四种心肌保护方法对心肌细胞质膜蛋白的影响
作者：陈晓东 张宝仁 朱家麟 王志农 丁芳宝 黄盛东
单位：
关键词：停搏液；质膜蛋白；心肌保护
第二军医大学学报000416 【摘要】目的：研究4种心肌保护方法对心肌细胞质膜蛋白结构和功能的影响，评价其心肌保护效果。方法：复制动物模型，检测心肌细胞质膜ATP酶活性、质膜蛋白形态、二级结构及电泳谱型变化。结果：(1)缺血期间，各组Na+,K+泵活性均显著下降；体外循环180 min,Ⅵ组恢复较好。Ca2+,Mg2+泵与Na+,K+泵活性变化规律相似。(2) 复灌后1.8 万以下质膜蛋白条带出现不同程度缺失。(3) 各组间质膜蛋白颗粒等效直径无明显差异。缺血期间，Ⅵ组单位面积质膜蛋白颗粒数无明显减少。(4) 各组心肌细胞质膜总蛋白二级结构呈无规律变化。结论：单纯CPB对心肌细胞质膜蛋白无影响；激活的蛋白酶在缺血再灌注损伤中可能具有重要作用；4种心肌保护方法均不能完全遏制再灌注损伤的发生；温血停搏液心肌保护效果较好。
, 百拇医药
【中图分类号】R 654.1 【文献标识码】A
【文章编号】0258-879X(2000)04-0353-05
Effects of 4 kinds of myocardial protection methods on the myocardial membrane-proteins
ZHANG Bao-Ren,ZHU Jia-Lin,WANG Zhi-Nong,DING Fang-Bao,HUANG Sheng-Dong
(Department of Cardiothoracic Surgery,Changhai Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)
, 百拇医药 CHEN Xiao-Dong
(Department of Pathology,General Hospital,Guangzhou Command,Guangzhou 510010,China)
【ABSTRACT】Objective:To investigate the effects of 4 kinds of myocardial protection methods on the myocardial membrane-proteins (MMPs),and to evaluate their cardioprotective effects.Methods:The feline cardiopulmonary bypass (CPB) models were established,and the activities of myocardial membrane ATPase,the alterations of MMPs electrophoretogram,the morphology and the secondary structures of MMPs were all detected.Results:(1) During aortic cross-clamping (ACC) period,the activities of myocardial membrane Na+,K+-ATPase were decreased significantly.After180 min CPB,better recovery were seen in Group Ⅵ.The changes of myocardial membrane Ca2+,Mg2+-ATPase activities were similar to that of Na+,K+-ATPase activities.(2) Deletions of MMPs,molecular mass less than 18 000,were observed to different extent after reperfusion.(3) No significant differences were detected in the equivalent diameters of MMPs particles in all groups.During ACC,the numbers of MMPs particles kept stable in Group Ⅵ.(4) No relationships were established between the alterations of MMPs' secondary structures and myocardial ischemia/reperfusion injuries (IRI) in all groups.Conclusion:CPB without ACC exerts no detrimental effects on the MMPs.The activated proteinases may play an important role in the course of IRI.Four kinds of myocardial protection methods used in this study can not prevent the occurrence of IRI completely.Administration of warm blood cardioplegia continuously offers the best cardioprotection.
