缺血预处理对沙土鼠脑缺血再灌注后线粒体功能的影响
作者：陶沂 石晶 郑惠民 缪明永 王学敏
单位：陶沂 郑惠民(上海第二军医大学长海医院神经内科 200433)；石晶(临床药理室)缪明永 王学敏(生化教研室)
关键词：脑缺血；缺血耐受；线粒体；沙土鼠
临床神经病学杂志000304 【摘要】 目的 观察缺血预处理对沙土鼠脑缺血再灌注后脑组织线粒体功能的影响。方法 用沙土鼠双侧颈总动脉结扎制成全脑缺血模型(缺血20分钟，再灌注30分钟)。动物随机分为预缺血组、模型组和假手术组。预缺血组给予两次(各2分钟)缺血预处理(间隔48小时)。用氧电极法测定呼吸功能和呼吸链的氧化酶(NADH氧化酶、琥珀酸氧化酶、细胞色素C氧化酶)活性。结果 缺血模型组动物的呼吸控制率、磷氧比及氧化磷酸化效率均较假手术组有不同程度的降低，3种氧化酶的活性亦较假手术组明显降低。而预缺血组的这种改变不明显，各测定值接近假手术组，但与模型组的差异显著。结论 缺血预处理可以减轻缺血再灌注后脑线粒体功能的损伤。
, 百拇医药
Effect of ischemic preconditioning on mitochondrial function after cerebral ischemic reperfusion in gerbils
Tao Yi Shi Jing Zheng Huimin et al
(Department of Neurology, Changhai Hospital,The Second Military Medical University, Shanghai 200433)
【Abstract】 Objective To observe the effect of ischemic preconditioning on mitochondrial function after cerebral ischemic reperfusion in gerbils.Methods Global cerebral ischemia model was made by occlusion of bilateral carotid arteries in gerbils (ischemia for 20 min and reperfusion for 30 min). Gerbils were divided into three groups-preischemia, mo-del and sham operation. Gerbils in preischemia group were undergone two times (each 2 min) transient ischemic preconditioning (48 h interval). The mitochondrial respiratory function and the activities of NADH oxidase, succinate oxidase and cytochrome C oxidase were measured with Clark oxygen electrode.Results The respiratory control rate, phosphorus oxygen ratio and oxidation-phosphorylation rate of neural mitochondria in model group decreased after ischemia and reperfusion as comparaed with the sham operation group in diffe-rent degree. The activities of three oxidases were significantly lower in model group than the sham operation group. Whereas the change in preischemia group was not apparently detec-ted. All values measured in preconditioning group were similar to the sham operation group, but there was significant difference as compared with the model group.Conclusion The injury of neural mitochondrial function induced by ischemia and reperfusion could be alleviated by ischemic preconditioning.
