘤生长的抑制作用
小鼠接种C26细胞第10天开始皮下接种抗原冲击致敏的DC，发现仅仅接种1次DC的治疗作用只能持续一段时间(5 d左右)，治疗效果并不显著而连续多次接种DC，可以达到基本控制肿瘤生长的显著效果(图2),表明多次DC免疫对肿瘤生长具有显著抑制作用。
图1 抗原冲击致敏的DC对荷瘤小鼠T细胞的刺激活性
Fig. 1 T cell stimulatory activity of DC pulsed
with tumor lysates
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图2 抗原冲击致敏的DC皮下免疫对肿瘤生长的抑制作用
Fig. 2 Inhibition of tumor growth by vaccination with
DC pulsed with tumor lysates
2.4 DC免疫对荷瘤小鼠生存期的影响
在60 d观察期内,抗原冲击致敏的DC多次接种后可以使85.7%的荷瘤小鼠长期存活(60 d)，而其它各组小鼠都在较短的时间内全部死亡。各组平均生存期分别为：肿瘤抗原致敏DC四次免疫组(55±13.23)d; 肿瘤抗原致敏DC一次免疫组(31.43±2.44) d；DC免疫组(28±1.83)d； PBS组(28.29±2.69) d。DC-lysates-4组与其它各组相比，具有高度显著性差异(P<0.001)。表明多次接种抗原冲击致敏的DC可以显著提高和延长荷瘤小鼠的存活率及生存期。
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3 讨 论
DC在机体内含量极少但分布广泛，具有独特的细胞形态，是作用最强的专职APC，其抗原提呈能力是巨噬细胞和B细胞的100～10 000倍。我们以前的工作表明,用肿瘤冻融抗原冲击致敏的小鼠DC免疫正常小鼠，可以诱导产生肿瘤细胞特异的CTL，并且使小鼠获得抵抗致死剂量肿瘤细胞再攻击的能力[3]，证明用肿瘤冻融抗原体外冲击致敏的DC体内免疫可以诱导机体产生强大而特异的抗肿瘤免疫反应。但已有资料提示，荷瘤小鼠体内的成熟DC处于免疫抑制状态，不能诱导产生足够有效的抗肿瘤免疫反应，其MHCⅡ类分子、共刺激分子B7、CD40以及粘附分子等表达较低，与正常DC相比其抗原提呈能力极度低下[5]。因此，抗原体外冲击致敏的DC对于已经荷瘤的小鼠是否能产生治疗作用以及治疗效果如何，各家的报道不一。本实验目的就是观察冻融抗原冲击致敏的DC，能否诱导已荷瘤小鼠产生CTL以及对已荷瘤小鼠能否产生治疗作用。
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结果表明，C26肿瘤冻融抗原冲击致敏的DC在体外能显著刺激荷瘤小鼠的脾脏T细胞增殖，却不能刺激正常鼠脾脏T细胞增殖，相反，未用抗原冲击的DC不能刺激荷瘤鼠的脾脏T细胞增殖，说明冻融抗原冲击的DC能够提呈肿瘤抗原给荷瘤小鼠脾脏T细胞，同时也提示，荷瘤的小鼠机体本身可以产生抗肿瘤的免疫应答反应，但却不能产生足够有效的能够抑制肿瘤生长效应。而抗原冲击的DC能在体外诱导荷瘤小鼠的脾脏细胞产生高杀伤活性的特异性CTL的实验结果则进一步明确，冻融抗原冲击致敏的DC能够诱导已荷瘤的小鼠产生抗肿瘤的免疫反应。体内实验则证实，多次皮下接种抗原冲击致敏的DC能在体内显著抑制肿瘤生长，使荷瘤小鼠的存活率和生存期显著提高和延长。而仅仅接种一次抗原冲击致敏的DC所产生的作用是短暂，停止治疗后肿瘤继续不受限制地生长，荷瘤小鼠在较短的时间内全部死亡。该实验结果表明，多次接种抗原冲击致敏的DC，可以产生显著的治疗效果。但只是使肿瘤的生长得到控制，并没有使肿瘤完全消退，小鼠在观察期内仍然是带瘤生存。
目前关于DC对荷瘤小鼠体内治疗效果的报道不一。Zitvogel[6]等的研究表明，在所用的3株肿瘤细胞模型中，经肿瘤抗原多肽冲击致敏的DC反复多次的回输，只有一种高免疫原性的肿瘤(C3)完全消退，另外两种低免疫原性的肿瘤(MCA205，TS/A)的治疗结果和我们实验结果的相似。我们分析认为DC对肿瘤的治疗效果是肯定的，多次回输可以使荷瘤体内的免疫抑制状态得到逆转，使肿瘤的生长得到有效的控制。但治疗效果受多种因素的影响，主要的影响因素可能有肿瘤本身的免疫原性，肿瘤分泌的免疫抑制因子等[5,7]，还有治疗程序的安排也非常重要，因为回输的DC在体内有一定的寿命，要维持DC的体内抗肿瘤作用必需多次的回输DC。