, 百拇医药
【KEY WORDS】cardioplegia; membrane-proteins; cardioprotection
本研究通过复制体外循环动物模型,研究4种心肌保护方法对其细胞质膜蛋白结构和功能等方面的影响,以评价保护效果并 筛选最佳心肌保护方法。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组 健康家猫102只,雌雄不拘,体质量2.5～3.5kg,随机分为6组(Ⅰ组 n=15,Ⅱ～Ⅵ组 n=27):Ⅰ组为正常对照组,仅作心肺转流(cardiopulmnary bypass,CPB)不阻断升主动脉; Ⅱ组为缺血再灌注损伤组,即升主动脉阻断期间(aortic cross-clamping,ACC)不给予停搏液保护心肌; Ⅲ～Ⅵ组ACC期间分别行4℃低钾晶体停搏液间断、4℃高钾晶体停搏液间断、4℃高钾含血停搏液持续和37℃低钾含血停搏液持续顺行灌注保护心肌。Ⅲ～Ⅵ组实验条件及CPB动物模型建立参见文献[1]。各组CPB总转流时间均为180 min,其中Ⅱ～Ⅵ组ACC 60 min,体外循环120 min; 动态观测时间点为:ACC期间设15和60 min,以及升主动脉开放后体外循环设15,30,90和120 min时间点。
, http://www.100md.com
1.2 实验方法 分别采用Reinila和Sulakhe法测定心肌细胞质膜Na+,K+-ATPase及Ca2+,Mg2+-ATPase活性;单位面积(每μm2)心肌细胞质膜蛋白颗粒数及其等效直径采用冷冻复型技术进行研究(Balzers BAF-400D冷冻蚀刻仪),并将图像输入图像分析仪(Leitz MPV-Tasplus multifunction image analyser,Germany)量化结果; 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)研究心肌细胞质膜蛋白电泳谱型变化; 采用拉曼光谱技术(Spex1403 Raman spectrometer with DM-1A,USA)研究心肌细胞膜总蛋白二级结构变化。
1.3 统计学处理 用线性拟合统计软件SPLM2.3先行方差分析,若P<0.05则行两两间比较(SNK法); 率的比较用χ2检验。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 心肌细胞质膜Na+,K+-ATPase及Ca2+,Mg2+-ATPase活性 正常猫心肌细胞质膜Na+,K+-ATPase及Ca2+,Mg2+-ATPase活性,分别为(10.71±0.85)μmol /mg.h-1和(21.91±0.99)μmol /mg.h-1。各组心肌细胞质膜Na+,K+-ATPase及Ca2+,Mg2+-ATPase活性见表1,2。
表 1 各组心肌细胞质膜Na+,K+-ATPase活性
, http://www.100md.com
Tab 1 Values of Na+,K+-ATPase activities in all groups
〔(z/m)/μmol.mg-1.h-1〕 Group
CPB (t/min)
15
60
75
90
150
180
Ⅰ
, http://www.100md.com
10.65±0.73
10.81±0.91
9.79±0.53
9.82±0.46
Ⅱ
9.51±0.45
7.59±0.36**
6.72±0.12
5.62±0.25
5.26±0.18
5.06±0.35□
, http://www.100md.com
Ⅲ
9.99±0.58
8.14±0.20**△
7.19±0.12
6.27±0.07
6.67±0.08
7.24±0.26□△△
Ⅳ
9.76±0.09
8.69±0.17**△△
7.45±0.10
, 百拇医药
6.67±0.11
7.12±0.09
7.17±0.13□△△
Ⅴ
9.77±0.15
9.05±0.10**△△▲
8.18±0.18
7.25±0.16
7.50±0.11
7.75±0.14□△△
Ⅵ
, http://www.100md.com
9.72±0.17
9.24±0.07**△△▲▲
8.44±0.19
8.26±0.12
8.53±0.08
8.83±0.18□△△▲▲