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【Key words】 Cerebral ischemia Ischemic tolerance Mitochondria Gerbil
缺血性耐受是近年发现的对缺血性损伤具有保护作用的一种现象，普遍存在于心脏和脑缺血性损伤中[1,2]。线粒体是细胞氧化代谢的主要场所，其结构和功能的变化在缺血性脑损伤的发生发展中起到重要作用。本研究用沙土鼠双侧颈总动脉结扎的脑缺血模型，着重探讨了缺血预处理对脑线粒体的呼吸功能及其氧化酶活性的影响。
1 材料与方法
1.1 动物及分组 雄性沙土鼠30只，体重50～70 g，购自上海生物制品研究所。将动物随机分为3组：预缺血组、缺血模型组和假手术组。
1.2 方法
1.2.1 预缺血模型的制备 预缺血组动物的手术步骤为：沙土鼠用水合氯醛350 mg/kg 腹腔注射麻醉后，用动脉钳夹闭双侧颈总动脉2分钟，间隔48小时再次缺血2分钟。再间隔24小时夹闭双侧颈总动脉缺血20分钟，再灌注30分钟后迅速断头取脑，去除小脑和脑干，制备线粒体。模型组动物除不进行预缺血外，其余步骤同预缺血组，假手术组则不夹闭颈总动脉。
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1.2.2 脑线粒体的制备 按改良Clark 法[3]取双侧大脑半球，每克脑组织加10 ml预冷的分离介质(甘露醇 225 mmol/L，蔗糖 75 mmol/L，EGTA 1 mmol/L，Tris-HCl 15 mmol/L, BSA 25%, pH 7.4)。用玻璃匀浆器充分匀浆后离心7 分钟(700×g,4℃)，取上清液再离心10分钟(7000×g, 4℃)。弃上清，沉淀加分离介质少许制成线粒体悬液，用Lowry法测定线粒体蛋白含量，取200 μl置低温冰箱保存用于酶活性测定，其余样品用于测定线粒体呼吸功能。
1.2.3 线粒体呼吸功能的测定 按 Clark氧电极法[3]在反应室中依次加入反应介质(甘露醇 225 mmol/L，蔗糖 75 mmol/L，EGTA 0.1 mmol/L，Tris-HCl 20 mmol/L, PBS 3 mmol/L, KCl 10 mmol/L，BSA 25%, pH 7.4)，线粒体悬液(蛋白含量1 mg/ml)，底物(2 mmol/L谷氨酸+苹果酸，或4 mmol/L琥珀酸)及ADP(0.4 mmol/L)。描记呼吸曲线，计算呼吸控制率(RCR)、磷氧比(P/O)及氧化磷酸化效率(OPR)。
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1.2.4 呼吸链氧化酶的测定 (氧电极法)[3]所用介质如下： NADH氧化酶： 80 mmol/L PBS, pH 7.4，3 μmol/L细胞色素C，2 μmol/L NADH； 琥珀酸氧化酶：80 mmol/L PBS,pH 7.4，3 μmol/L细胞色素C，5 mmol/L 琥珀酸；细胞色素C氧化酶：10 mmol/L PBS, pH 7.4，1 μmol/L细胞色素C，5 μmol/L 抗坏血酸，2.7 mmol/L TMPD(四甲基苯二胺)。
1.2.5 统计学方法 以上实验所得数据用均数±标准差(
±s)表示，用方差分析判断统计学意义。
2 结 果
2.1 线粒体呼吸功能变化 各组动物脑线粒体以琥珀酸(SUC)为底物和以谷氨酸+苹果酸(G+M)为底物的两条呼吸链所测得的RCR、P/O以及OPR的结果见表1、表2、表3。
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表1 预缺血后沙土鼠脑线粒体RCR的变化(±s) 组 别
RCR
G+M为底物
SUC为底物
预缺血组(n=10)
3.47±0.4*
2.45±0.5
缺血模型组(n=10)
2.93±0.3△
1.99±0.4△
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假手术组(n=8)
3.25±0.5
2.55±0.4
与假手术组比较△P<0.05，与缺血模型组比较*P<0.01表2 预缺血后沙土鼠脑线粒体P/O的变化(±s) 组 别
P/O
G+M为底物
SUC为底物
预缺血组(n=10)
2.13±0.3*
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1.61±0.2**
缺血模型组(n=10)
1.85±0.2△
1.32±0.2△△
假手术组(n=9)
2.15±0.4
1.63±0.2
与假手术组比较△P<0.05,△△P<0.01；与缺血模型组比较*P<0.05,**P<0.01表3 预缺血后沙土鼠脑线粒体OPR的变化(±s) 组 别
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OPR(nmol ADP/min.mg pro)
G+M为底物
SUC为底物