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本课题受上海市优秀学科带头人资助计划(97XD1406)和高等学校优秀青年教师教学科研奖励计划(TRAPOTY)资助
唐华,男,31岁,硕士,主治医师,主要从事肿瘤生物治疗的研究.
参 考 文 献
1，曹雪涛. 树突状细胞的基础与临床的研究新进展. 中国免疫学杂志， 1998， 14： 161
2，Inaba K, Inaba M, Romani N, et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with GM-CSF. J Exp Med, 1992， 176: 1693
3，唐 华， 曹雪涛， 朱学军， 等. IL-2基因修饰增强白血病抗原冲击的树突状细胞诱导的抗肿瘤免疫反应. 中华血液学杂志， 1999， 20∶ 573
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4，Hussain RF, Nouri AME, Oliver RTD, et al. A new approach for measurement of cytotoxicity using colorimetric assay. J Immunol Methods, 1992, 160: 89
5，Gabrilovich DI,Ciernik F, Carbone DP, et al. Dendritic cells in antitumor immune responses: Ⅰ. Defective antigen presentation in tumor-bearing hosts. Cell Immunol, 1996, 170: 101
6，Zitvogel L, Mayordomo JI, Tjandrawan T, et al. Therapy of murine tumors with tumor peptide-pulsed dendritic cells: Dependence on T cells, B7 costimulation, and T helper cell 1-associated cytokines. J Exp Med, 1996, 183: 87
7，Gabrilovich DI, Nadaf S, Corak J, et al. Dendritic cells in antitumor immune responses:Ⅱ. Dendritic cells grown from bone marrow precursors, but not mature DC from tumor-bearing mice, are effective antigen carriers in the therapy of established tumors. Cell Immunol, 1996, 170: 111
(2000-02-15收稿； 2000-05-20修回), 百拇医药
单位：唐华 银平章 孔令非(河南省人民医院生物治疗中心 郑州 450003)；曹雪涛(第二军医大学免疫学教研究室 上海 200433)
关键词：树突状细胞；免疫治疗；结肠癌；冻融抗原；细胞毒性T淋巴细胞
中国肿瘤生物治疗杂志000310 摘 要 目的： 研究冻融的肿瘤抗原冲击致敏的骨髓来源的树突状细胞(DC)对结肠癌小鼠是否具有治疗作用。方法： 用小鼠结肠癌细胞株C26冻融抗原体外冲击致敏BALB/c小鼠骨髓来源的DC，观察其体外刺激荷瘤小鼠脾细胞增殖的能力及其诱导的CTL对C26肿瘤细胞的杀伤活性；体内以3×105 DC /只一次或多次接种于已荷瘤10 d结肠癌的小鼠同侧腹股沟皮下，观察抗原冲击的DC对肿瘤生长的抑制作用以及对荷瘤小鼠生存期的影响。结果： 体外抗原冲击致敏的DC能显著刺激荷瘤小鼠脾脏T细胞增殖，其诱导的CTL对C26肿瘤细胞具有显著的杀伤作用，在效靶比为10∶1，5∶1，2.5∶1时其杀伤率分别88.1%，71.4%和50.0%；抗原冲击致敏的DC体内多次皮下免疫后对肿瘤的生长具有显著的抑制作用，能显著延长荷瘤小鼠的生存期。一次性DC体内免疫接种对荷瘤小鼠的治疗作用不明显。结论： 肿瘤细胞冻融抗原体外冲击致敏的DC多次皮下免疫对结肠癌小鼠具有显著的治疗效果。
