中药对低密度脂蛋白受体基因表达的影响
作者：刘萍 张静生 郑菲 富伟能 陈汝兴
单位：刘萍(辽宁中医学院附属医院，辽宁 沈阳 110032)；张静生(辽宁中医学院附属医院，辽宁 沈阳 110032)；郑菲(辽宁中医学院附属医院，辽宁 沈阳 110032；富伟能(中国医科大学遗传学教研室，辽宁 沈阳 110001)；陈汝兴(上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032)
关键词：低密度脂蛋白受体；基因表达；逆转录聚合酶链反应；中药复方
中国中西医结合急救杂志000304 摘要：目的：探讨中药对低密度脂蛋白受体基因表达的影响。方法：应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术检测30例高脂血症患者外周血淋巴细胞低密度脂蛋白受体(LDLR)信使核糖核酸(mRNA)水平在用药前后的变化。结果：中药组15例患者用药后的LDLR mRNA水平(0.625 4±0.166 9)较用药前(0.246 5±0.131 6)明显升高(P<0.01)。结论：中药复方颗粒剂可增强高脂血症患者外周血淋巴细胞LDLR基因表达水平，在分子水平上，为中药降脂作用的机制研究提供科学依据。
, 百拇医药
中图分类号：Q344.13;R285.5 文献标识码：A 文章编号：10089691(2000)03014103
The influence of traditional Chinese medicine on expression
level of lowdensity lipoprotein receptor gene
LIU Ping,ZHANG Jingsheng,ZHENG Fei,et al.
(Department of Internal Medicine,Hospital Affiliated to
Liaoning College of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032)
, http://www.100md.com
Abstract:Objective:To investigate the influence of traditional Chinese medicine on the expression level of lowdensity lipoprotein receptor(LDLR) gene.Methods:Using reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR),the expression level of LDLR gene(LDLR mRNA) in peripheral blood lymphocytes was detected from 30 patients with hyperlipemia.Results:The expression level of LDLR mRNA in treatment group (n=15) taken traditional Chinese medicine compound was significantly higher than those in control group (0.625 4±0.166 9 vs.0.246 5±0.131 6，P<0.01).Conclusions:Traditional Chinese medicine compound can increase the expression level of LDLR gene.It may be the molecular level treatment mechanism of Chinese medicine on hyperlipemia.
, http://www.100md.com
Key words:lowdensity lipoprotein receptor;gene expression;reverse transcription polymerase chain reaction;traditional Chinese medicine compound
CLC number:Q344.13;R285.5 Document code:A Artical ID:10089691(2000)03014103▲