** P<0.01 vs CPB 15 min; △ P<0.05,△△ P<0.01 vs GroupⅡ; ▲ P<0.05,▲▲ P<0.01 vs GroupⅢ; □ P<0.05 vs CPB 90 min表 2 各组心肌细胞膜Ca2+,Mg2+-ATPase活性
, http://www.100md.com
Tab 2 Values of Ca2+,Mg2+-ATPase activities in all group
〔(z/m)/μmol.mg-1.h-1〕 Group
CPB (t/min)
15
60
75
90
150
180
Ⅰ
, 百拇医药
21.87±0.71
22.52±1.82
20.85±2.10
21.34±2.02
Ⅱ
20.50±0.03
16.61±1.16*
15.23±0.49
15.14±0.31
13.71±1.09
13.15±0.45
, 百拇医药
Ⅲ
20.11±1.37
16.98±0.67*
16.14±0.92
15.77±0.15
16.22±0.64
17.19±0.91△△
Ⅳ
20.40±0.67
17.99±0.32*
17.04±0.89
, http://www.100md.com
16.37±0.20
16.72±1.22
17.29±1.47△△
Ⅴ
20.41±0.53
17.71±0.59*
16.93±0.72
16.10±0.34
16.90±0.63
17.44±0.94△△
Ⅵ
, http://www.100md.com
20.68±0.79
19.43±0.98△▲
17.81±0.51
17.12±0.52
18.80±0.66
20.10±0.73△△▲□□
* P<0.05 vs CPB 15 min; △ P<0.05,△△ P<0.01 vs GroupⅡ;▲ P<0.05 vs GroupⅢ ; □□ P<0.01 vs CPB 90 min; 2.2 心肌细胞质膜蛋白颗粒数及其等效直径 心肌细胞质膜冷冻断裂面两侧颗粒分布不对称，凸面(亦称P面)多于凹面(亦称E面)，且各组凹面颗粒数无显著差别，本研究中显示的颗粒数均为P面颗粒计数。 根据图像分析仪设定参数及电子显微镜放大倍数，质膜蛋白颗粒数实际值=0.09×测定值(个/μm2),质膜蛋白颗粒等效直径实际值=3.33×测定值(nm)。从心肌细胞质膜冷冻断裂面上可观察到等效直径为3～11 nm的半球形质膜蛋白颗粒。各组各时间点质膜蛋白颗粒等效直径差异不显著(P>0.05)。Ⅰ组各时间点单位面积质膜蛋白颗粒数无差异(P>0.05)，均数为(7.48±0.91)个/μm2。Ⅰ～Ⅵ组各时间点单位面积质膜蛋白颗粒数见表3。
, 百拇医药
表 3 Ⅰ～Ⅵ组各时间点心肌细胞质膜蛋白颗粒数
Tab 3 The numbers of myocardial membrane-proteins particles of GroupⅠ-Ⅵ on different time points
(
±s，个/μm2) Group
CPB (t/min)
15
60
75
90
, http://www.100md.com 150
180
Ⅰ
7.56±1.04
7.40±1.64
7.51±1.03
7.39±0.46
Ⅱ
5.51±0.27
4.11±0.18**
3.99±0.12
3.92±0.33
, 百拇医药
3.76±0.39
3.72±0.12▲
Ⅲ
5.76±0.43
4.77±0.40*
4.53±0.55
3.58±0.48
4.16±0.50
4.21±0.26
Ⅳ
5.49±0.54
, http://www.100md.com 4.98±0.46△
4.61±0.65
4.19±0.19
4.25±0.41
4.39±0.34△
Ⅴ
5.93±0.64
4.87±0.42△
4.65±0.60
4.26±0.49
4.51±0.19
, 百拇医药
4.97±0.40△
Ⅵ
6.47±0.35
5.83±0.34△△
4.94±0.39
4.76±0.57
5.79±0.44
5.82±0.31△△▲▲
* P<0.05,** P<0.01 vs CPB 15 min; △ P<0.05,△△ P<0.01 vs GroupⅡ; ▲P<0.05,▲▲ P<0.01 vs CPB 90 min2.3 拉曼光谱法分析心肌细胞质膜总蛋白二级结构 正常猫心肌细胞质膜总蛋白α-螺旋、β-片层和无规则卷曲(random coil)分别为24.34%,74.10%和1.56%。Ⅰ～Ⅵ组各时间点心肌细胞质膜总蛋白二级结构无统计学差异(P>0.05),见表4。