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《中国图书资料分类法》分类号 R730.50
Treatment of Established Colon Carcinoma-Bearing Mice by Vaccination with Dendritic Cells Pulsed with Tumor Cell Lysates
Tang Hua, Yin Pingzhang, Kong Lingfei, Cao Xuetao
(Cancer Biotherapy Center of Henan Provincial People's Hospital, Zhengzhou 450003)
Abstract Objective： To investigate whether vaccination with dendritic cells pulsed with C26 colon carcinoma cell lysates has the therapeutic effect on the established C26 colon carcinoma-bearing mice. Methods： Dendritic cells generated from murine bone marrow were pulsed with C26 tumor lysates. The T cell stimulating activity and CTL induction were detected. The dendritic cells were injected s.c (3 ×105/muose) only once on the day 10 or 4 times on the day 10, 15, 20, 29 repeatedly after the C26 tumor cells were inoculated. The therapeutic effect of DC was observed. Results： DC could stimulate proliferation of syngeneic T cells potently, and induce CTL activity markedly. The tumor growth was significantly suppressed and the survival time of tumor-bearing mice was prolonged when the DC pulsed with tumor lysates were injected s.c repeatedly. Conclusion: Vaccination with DC pulsed with tumor lysates has the potent therapeatic effect on the established colon carcinoma-bearing mice.
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Key words dendritic cell； immunotherapy； colon carcinoma； tumorlysate； cytotoxic T lymphocyte
树突状细胞(dendritic cells, DC)是机体功能最强的专职抗原提呈细胞(antigen-presenting cell, APC)，也是唯一能激活初始型T细胞(naive T cell)的APC，处于免疫反应的中心地位。DC有摄取抗原的能力，具有从外周向淋巴器官迁移的特性，成熟的DC高表达MHCⅠ，Ⅱ类分子、共刺激分子和其他粘附分子，最后定位于次级淋巴器官的T细胞依赖区启动特异性免疫反应[1]。DC在机体内含量极少，但自从1992年Inaba[2]建立了从小鼠骨髓诱导扩增大量DC的方法以后，DC的研究日渐深入，人们已经开始将其应用于恶性肿瘤的免疫治疗。在以前的工作中，我们证明肿瘤抗原冲击致敏的(pulsed)DC免疫过的小鼠具有抵抗致死剂量的肿瘤细胞再攻击的能力[3]。在本研究中，我们用小鼠结肠癌细胞株C26作为模型，试图探讨C26肿瘤细胞冻融抗原(lysate)体外冲击致敏的DC对已经荷瘤小鼠的治疗作用。