预缺血组(n=10)
612.8±179.5*
562.1±77.0**
缺血模型组(n=10)
457.5±105.0
488.2±55.7△
假手术组(n=9)
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555.0±123.6
571.7±51.3
与假手术组比较△P<0.05，与缺血模型组比较*P<0.05,**P<0.01
由表1～表3 可知，缺血组脑线粒体的功能明显受损，表现为RCR下降、P/O下降、OPR降低，而预缺血组缺血后的线粒体呼吸功能则有明显改善，与模型组比较RCR有所提高，P/O增加，因而OPR也有所提高，且有统计学意义(P<0.05～0.01)。
2.2 线粒体呼吸链氧化酶活性的变化 各组动物脑线粒体中细胞色素C(cyt C)氧化酶、NADH氧化酶、琥珀酸氧化酶活性见表4。由表4可见缺血模型组三个氧化酶活性均较假手术组明显降低(P<0.01)，提示呼吸链上的氧化酶功能受损，预缺血组的三个氧化酶活性均比缺血组明显改善，且有统计学意义(P<0.05～0.01)。
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表4 预缺血对沙土鼠脑线粒体氧化酶活性的影响(nmol O/min.mg pro，±s) 组 别
cyt C氧化酶
NADH氧化酶
琥珀酸氧化酶
预缺血组
(n=10)
501.76±96.3**
275.08±59.7*
141.20±20.5**
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缺血模型组
(n=10)
393.77±82.9△
228.95±42.6△
99.58±19.1△
假手术组
(n=10)
519.76±86.3
290.83±35.8
137.83±17.6
与假手术组比较△P<0.01；与缺血模型组比较*P<0.05,**P<0.01
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3 讨 论
脑缺血缺氧性损伤时，线粒体功能失调的改变发生最早。线粒体的呼吸控制率(RCR)是反映线粒体呼吸功能的敏感指标。而NADH氧化酶、琥珀酸氧化酶、cyt-C氧化酶则分别反映线粒体的NAD呼吸链、FAD呼吸链以及cyt-C等部分的氧化功能。本实验中缺血组沙土鼠脑细胞RCR、P/O、OPR较假手术组均有所下降(P<0.05～0.01)，而上述3个氧化酶的活性亦较假手术组明显降低(均P<0.01)，与以往的研究结果一致[4]。说明缺血再灌注可引起线粒体呼吸功能的损伤，表现为氧化磷酸化偶联能力降低，利用氧的能力下降。
缺血性耐受是在持续性梗死前一定时间内给予一个短暂的缺血预处理，可以提高脑组织抗缺血性损伤的能力，减小梗死体积，减轻缺血后脑组织的损伤或死亡，其机理尚未完全阐明。有人提出可能与脑的能量代谢改善有关[1，5]，而线粒体是细胞能量代谢的主要场所。本实验中预缺血后脑RCR、OPR以及呼吸链中的三个氧化酶活性均较缺血模型组有所改善，表明预缺血后可以通过提高线粒体的氧化磷酸化能力改善细胞的能量供应，从而提高细胞抗缺血缺氧的能力，这一点在脑缺血时尤为重要。脑的缺血性耐受机理较为复杂，涉及到许多新的蛋白质的合成以及一些受体的激活等多种因素[1]，本研究结果提示线粒体呼吸功能的改善可能也是脑缺血性耐受的机理之一。
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参 考 文 献
1，Chen J,Simon R.Ischemic tolerance in the brain.Neurology,1997,48:306
2，Miura T, Tsuchida A. Adenosine and preconditioning revisited. Clin Exp Pharmacol and Physiol, 1999, 26:92
3，Clark JB, Nicklas WJ. The metabolism of rat brain mitochondria. J Biochem, 1970, 245:4724
4，Almeida A, Allen KL, Bates TE, et al. Effect of reperfusion following cerebral ischemia on the activity of the mitochondrial rrespiratory-chain in the gerbil brain. J Neurochem, 1995,165: 1698
5，Katayama Y, Muramatsu H, Kaniya T, et al. Ischemic tolerance phenomenon from an approach of energy metabolism and the mitochondrial enzyme activity of pyruvute dehydrogenase in gerbils. Brain Res, 1997,746:126