低密度脂蛋白受体(LDLR)基因功能缺陷是引起高脂血症及动脉粥样硬化的主要原因之一。近年研究表明，高胆固醇血症患者存在LDLR功能缺陷和不同程度的损伤，导致血浆中低密度脂蛋白水平升高，形成动脉粥样硬化〔1〕。本研究观察中药对高脂血症患者外周血淋巴细胞低密度脂蛋白受体基因表达的影响。报告如下。
1 资料与方法
, 百拇医药
1.1 临床资料：高脂血症的诊断参照中华人民共和国卫生部药政局西药(新药)临床指导原则。30例高脂血症患者中男17例，女13例；年龄40～65岁，平均53.5岁；病程3个月～1年，平均6个月。除外严重肝肾疾病、高血压Ⅲ期、妊娠及心肌梗死者。30例患者随机分为2组，中药组15例，对照组15例。
1.2 治疗方法：中药组：口服中药复方颗粒剂(主要成分为黄芪、丹参、益母草、栝蒌、薤白、半夏、枳实)每日30 g，分2次口服，4周为1个疗程。对照组：口服力平脂胶囊(法国利博福尼制药公司生产)，每日200 mg，一次顿服，4周为1个疗程。用药期间定期检查血常规及肝功能。
1.3 实验室检查方法：受试者采血前一日晚餐不能进食高脂饮食及饮酒，第2日晨空腹取静脉血5 ml，给药治疗4周后再取静脉血5 ml。EDTA抗凝，淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。
1.3.1 引物根据文献合成：
, 百拇医药
LDLR引物：
上游引物：5′CAA TGT CTC ACC AGG CTC TG3′；下游引物：5′TCT GTC TCG AGG GGT AGC TG3′。cDNA序列片断为258 bp。
内对照β2微球蛋白(β2microglobulin，β2MG)引物：
上游引物：5′ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA3′；下游引物：5′ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG3′。cDNA序列片断为120 bp。
1.3.2 总RNA制备：用TRIzol Reagent Total RNA试剂盒(GiBco BRL公司)提取总RNA于-20 ℃保存备用。
, http://www.100md.com 1.3.3 逆转录：取总RNA2.5 μl，依次加入随机引物1 μl，5X Buffer 2.5 μl，RNasin 0.5 μl，反转录酶0.75 μl，加入二乙基焦碳酸(DEPC)处理水，使总体达至25 μl。42 ℃水浴60分钟，60 ℃水浴10分钟。
1.3.4 聚合酶链反应(PCR)：取逆转录产物3 μl，2.5 mmol/L dNTP 1.8 μl，LDLR引物(20 μmol/L)各1.6 μl；β2MG引物各0.5 μl，10X Buffer 2.5 μl，5 μTaq酶0.3 μl，加入无菌水至25 μl，进入PCR循环。首次变性95 ℃ 2 分钟，变性95 ℃ 50秒，退火57 ℃ 50秒，延伸72 ℃ 75秒，循环28次，最后，72 ℃延伸7 分钟。
1.3.5 逆转录聚合酶链反应(RTPCR)产物检测：取10 μl PCR反应产物，进行2%琼脂糖凝胶电泳(含0.5 mg/L溴化乙锭)分析，以174XHINC Ⅱ为分子量标准，电泳缓冲液为1X TBE ，电泳完毕后，在凝胶自动成像仪上进行照像、数据分析。
, 百拇医药
1.4 统计学方法：全部实验数据以均值±标准差(
±s)表示，t检验。
2 结 果
2.1 中西药对患者LDLR mRNA影响见表1。
表1 药物对高脂血症患者血中LDLR mRNA(LDLR/β2MG)水平影响(±s) 组别
例数(例)
治疗前
治疗后
中药组
, 百拇医药
15
0.246 5±0.131 6
0.625 4±0.166 9*
对照组
15
0.298 4±0.142 5
0.789 9±0.374 4*
注：与本组治疗前比较：*P<0.01
2.2 中药组RTPCR产物电泳结果见图1。
, 百拇医药
图1 中药治疗前后的RTPCR产物电泳图
2.3 对照组RTPCR产物电泳结果见图2。
图2 西药治疗前后的RTPCR产物电泳图
3 讨 论
近年来，国内外学者对LDLR 的功能从生化、免疫、遗传学等方面作了大量研究，认为血浆中2/3以上的LDL是通过LDLR途径降解的，其基因表达异常可影响LDL的清除，使血中LDL水平升高，导致高脂血症、动脉粥样硬化〔2〕。临床大量研究资料表明，血胆固醇、甘油三酯水平升高，尤其是LDL水平升高，可增加冠心病危险性；反之，可减少冠心病危险性，减缓动脉粥样硬化的进程，甚至消退部分脂质斑块。因此，目前把降低LDL作为降脂治疗的主要目标〔1，3〕。以往人们对LDLR基因表达的研究多取材于实验动物肝细胞或人皮肤成纤维细胞，难以在临床上推广。人新鲜外周血淋巴细胞表面具有LDLR，其表达水平的高低代表人体内其它细胞，尤其是肝细胞的LDLR状态。因此，从外周血淋巴细胞可以观察药物对LDLR基因表达水平的影响〔46〕。本研究应用RTPCR技术，检测用药后患者外周血LDLR基因表达相对水平增高，间接提示高脂血症患者的LDLR转录水平处于严重的抑制状态，这与以往国内外报道的实验资料一致〔7，8〕，说明中药复方颗粒剂可以解除这种作用，从而降低血中LDL水平，调控血脂水平。