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1 材料与方法
1.1 实验动物与细胞株
BALB/c(H-2d)小鼠，6～8周龄，雌性，购自河南医科大学实验动物中心。小鼠结肠癌细胞株C26(H-2d)和小鼠肾癌细胞株Renca(H-2d)，从第二军医大学免疫学教研室引进，于本室常规传代培养。
1.2 主要试剂及仪器
重组小鼠GM-CSF、 重组小鼠IL-4、MTT均购自Sigma公司。[3H]-TdR购自中国原子能研究院。RPMI 1640培养基购自GIBCO。DG3022A型酶联免疫检测仪，为国营华东电子管厂生产。
1.3 骨髓树突状细胞的培养
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参照Inaba[2]的方法稍加修改。无菌取小鼠后肢股骨的骨髓细胞，用Tris-NH4Cl溶去红细胞后，PBS洗2次，用含mGM-CSF(3.3 ng/ml)、mIL-4(1 ng/ml)和10%小牛血清的RPMI 1640完全培养基重悬至1.0×106/ml，铺于24孔培养板上，1 ml/孔，于37℃， 5%CO2培养箱中培养，第3天轻轻晃动培养板，吸弃全部上清，及时补入含细胞因子浓度相同的完全培养基，第6天轻轻吹吸下疏松粘附于培养板底的聚集体，置于培养瓶中并加入等量的上述完全培养基，继续培养24 h。
1.4 C26肿瘤细胞冻融抗原的制备
收集处于对数生长期的C26肿瘤细胞，洗2次，用RPMI 1640培养基调整细胞浓度至2×107/ml，反复冻融(-20℃/37℃)4次，4 500 r/min离心1 h，吸上清，过滤除菌。
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1.5 C26冻融抗原对DC的体外冲击致敏
第7天收集上述DC，以DC与抗原的比例1∶10(抗原的量以冻融前肿瘤细胞的量计)加入C26肿瘤冻融抗原，DC的终浓度为2×106/ml，于6孔培养板中继续培养16 h，第8天收集，并补入含细胞因子的完全培养基及肿瘤冻融抗原，使细胞浓度为1×106/ml，DC与抗原的比例为1∶20，继续培养4～6 h。收集备用。
1.6 C26冻融抗原冲击致敏的DC的抗原提呈能力
无菌取已经荷瘤1周或未荷瘤的小鼠脾脏，于200目钢网上，研磨至单细胞，溶去红细胞，洗2次，用RPMI 1640重悬，注入尼龙毛柱，置37℃孵育1 h，预热RPMI 1640冲出非粘附细胞，收集，作为T细胞即反应细胞。该细胞与上述抗原冲击致敏的DC或未冲击致敏的DC (经25 μg/ml的丝裂霉素C 37℃45 min灭活)一起铺于96孔培养板上，各100 μl/孔，使DC与反应细胞的比例分别为1∶100，1∶330，1∶1 000，置于37℃,5%CO2培养3 d。于培养结束前16 h加入[3H]-TdR(37 kBq/孔)，常规收集细胞，置液闪仪上检测，计算cpm值。
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1.7 CTL的体外诱导
无菌取上述荷瘤1周小鼠脾脏的T细胞，用含10%小牛血清的RPMI 1640重悬，与上述抗原冲击致敏的DC以500∶1的比例一起混合，并加入IL-2 10 U/ml，置于5%CO2，37℃中培养7 d，于第7天收集活细胞作为效应细胞，备用。
1.8 用MTT法检测CTL杀伤活性
参照Hussain[4]的方法稍加修改，收集处于对数生长期的C26或Renca肿瘤细胞作为靶细胞，以效靶比分别为10∶1，5∶1，2.5∶1比例置于96孔平底培养板上，于37℃作用4 h后，加入MTT 20 μl(终浓度0.5 mg/ml)，37℃孵育3 h后，轻轻吸弃100 μl上清，补入100 μl 10%SDS，37℃孵育2 h，用酶联免疫检测仪检测OD值，以下述公式计算杀伤效率。
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1.9 C26冻融抗原冲击致敏的DC对肿瘤生长的抑制作用
每组7只小鼠，皆于右后肢股外侧皮下接种处于对数生长期的C26细胞(1.5×105/只)。分别在肿瘤细胞接种后一次(第10天)或多次(第10，15，20，29天) 于同侧腹股沟皮下接种C26肿瘤细胞冻融抗原冲击致敏的DC(3×105/只/次)。于肿瘤可触及后，每天测量肿瘤的纵径和横径，用公式1/6 πab2计算肿瘤体积，其中a表示纵径，b表示横径。