, 百拇医药
表 4 Ⅰ～Ⅵ组各时间点心肌细胞质膜蛋白二级结构的类型
Tab 4 Type of secondary structures of GroupⅠ-Ⅵ myocardial membrane-proteins on different time points
(%) Group
Type of Ⅱ structure
CPB (t/min)
15
60
75
90
150
, 百拇医药
180
Ⅰ
α-helix
50.74
34.70
63.58
56.47
β-sheet
42.16
64.40
26.34
33.23
Random coil
, http://www.100md.com
7.10
0.90
10.08
10.30
Ⅱ
α-helix
44.94
37.74
35.50
24.60
83.66
26.20
β-sheet
, 百拇医药
0
62.26
64.50
75.40
16.34
73.80
Random coil
55.06
0
0
0
0
0
, 百拇医药
Ⅲ
α-helix
42.03
2.02
4.64
0
59.38
49.53
β-sheet
0
97.98
69.67
72.65
, 百拇医药
0
0
Random coil
57.97
0
25.69
27.35
40.62
50.47
Ⅳ
α-helix
91.77
25.44
, 百拇医药
0
49.53
43.45
30.30
β-sheet
8.23
5.44
96.60
50.47
0
0
Random coil
0
, 百拇医药
69.12
3.4
0
56.55
69.70
Ⅴ
α-helix
40.24
35.92
68.34
0
3.82
45.05
, 百拇医药
β-sheet
59.76
0
9.39
90.81
56.12
0
Random coil
0
64.08
22.27
9.19
40.06
, http://www.100md.com
54.95
Ⅵ
α-helix
57.73
61.73
54.33
53.40
34.06
32.53
β-sheet
28.07
38.27
0
, http://www.100md.com
0
13.52
67.47
Random coil
14.20
0
45.67
46.60
52.40
0
2.4 心肌细胞质膜蛋白电泳谱型定性研究 图1显示Ⅰ组心肌细胞质膜蛋白SDS-PAGE电泳谱型。结果表明，单纯体外循环因素没有改变心肌细胞质膜蛋白电泳谱型。取正常猫、单纯体外循环90 min、Ⅱ组ACC 60 min复灌30 min以及ACC期间采用4种心肌保护方法ACC 60 min复灌30 min时间点的电泳谱型进行比较(图2)。结果显示，Ⅱ组ACC 60 min复灌30 min者与Ⅲ组ACC 60 min复灌30 min的电泳谱型相似，表现为相对分子质量在1.8万以下蛋白条带的缺失。但Ⅲ组复灌30 min后1.8万以下蛋白条带有恢复趋势。Ⅴ、Ⅵ组心肌细胞质膜蛋白谱型与正常组相似。
, 百拇医药
图 1 Ⅰ组心肌细胞膜蛋白SDS-PAGE谱型
Fig 1 SDS-PAGE patterns of myocardial
membrane-proteins in Group Ⅰ
Lane 1:Marker;Lane 2:myocardial membrane-proteins of normal
feline;Lane 3-7:Myocardial membrane-proteins of felines on the
time point of CPB 60,90,120,150 min,respectively
, 百拇医药
图 2 各组CPB 90 min时间点心肌细胞膜
蛋白SDS-PAGE谱型
Fig 2 SDS-PAGE patterns of myocardial
membrane-proteins of normal feline
Lane 3-8:Myocardial membrane-proteins of Group Ⅰ to Ⅵ
on the time point of CPB 90 min,respectively
3 讨 论