, 百拇医药
现代药理研究表明，黄芪、丹参、栝蒌、薤白、益母草等皆有降血脂作用，尤其丹参能升高实验性高胆固醇大鼠肝及人成纤维细胞LDLR mRNA水平〔9〕。本研究本着扶正祛邪、标本兼顾的原则，以《金匮要略》中栝蒌薤白半夏汤为基础加味组成的中药复方颗粒剂具有升高高脂血症患者血中LDLR mRNA水平，调控血脂水平的作用，其机制可能是进一步促进LDLR表达，加速脂蛋白分解，由于LDLR的这种降解作用，使血中LDL减少。说明中药复方颗粒剂对基因表达的异常有影响作用，这种作用是否是对LDLR具有翻译和翻译后水平的调节作用，从而达到调控血脂水平的目的，有待进一步研究。
目前，国内外对LDLR功能缺陷的治疗一是采用基因替代疗法，二是采用羟甲基戊二酰辅酶A(HMGCoA)还原酶抑制剂治疗〔10〕。力平脂属贝特类降脂药物，其主要药理作用是抑制HMGCoA还原酶，增加LDLR的表达，从而降低LDL水平〔11〕。此药降脂作用虽好，但停药后易反跳，且有一定不良反应，长期使用其安全性也有待证明。本研究发现中药复方颗粒剂与力平脂疗效无明显差异，但却明显增强高脂血症患者外周血中LDLR基因表达水平，调控了血脂水平，达到了治疗目的，长期应用无不良反应。■
, 百拇医药
基金项目：辽宁省教委基金资助项目(9703221098)
辽宁省科委自然科学基金资助项目(972122)
获奖项目：辽宁省科委科学技术研究成果(990218)
本文曾在2000年国际传统医药大会上交流
作者简介：刘萍(1966)，女(汉族)，辽宁省人，博士研究生，讲师。
参考文献：
〔1〕夏舜英.脂质异常与冠心病的新概念.临床心血管病杂志，1994，10(5)：314315.
〔2〕秦树存，王士雯.低密度脂蛋白受体缺陷的诊断与治疗.心血管学进展，1995，16(1)：2225.
, 百拇医药
〔3〕王克勤.脂蛋白与动脉粥样硬化.第1版.北京：人民卫生出版社，1995.278296.
〔4〕Wang A M，Doyle M V,Mark D F.Quantitation of mRNA by the polymerase chain reaction proc.Natl Acal Sci USA,1989,86(24):97179721.
〔5〕秦树存，王士雯.低密度脂蛋白受体基因表达研究进展.国外医学老年医学分册，1996，17(1)：48.
〔6〕Cuthbert J A,Lipsky P E.Mitogenic stimulation alters the regulation of LDL receptor gene expression in human lymphocytes.J Lipid Res,1990,31:20672078.
, http://www.100md.com
〔7〕李锡明，Windler E.冠心病患者血淋巴细胞mRNA的表达.中国循环杂志,1996,11(3)：137139.
〔8〕Stulning T M,Klocker H,Harwood H J.In vivo LDL receptor and HMGCoA reductase regulation in human lymphocytes and its alteration during aging.J Arteriosocler Thromb Vasc Biol,1995,15:872878.
〔9〕姜传仓，蔡海江，范乐明.丹参对LDLR及ApoAI mRNA水平的影响.南京医科大学学报，1994，14(4)：522525.
〔10〕Lecras T D,Gherardi E,Bowyer D E.A sensitive RNase Protection assay for the quantitation of the mRNA for the LDL receptor and HMGCoA reductase in human total RNA.J Atherosclerosis,1991,90:8190.
〔11〕石永兵，刘志达.老年人高脂血症治疗进展.实用老年医学，1994，8(4)：174175.