收稿1999-09-20
修回1999-12-15, 百拇医药
单位：陶沂 郑惠民(上海第二军医大学长海医院神经内科 200433)；石晶(临床药理室)缪明永 王学敏(生化教研室)
关键词：脑缺血；缺血耐受；线粒体；沙土鼠
临床神经病学杂志000304 【摘要】 目的 观察缺血预处理对沙土鼠脑缺血再灌注后脑组织线粒体功能的影响。方法 用沙土鼠双侧颈总动脉结扎制成全脑缺血模型(缺血20分钟，再灌注30分钟)。动物随机分为预缺血组、模型组和假手术组。预缺血组给予两次(各2分钟)缺血预处理(间隔48小时)。用氧电极法测定呼吸功能和呼吸链的氧化酶(NADH氧化酶、琥珀酸氧化酶、细胞色素C氧化酶)活性。结果 缺血模型组动物的呼吸控制率、磷氧比及氧化磷酸化效率均较假手术组有不同程度的降低，3种氧化酶的活性亦较假手术组明显降低。而预缺血组的这种改变不明显，各测定值接近假手术组，但与模型组的差异显著。结论 缺血预处理可以减轻缺血再灌注后脑线粒体功能的损伤。
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Effect of ischemic preconditioning on mitochondrial function after cerebral ischemic reperfusion in gerbils
Tao Yi Shi Jing Zheng Huimin et al
(Department of Neurology, Changhai Hospital,The Second Military Medical University, Shanghai 200433)
【Abstract】 Objective To observe the effect of ischemic preconditioning on mitochondrial function after cerebral ischemic reperfusion in gerbils.Methods Global cerebral ischemia model was made by occlusion of bilateral carotid arteries in gerbils (ischemia for 20 min and reperfusion for 30 min). Gerbils were divided into three groups-preischemia, mo-del and sham operation. Gerbils in preischemia group were undergone two times (each 2 min) transient ischemic preconditioning (48 h interval). The mitochondrial respiratory function and the activities of NADH oxidase, succinate oxidase and cytochrome C oxidase were measured with Clark oxygen electrode.Results The respiratory control rate, phosphorus oxygen ratio and oxidation-phosphorylation rate of neural mitochondria in model group decreased after ischemia and reperfusion as comparaed with the sham operation group in diffe-rent degree. The activities of three oxidases were significantly lower in model group than the sham operation group. Whereas the change in preischemia group was not apparently detec-ted. All values measured in preconditioning group were similar to the sham operation group, but there was significant difference as compared with the model group.Conclusion The injury of neural mitochondrial function induced by ischemia and reperfusion could be alleviated by ischemic preconditioning.