3.1 心肌细胞质膜ATP酶活性变化 (1) 缺血期间，各组心肌细胞质膜Na+,K+-ATP酶活性均有显著下降。温血停搏液持续顺行灌注心肌保护组与其他各保护组相比较似乎有一定保护作用。但该组也存在明显的Na+,K+-ATP酶损伤。恢复灌注早期，各组均表现为损伤进一步加重，并在复灌30 min总(CPB 90 min)后达到最严重。并且复灌120 min (总CPB 180 min)后仍不能恢复至正常水平。表明：4种心肌保护措施均不能给心肌细胞质膜Na+,K+-ATP酶提供充分的保护。(2) Ca2+,Mg2+-ATP酶与Na+,K+-ATP酶活性的动态变化较相似。但在缺血期间，温血停搏液持续顺行灌注心肌保护组Ca2+,Mg2+-ATP酶活性下降缓慢，而且复灌120 min后恢复良好并接近正常水平。表明温血停搏液持续顺行灌注心肌保护方法无论是在缺血期间还是在恢复灌注后，对心肌细胞质膜Ca2+,Mg2+-ATP酶活性都有良好的保护作用。而Ca2+,Mg2+-ATP酶功能的良好保护从一定程度上减轻了缺血心肌细胞内钙超载——心肌缺血再灌注损伤的一个重要机制，从而起到心肌保护作用。另外有研究表明，温血停搏液还可防止心肌细胞内代谢底物紊乱，稳定心肌细胞内ATP及氨基酸水平，使温血停搏液心肌保护方法有较好的保护效果[2，3]。
, 百拇医药
3.2 心肌缺血再灌注损伤对心肌细胞质膜蛋白电泳谱型的影响 90年代初，Parinandi等[4]设计并实施了自由基对心肌细胞质膜蛋白影响的实验。在实验中用Sulakhe方法(与本研究相同)制备了鼠心肌细胞质膜悬液，并将该悬液分别用不同的自由基生成体系处理。然后将悬液进行SDS-PAGE分析其电泳谱型的变化。结果发现，心肌细胞质膜蛋白表现为肽链的缺失和高分子蛋白条带的深染的改变，而且蛋白质条带的缺失程度与处理强度成正比。同时还提出相对分子质量约2.8万的多肽是最敏感的蛋白，并将此现象归结为“2.8万 reaction”。本研究发现，单纯体外循环180 min对心肌细胞质膜蛋白SDS-PAGE谱型无明显影响；主动脉阻断期间，心肌细胞质膜蛋白SDS-PAGE谱型也均无明显的异常。恢复灌注后，Ⅱ～Ⅵ组心肌细胞质膜蛋白电泳最突出的变化是低于1.8 万的蛋白条带不同程度减少至消失，但是，2.8万条带并无特征性改变，同时也没有观察到高分子蛋白条带深染的改变。这种差异可能是由于实验的材料与方法不同所致。在本研究中所用的动物是猫，而Parinandi用的是鼠，是否由于动物种属的差异会引起质膜蛋白电泳谱型的不同呢？另外，本研究是体内研究，不同于Parinandi的体外制备正常心肌细胞质膜后施以自由基处理。缺血再灌注损伤的过程是一个极为复杂的过程，以往推测在这个过程中质膜蛋白的减少是由于质膜蛋白发生了聚合。我们认为，坏死组织释放蛋白酶以及缺氧损伤细胞内蛋白酶的激活可能在缺血再灌注损伤质膜蛋白改变中起着重要的作用。因为当1.8万以下的蛋白条带减少的同时，并没有出现典型的高分子量蛋白条带的增多现象。而且，冷冻复型的研究结果从另一个侧面支持这种解释。
, 百拇医药
3.3 心肌缺血再灌注损伤对心肌细胞质膜蛋白形态的影响 温血停搏液持续顺灌保护组在缺血及再灌注期间，心肌细胞质膜蛋白均得到了较好的保护，并在复灌120 min(总 CPB 180 min)后单位面积质膜蛋白颗粒数恢复最佳,但仍比正常组差。这可能是本研究仅采用了单一顺行灌注心脏停搏液灌注保护方式，心肌保护不充分。最近的研究表明，无论顺行还是逆行灌注心脏保护液都不能对整个心脏提供充分的保护，即使是温血停搏液保护其心肌，无氧酵解代谢程度依然较高[5,6]。提示采用顺行加逆行灌注方式可能会对整个心脏提供更充分的保护作用。另外，在研究中发现，温血停搏液保护组在主动脉阻断期间，心肌时有蠕动，这在一定程度上削弱了心肌保护效果。
3.4 心肌缺血再灌注损伤对心肌细胞质膜蛋白二级结构的影响 本研究中，心肌细胞质膜蛋白质二级结构的变化与缺血及再灌注损伤之间并无明确的相关性。原因可能是,我们是对质膜总蛋白进行拉曼光谱分析,而不是某种专一蛋白质,所以检测值为质膜总蛋白二级结构的变化趋势。由于不同蛋白质对同一特定的作用因素，其二级结构的变化不尽相同，因此，最终测得的质膜蛋白二级结构也只是各种蛋白质变化后综合的最终结果。另外，为了不影响质膜蛋白的生理状态，在实验中没有用去垢剂将蛋白从质膜脂质中溶出。因此，膜脂也对测定结果存在很大影响。基于这些原因，本研究并未将该结果作为评价心肌保护效果的指标。
, http://www.100md.com
【参考文献】
[1]陈晓东,王志农,张宝仁,等.体外循环中心肌细胞膜蛋白变化的冷冻复型研究[J ].中华实验外科杂志,1998,15(6):563.