收稿日期：1999-11-12
修回日期：2000-03-28, http://www.100md.com
单位：刘萍(辽宁中医学院附属医院，辽宁 沈阳 110032)；张静生(辽宁中医学院附属医院，辽宁 沈阳 110032)；郑菲(辽宁中医学院附属医院，辽宁 沈阳 110032；富伟能(中国医科大学遗传学教研室，辽宁 沈阳 110001)；陈汝兴(上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032)
关键词：低密度脂蛋白受体；基因表达；逆转录聚合酶链反应；中药复方
中国中西医结合急救杂志000304 摘要：目的：探讨中药对低密度脂蛋白受体基因表达的影响。方法：应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术检测30例高脂血症患者外周血淋巴细胞低密度脂蛋白受体(LDLR)信使核糖核酸(mRNA)水平在用药前后的变化。结果：中药组15例患者用药后的LDLR mRNA水平(0.625 4±0.166 9)较用药前(0.246 5±0.131 6)明显升高(P<0.01)。结论：中药复方颗粒剂可增强高脂血症患者外周血淋巴细胞LDLR基因表达水平，在分子水平上，为中药降脂作用的机制研究提供科学依据。
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中图分类号：Q344.13;R285.5 文献标识码：A 文章编号：10089691(2000)03014103
The influence of traditional Chinese medicine on expression
level of lowdensity lipoprotein receptor gene
LIU Ping,ZHANG Jingsheng,ZHENG Fei,et al.
(Department of Internal Medicine,Hospital Affiliated to
Liaoning College of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032)
, http://www.100md.com
Abstract:Objective:To investigate the influence of traditional Chinese medicine on the expression level of lowdensity lipoprotein receptor(LDLR) gene.Methods:Using reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR),the expression level of LDLR gene(LDLR mRNA) in peripheral blood lymphocytes was detected from 30 patients with hyperlipemia.Results:The expression level of LDLR mRNA in treatment group (n=15) taken traditional Chinese medicine compound was significantly higher than those in control group (0.625 4±0.166 9 vs.0.246 5±0.131 6，P<0.01).Conclusions:Traditional Chinese medicine compound can increase the expression level of LDLR gene.It may be the molecular level treatment mechanism of Chinese medicine on hyperlipemia.
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Key words:lowdensity lipoprotein receptor;gene expression;reverse transcription polymerase chain reaction;traditional Chinese medicine compound
CLC number:Q344.13;R285.5 Document code:A Artical ID:10089691(2000)03014103▲