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【Key words】 Cerebral ischemia Ischemic tolerance Mitochondria Gerbil
缺血性耐受是近年发现的对缺血性损伤具有保护作用的一种现象，普遍存在于心脏和脑缺血性损伤中[1,2]。线粒体是细胞氧化代谢的主要场所，其结构和功能的变化在缺血性脑损伤的发生发展中起到重要作用。本研究用沙土鼠双侧颈总动脉结扎的脑缺血模型，着重探讨了缺血预处理对脑线粒体的呼吸功能及其氧化酶活性的影响。
1 材料与方法
1.1 动物及分组 雄性沙土鼠30只，体重50～70 g，购自上海生物制品研究所。将动物随机分为3组：预缺血组、缺血模型组和假手术组。
1.2 方法
1.2.1 预缺血模型的制备 预缺血组动物的手术步骤为：沙土鼠用水合氯醛350 mg/kg 腹腔注射麻醉后，用动脉钳夹闭双侧颈总动脉2分钟，间隔48小时再次缺血2分钟。再间隔24小时夹闭双侧颈总动脉缺血20分钟，再灌注30分钟后迅速断头取脑，去除小脑和脑干，制备线粒体。模型组动物除不进行预缺血外，其余步骤同预缺血组，假手术组则不夹闭颈总动脉。
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1.2.2 脑线粒体的制备 按改良Clark 法[3]取双侧大脑半球，每克脑组织加10 ml预冷的分离介质(甘露醇 225 mmol/L，蔗糖 75 mmol/L，EGTA 1 mmol/L，Tris-HCl 15 mmol/L, BSA 25%, pH 7.4)。用玻璃匀浆器充分匀浆后离心7 分钟(700×g,4℃)，取上清液再离心10分钟(7000×g, 4℃)。弃上清，沉淀加分离介质少许制成线粒体悬液，用Lowry法测定线粒体蛋白含量，取200 μl置低温冰箱保存用于酶活性测定，其余样品用于测定线粒体呼吸功能。
1.2.3 线粒体呼吸功能的测定 按 Clark氧电极法[3]在反应室中依次加入反应介质(甘露醇 225 mmol/L，蔗糖 75 mmol/L，EGTA 0.1 mmol/L，Tris-HCl 20 mmol/L, PBS 3 mmol/L, KCl 10 mmol/L，BSA 25%, pH 7.4)，线粒体悬液(蛋白含量1 mg/ml)，底物(2 mmol/L谷氨酸+苹果酸，或4 mmol/L琥珀酸)及ADP(0.4 mmol/L)。描记呼吸曲线，计算呼吸控制率(RCR)、磷氧比(P/O)及氧化磷酸化效率(OPR)。
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1.2.4 呼吸链氧化酶的测定 (氧电极法)[3]所用介质如下： NADH氧化酶： 80 mmol/L PBS, pH 7.4，3 μmol/L细胞色素C，2 μmol/L NADH； 琥珀酸氧化酶：80 mmol/L PBS,pH 7.4，3 μmol/L细胞色素C，5 mmol/L 琥珀酸；细胞色素C氧化酶：10 mmol/L PBS, pH 7.4，1 μmol/L细胞色素C，5 μmol/L 抗坏血酸，2.7 mmol/L TMPD(四甲基苯二胺)。
1.2.5 统计学方法 以上实验所得数据用均数±标准差(
±s)表示，用方差分析判断统计学意义。2 结 果
2.1 线粒体呼吸功能变化 各组动物脑线粒体以琥珀酸(SUC)为底物和以谷氨酸+苹果酸(G+M)为底物的两条呼吸链所测得的RCR、P/O以及OPR的结果见表1、表2、表3。
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表1 预缺血后沙土鼠脑线粒体RCR的变化(
±s) 组 别RCR
G+M为底物
SUC为底物
预缺血组(n=10)
3.47±0.4*
2.45±0.5
缺血模型组(n=10)
2.93±0.3△
1.99±0.4△
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假手术组(n=8)
3.25±0.5
2.55±0.4
与假手术组比较△P<0.05，与缺血模型组比较*P<0.01表2 预缺血后沙土鼠脑线粒体P/O的变化(
±s) 组 别P/O
G+M为底物
SUC为底物
预缺血组(n=10)
2.13±0.3*
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1.61±0.2**
缺血模型组(n=10)
1.85±0.2△
1.32±0.2△△
假手术组(n=9)
2.15±0.4
1.63±0.2
与假手术组比较△P<0.05,△△P<0.01；与缺血模型组比较*P<0.05,**P<0.01表3 预缺血后沙土鼠脑线粒体OPR的变化(
±s) 组 别, http://www.100md.com
OPR(nmol ADP/min.mg pro)
G+M为底物
SUC为底物
预缺血组(n=10)
612.8±179.5*
562.1±77.0**
缺血模型组(n=10)
457.5±105.0
488.2±55.7△
假手术组(n=9)