1.10 C26冻融抗原冲击致敏的DC对荷瘤小鼠生存期的影响
观察荷瘤小鼠的生存期和存活率，以肿瘤的体积大于10 cm3或肿瘤出现溃疡为小鼠死亡。
2 结 果
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2.1 DC的抗原提呈功能
倒置显微镜下观察发现，C26肿瘤细胞冻融抗原冲击致敏的DC能与荷瘤小鼠T细胞形成特征性的聚集体，而且随着培养时间的延长，大而圆的细胞会逐渐从聚集体上释放出来(可能是被激活的T细胞)；而抗原冲击致敏的DC和正常鼠T细胞以及未用肿瘤抗原冲击致敏的DC与荷瘤鼠T细胞的培养体系中都没有上述现象出现。进一步用[3H]-TdR掺入法检测发现，各种梯度的冻融抗原冲击致敏的DC皆可刺激荷瘤鼠脾T细胞显著增殖(图1)。
2.2 DC诱导的CTL杀伤活性
C26肿瘤细胞冻融抗原冲击致敏的DC可诱导产生杀伤活性较强的CTL，在效靶比为10∶1，5∶1和2.5∶1时，杀伤率分别为88.1%，71.4%和50.0%，而此CTL对Renca肿瘤细胞没有杀伤作用，说明抗原冲击致敏的DC诱导的CTL具有抗原特异性。
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2.3 DC免疫对肿瘤生长的抑制作用
小鼠接种C26细胞第10天开始皮下接种抗原冲击致敏的DC，发现仅仅接种1次DC的治疗作用只能持续一段时间(5 d左右)，治疗效果并不显著而连续多次接种DC，可以达到基本控制肿瘤生长的显著效果(图2),表明多次DC免疫对肿瘤生长具有显著抑制作用。
图1 抗原冲击致敏的DC对荷瘤小鼠T细胞的刺激活性
Fig. 1 T cell stimulatory activity of DC pulsed
with tumor lysates
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图2 抗原冲击致敏的DC皮下免疫对肿瘤生长的抑制作用
Fig. 2 Inhibition of tumor growth by vaccination with
DC pulsed with tumor lysates
2.4 DC免疫对荷瘤小鼠生存期的影响
在60 d观察期内,抗原冲击致敏的DC多次接种后可以使85.7%的荷瘤小鼠长期存活(60 d)，而其它各组小鼠都在较短的时间内全部死亡。各组平均生存期分别为：肿瘤抗原致敏DC四次免疫组(55±13.23)d; 肿瘤抗原致敏DC一次免疫组(31.43±2.44) d；DC免疫组(28±1.83)d； PBS组(28.29±2.69) d。DC-lysates-4组与其它各组相比，具有高度显著性差异(P<0.001)。表明多次接种抗原冲击致敏的DC可以显著提高和延长荷瘤小鼠的存活率及生存期。
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3 讨 论
DC在机体内含量极少但分布广泛，具有独特的细胞形态，是作用最强的专职APC，其抗原提呈能力是巨噬细胞和B细胞的100～10 000倍。我们以前的工作表明,用肿瘤冻融抗原冲击致敏的小鼠DC免疫正常小鼠，可以诱导产生肿瘤细胞特异的CTL，并且使小鼠获得抵抗致死剂量肿瘤细胞再攻击的能力[3]，证明用肿瘤冻融抗原体外冲击致敏的DC体内免疫可以诱导机体产生强大而特异的抗肿瘤免疫反应。但已有资料提示，荷瘤小鼠体内的成熟DC处于免疫抑制状态，不能诱导产生足够有效的抗肿瘤免疫反应，其MHCⅡ类分子、共刺激分子B7、CD40以及粘附分子等表达较低，与正常DC相比其抗原提呈能力极度低下[5]。因此，抗原体外冲击致敏的DC对于已经荷瘤的小鼠是否能产生治疗作用以及治疗效果如何，各家的报道不一。本实验目的就是观察冻融抗原冲击致敏的DC，能否诱导已荷瘤小鼠产生CTL以及对已荷瘤小鼠能否产生治疗作用。