低密度脂蛋白受体(LDLR)基因功能缺陷是引起高脂血症及动脉粥样硬化的主要原因之一。近年研究表明，高胆固醇血症患者存在LDLR功能缺陷和不同程度的损伤，导致血浆中低密度脂蛋白水平升高，形成动脉粥样硬化〔1〕。本研究观察中药对高脂血症患者外周血淋巴细胞低密度脂蛋白受体基因表达的影响。报告如下。
1 资料与方法
, 百拇医药
1.1 临床资料：高脂血症的诊断参照中华人民共和国卫生部药政局西药(新药)临床指导原则。30例高脂血症患者中男17例，女13例；年龄40～65岁，平均53.5岁；病程3个月～1年，平均6个月。除外严重肝肾疾病、高血压Ⅲ期、妊娠及心肌梗死者。30例患者随机分为2组，中药组15例，对照组15例。
1.2 治疗方法：中药组：口服中药复方颗粒剂(主要成分为黄芪、丹参、益母草、栝蒌、薤白、半夏、枳实)每日30 g，分2次口服，4周为1个疗程。对照组：口服力平脂胶囊(法国利博福尼制药公司生产)，每日200 mg，一次顿服，4周为1个疗程。用药期间定期检查血常规及肝功能。
1.3 实验室检查方法：受试者采血前一日晚餐不能进食高脂饮食及饮酒，第2日晨空腹取静脉血5 ml，给药治疗4周后再取静脉血5 ml。EDTA抗凝，淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。
1.3.1 引物根据文献合成：
, 百拇医药
LDLR引物：
上游引物：5′CAA TGT CTC ACC AGG CTC TG3′；下游引物：5′TCT GTC TCG AGG GGT AGC TG3′。cDNA序列片断为258 bp。
内对照β2微球蛋白(β2microglobulin，β2MG)引物：
上游引物：5′ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA3′；下游引物：5′ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG3′。cDNA序列片断为120 bp。
1.3.2 总RNA制备：用TRIzol Reagent Total RNA试剂盒(GiBco BRL公司)提取总RNA于-20 ℃保存备用。
, http://www.100md.com 1.3.3 逆转录：取总RNA2.5 μl，依次加入随机引物1 μl，5X Buffer 2.5 μl，RNasin 0.5 μl，反转录酶0.75 μl，加入二乙基焦碳酸(DEPC)处理水，使总体达至25 μl。42 ℃水浴60分钟，60 ℃水浴10分钟。
1.3.4 聚合酶链反应(PCR)：取逆转录产物3 μl，2.5 mmol/L dNTP 1.8 μl，LDLR引物(20 μmol/L)各1.6 μl；β2MG引物各0.5 μl，10X Buffer 2.5 μl，5 μTaq酶0.3 μl，加入无菌水至25 μl，进入PCR循环。首次变性95 ℃ 2 分钟，变性95 ℃ 50秒，退火57 ℃ 50秒，延伸72 ℃ 75秒，循环28次，最后，72 ℃延伸7 分钟。
1.3.5 逆转录聚合酶链反应(RTPCR)产物检测：取10 μl PCR反应产物，进行2%琼脂糖凝胶电泳(含0.5 mg/L溴化乙锭)分析，以174XHINC Ⅱ为分子量标准，电泳缓冲液为1X TBE ，电泳完毕后，在凝胶自动成像仪上进行照像、数据分析。
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1.4 统计学方法：全部实验数据以均值±标准差(
±s)表示，t检验。2 结 果
2.1 中西药对患者LDLR mRNA影响见表1。
表1 药物对高脂血症患者血中LDLR mRNA(LDLR/β2MG)水平影响(
±s) 组别例数(例)
治疗前
治疗后
中药组
, 百拇医药
15
0.246 5±0.131 6
0.625 4±0.166 9*
对照组
15
0.298 4±0.142 5
0.789 9±0.374 4*
注：与本组治疗前比较：*P<0.01
2.2 中药组RTPCR产物电泳结果见图1。
, 百拇医药
图1 中药治疗前后的RTPCR产物电泳图
2.3 对照组RTPCR产物电泳结果见图2。
图2 西药治疗前后的RTPCR产物电泳图
3 讨 论
近年来，国内外学者对LDLR 的功能从生化、免疫、遗传学等方面作了大量研究，认为血浆中2/3以上的LDL是通过LDLR途径降解的，其基因表达异常可影响LDL的清除，使血中LDL水平升高，导致高脂血症、动脉粥样硬化〔2〕。临床大量研究资料表明，血胆固醇、甘油三酯水平升高，尤其是LDL水平升高，可增加冠心病危险性；反之，可减少冠心病危险性，减缓动脉粥样硬化的进程，甚至消退部分脂质斑块。因此，目前把降低LDL作为降脂治疗的主要目标〔1，3〕。以往人们对LDLR基因表达的研究多取材于实验动物肝细胞或人皮肤成纤维细胞，难以在临床上推广。人新鲜外周血淋巴细胞表面具有LDLR，其表达水平的高低代表人体内其它细胞，尤其是肝细胞的LDLR状态。因此，从外周血淋巴细胞可以观察药物对LDLR基因表达水平的影响〔46〕。本研究应用RTPCR技术，检测用药后患者外周血LDLR基因表达相对水平增高，间接提示高脂血症患者的LDLR转录水平处于严重的抑制状态，这与以往国内外报道的实验资料一致〔7，8〕，说明中药复方颗粒剂可以解除这种作用，从而降低血中LDL水平，调控血脂水平。