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555.0±123.6
571.7±51.3
与假手术组比较△P<0.05，与缺血模型组比较*P<0.05,**P<0.01
由表1～表3 可知，缺血组脑线粒体的功能明显受损，表现为RCR下降、P/O下降、OPR降低，而预缺血组缺血后的线粒体呼吸功能则有明显改善，与模型组比较RCR有所提高，P/O增加，因而OPR也有所提高，且有统计学意义(P<0.05～0.01)。
2.2 线粒体呼吸链氧化酶活性的变化 各组动物脑线粒体中细胞色素C(cyt C)氧化酶、NADH氧化酶、琥珀酸氧化酶活性见表4。由表4可见缺血模型组三个氧化酶活性均较假手术组明显降低(P<0.01)，提示呼吸链上的氧化酶功能受损，预缺血组的三个氧化酶活性均比缺血组明显改善，且有统计学意义(P<0.05～0.01)。
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表4 预缺血对沙土鼠脑线粒体氧化酶活性的影响(nmol O/min.mg pro，
±s) 组 别cyt C氧化酶
NADH氧化酶
琥珀酸氧化酶
预缺血组
(n=10)
501.76±96.3**
275.08±59.7*
141.20±20.5**
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缺血模型组
(n=10)
393.77±82.9△
228.95±42.6△
99.58±19.1△
假手术组
(n=10)
519.76±86.3
290.83±35.8
137.83±17.6
与假手术组比较△P<0.01；与缺血模型组比较*P<0.05,**P<0.01
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脑缺血缺氧性损伤时，线粒体功能失调的改变发生最早。线粒体的呼吸控制率(RCR)是反映线粒体呼吸功能的敏感指标。而NADH氧化酶、琥珀酸氧化酶、cyt-C氧化酶则分别反映线粒体的NAD呼吸链、FAD呼吸链以及cyt-C等部分的氧化功能。本实验中缺血组沙土鼠脑细胞RCR、P/O、OPR较假手术组均有所下降(P<0.05～0.01)，而上述3个氧化酶的活性亦较假手术组明显降低(均P<0.01)，与以往的研究结果一致[4]。说明缺血再灌注可引起线粒体呼吸功能的损伤，表现为氧化磷酸化偶联能力降低，利用氧的能力下降。
缺血性耐受是在持续性梗死前一定时间内给予一个短暂的缺血预处理，可以提高脑组织抗缺血性损伤的能力，减小梗死体积，减轻缺血后脑组织的损伤或死亡，其机理尚未完全阐明。有人提出可能与脑的能量代谢改善有关[1，5]，而线粒体是细胞能量代谢的主要场所。本实验中预缺血后脑RCR、OPR以及呼吸链中的三个氧化酶活性均较缺血模型组有所改善，表明预缺血后可以通过提高线粒体的氧化磷酸化能力改善细胞的能量供应，从而提高细胞抗缺血缺氧的能力，这一点在脑缺血时尤为重要。脑的缺血性耐受机理较为复杂，涉及到许多新的蛋白质的合成以及一些受体的激活等多种因素[1]，本研究结果提示线粒体呼吸功能的改善可能也是脑缺血性耐受的机理之一。
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参 考 文 献
1，Chen J,Simon R.Ischemic tolerance in the brain.Neurology,1997,48:306
2，Miura T, Tsuchida A. Adenosine and preconditioning revisited. Clin Exp Pharmacol and Physiol, 1999, 26:92
3，Clark JB, Nicklas WJ. The metabolism of rat brain mitochondria. J Biochem, 1970, 245:4724
4，Almeida A, Allen KL, Bates TE, et al. Effect of reperfusion following cerebral ischemia on the activity of the mitochondrial rrespiratory-chain in the gerbil brain. J Neurochem, 1995,165: 1698
5，Katayama Y, Muramatsu H, Kaniya T, et al. Ischemic tolerance phenomenon from an approach of energy metabolism and the mitochondrial enzyme activity of pyruvute dehydrogenase in gerbils. Brain Res, 1997,746:126
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