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结果表明，C26肿瘤冻融抗原冲击致敏的DC在体外能显著刺激荷瘤小鼠的脾脏T细胞增殖，却不能刺激正常鼠脾脏T细胞增殖，相反，未用抗原冲击的DC不能刺激荷瘤鼠的脾脏T细胞增殖，说明冻融抗原冲击的DC能够提呈肿瘤抗原给荷瘤小鼠脾脏T细胞，同时也提示，荷瘤的小鼠机体本身可以产生抗肿瘤的免疫应答反应，但却不能产生足够有效的能够抑制肿瘤生长效应。而抗原冲击的DC能在体外诱导荷瘤小鼠的脾脏细胞产生高杀伤活性的特异性CTL的实验结果则进一步明确，冻融抗原冲击致敏的DC能够诱导已荷瘤的小鼠产生抗肿瘤的免疫反应。体内实验则证实，多次皮下接种抗原冲击致敏的DC能在体内显著抑制肿瘤生长，使荷瘤小鼠的存活率和生存期显著提高和延长。而仅仅接种一次抗原冲击致敏的DC所产生的作用是短暂，停止治疗后肿瘤继续不受限制地生长，荷瘤小鼠在较短的时间内全部死亡。该实验结果表明，多次接种抗原冲击致敏的DC，可以产生显著的治疗效果。但只是使肿瘤的生长得到控制，并没有使肿瘤完全消退，小鼠在观察期内仍然是带瘤生存。
目前关于DC对荷瘤小鼠体内治疗效果的报道不一。Zitvogel[6]等的研究表明，在所用的3株肿瘤细胞模型中，经肿瘤抗原多肽冲击致敏的DC反复多次的回输，只有一种高免疫原性的肿瘤(C3)完全消退，另外两种低免疫原性的肿瘤(MCA205，TS/A)的治疗结果和我们实验结果的相似。我们分析认为DC对肿瘤的治疗效果是肯定的，多次回输可以使荷瘤体内的免疫抑制状态得到逆转，使肿瘤的生长得到有效的控制。但治疗效果受多种因素的影响，主要的影响因素可能有肿瘤本身的免疫原性，肿瘤分泌的免疫抑制因子等[5,7]，还有治疗程序的安排也非常重要，因为回输的DC在体内有一定的寿命，要维持DC的体内抗肿瘤作用必需多次的回输DC。
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本课题受上海市优秀学科带头人资助计划(97XD1406)和高等学校优秀青年教师教学科研奖励计划(TRAPOTY)资助
唐华,男,31岁,硕士,主治医师,主要从事肿瘤生物治疗的研究.
参 考 文 献
1，曹雪涛. 树突状细胞的基础与临床的研究新进展. 中国免疫学杂志， 1998， 14： 161
2，Inaba K, Inaba M, Romani N, et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with GM-CSF. J Exp Med, 1992， 176: 1693
3，唐 华， 曹雪涛， 朱学军， 等. IL-2基因修饰增强白血病抗原冲击的树突状细胞诱导的抗肿瘤免疫反应. 中华血液学杂志， 1999， 20∶ 573
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4，Hussain RF, Nouri AME, Oliver RTD, et al. A new approach for measurement of cytotoxicity using colorimetric assay. J Immunol Methods, 1992, 160: 89
5，Gabrilovich DI,Ciernik F, Carbone DP, et al. Dendritic cells in antitumor immune responses: Ⅰ. Defective antigen presentation in tumor-bearing hosts. Cell Immunol, 1996, 170: 101
6，Zitvogel L, Mayordomo JI, Tjandrawan T, et al. Therapy of murine tumors with tumor peptide-pulsed dendritic cells: Dependence on T cells, B7 costimulation, and T helper cell 1-associated cytokines. J Exp Med, 1996, 183: 87
7，Gabrilovich DI, Nadaf S, Corak J, et al. Dendritic cells in antitumor immune responses:Ⅱ. Dendritic cells grown from bone marrow precursors, but not mature DC from tumor-bearing mice, are effective antigen carriers in the therapy of established tumors. Cell Immunol, 1996, 170: 111
(2000-02-15收稿； 2000-05-20修回), 百拇医药