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现代药理研究表明，黄芪、丹参、栝蒌、薤白、益母草等皆有降血脂作用，尤其丹参能升高实验性高胆固醇大鼠肝及人成纤维细胞LDLR mRNA水平〔9〕。本研究本着扶正祛邪、标本兼顾的原则，以《金匮要略》中栝蒌薤白半夏汤为基础加味组成的中药复方颗粒剂具有升高高脂血症患者血中LDLR mRNA水平，调控血脂水平的作用，其机制可能是进一步促进LDLR表达，加速脂蛋白分解，由于LDLR的这种降解作用，使血中LDL减少。说明中药复方颗粒剂对基因表达的异常有影响作用，这种作用是否是对LDLR具有翻译和翻译后水平的调节作用，从而达到调控血脂水平的目的，有待进一步研究。
目前，国内外对LDLR功能缺陷的治疗一是采用基因替代疗法，二是采用羟甲基戊二酰辅酶A(HMGCoA)还原酶抑制剂治疗〔10〕。力平脂属贝特类降脂药物，其主要药理作用是抑制HMGCoA还原酶，增加LDLR的表达，从而降低LDL水平〔11〕。此药降脂作用虽好，但停药后易反跳，且有一定不良反应，长期使用其安全性也有待证明。本研究发现中药复方颗粒剂与力平脂疗效无明显差异，但却明显增强高脂血症患者外周血中LDLR基因表达水平，调控了血脂水平，达到了治疗目的，长期应用无不良反应。■
, 百拇医药
基金项目：辽宁省教委基金资助项目(9703221098)
辽宁省科委自然科学基金资助项目(972122)
获奖项目：辽宁省科委科学技术研究成果(990218)
本文曾在2000年国际传统医药大会上交流
作者简介：刘萍(1966)，女(汉族)，辽宁省人，博士研究生，讲师。
参考文献：
〔1〕夏舜英.脂质异常与冠心病的新概念.临床心血管病杂志，1994，10(5)：314315.
〔2〕秦树存，王士雯.低密度脂蛋白受体缺陷的诊断与治疗.心血管学进展，1995，16(1)：2225.
, 百拇医药
〔3〕王克勤.脂蛋白与动脉粥样硬化.第1版.北京：人民卫生出版社，1995.278296.
〔4〕Wang A M，Doyle M V,Mark D F.Quantitation of mRNA by the polymerase chain reaction proc.Natl Acal Sci USA,1989,86(24):97179721.
〔5〕秦树存，王士雯.低密度脂蛋白受体基因表达研究进展.国外医学老年医学分册，1996，17(1)：48.
〔6〕Cuthbert J A,Lipsky P E.Mitogenic stimulation alters the regulation of LDL receptor gene expression in human lymphocytes.J Lipid Res,1990,31:20672078.
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〔7〕李锡明，Windler E.冠心病患者血淋巴细胞mRNA的表达.中国循环杂志,1996,11(3)：137139.
〔8〕Stulning T M,Klocker H,Harwood H J.In vivo LDL receptor and HMGCoA reductase regulation in human lymphocytes and its alteration during aging.J Arteriosocler Thromb Vasc Biol,1995,15:872878.
〔9〕姜传仓，蔡海江，范乐明.丹参对LDLR及ApoAI mRNA水平的影响.南京医科大学学报，1994，14(4)：522525.
〔10〕Lecras T D,Gherardi E,Bowyer D E.A sensitive RNase Protection assay for the quantitation of the mRNA for the LDL receptor and HMGCoA reductase in human total RNA.J Atherosclerosis,1991,90:8190.
〔11〕石永兵，刘志达.老年人高脂血症治疗进展.实用老年医学，1994，8(4)：174175.
收稿日期：1999-11-12
修回日期：2000-03-28, http://www.100md.com