[2]Caputo M,Dihmis WC,Bryan AJ,et al.Warm blood hyperkalaemic reperfusion (hot shot) prevent myocardial substrates derangement in patients undergoing coronary artery bypass surgery[J].Eur J Cardiothorac Surg,1998,13(5):559-564.
[3]Bel A,Aznag H,Faris B,et al.Warm blood cardioplegia in high risk patients[J].Eur J Cardiothorac Surg,1997,11(6):1118-1123.
, 百拇医药
[4]Parinandi NL,Zwizinski CW,Schmid HH.Free radical-induced alteration of myocardial membrane proteins[J].Arch Biochem Biophy,1991,289(1):118-123.
[5]Jayawant AM,Stephenson ER Jr,Baumgarten CM,et al.Prevention of cell swelling with low chloride St.Thomas′ Hospital solution improves postischemic myocardial recovery[J].J Thorac Cardiovasc Surg,1998,115(5):1196-1203.
[6]Fiore AC,Swartz MT,Nevett R,et al.Intermittent antegrade tepid versus cold blood cardioplegia in elective myocardial revascularization[J].Ann Thorac Surg,1998,65(6):1559-1564.
【收稿日期】1999-11-04
【修回日期】2000-02-25, 百拇医药
单位：
关键词：停搏液；质膜蛋白；心肌保护
第二军医大学学报000416 【摘要】目的：研究4种心肌保护方法对心肌细胞质膜蛋白结构和功能的影响，评价其心肌保护效果。方法：复制动物模型，检测心肌细胞质膜ATP酶活性、质膜蛋白形态、二级结构及电泳谱型变化。结果：(1)缺血期间，各组Na+,K+泵活性均显著下降；体外循环180 min,Ⅵ组恢复较好。Ca2+,Mg2+泵与Na+,K+泵活性变化规律相似。(2) 复灌后1.8 万以下质膜蛋白条带出现不同程度缺失。(3) 各组间质膜蛋白颗粒等效直径无明显差异。缺血期间，Ⅵ组单位面积质膜蛋白颗粒数无明显减少。(4) 各组心肌细胞质膜总蛋白二级结构呈无规律变化。结论：单纯CPB对心肌细胞质膜蛋白无影响；激活的蛋白酶在缺血再灌注损伤中可能具有重要作用；4种心肌保护方法均不能完全遏制再灌注损伤的发生；温血停搏液心肌保护效果较好。
, 百拇医药
【中图分类号】R 654.1 【文献标识码】A
【文章编号】0258-879X(2000)04-0353-05
Effects of 4 kinds of myocardial protection methods on the myocardial membrane-proteins
ZHANG Bao-Ren,ZHU Jia-Lin,WANG Zhi-Nong,DING Fang-Bao,HUANG Sheng-Dong
(Department of Cardiothoracic Surgery,Changhai Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)
, 百拇医药 CHEN Xiao-Dong
(Department of Pathology,General Hospital,Guangzhou Command,Guangzhou 510010,China)
【ABSTRACT】Objective:To investigate the effects of 4 kinds of myocardial protection methods on the myocardial membrane-proteins (MMPs),and to evaluate their cardioprotective effects.Methods:The feline cardiopulmonary bypass (CPB) models were established,and the activities of myocardial membrane ATPase,the alterations of MMPs electrophoretogram,the morphology and the secondary structures of MMPs were all detected.Results:(1) During aortic cross-clamping (ACC) period,the activities of myocardial membrane Na+,K+-ATPase were decreased significantly.After180 min CPB,better recovery were seen in Group Ⅵ.The changes of myocardial membrane Ca2+,Mg2+-ATPase activities were similar to that of Na+,K+-ATPase activities.(2) Deletions of MMPs,molecular mass less than 18 000,were observed to different extent after reperfusion.(3) No significant differences were detected in the equivalent diameters of MMPs particles in all groups.During ACC,the numbers of MMPs particles kept stable in Group Ⅵ.(4) No relationships were established between the alterations of MMPs' secondary structures and myocardial ischemia/reperfusion injuries (IRI) in all groups.Conclusion:CPB without ACC exerts no detrimental effects on the MMPs.The activated proteinases may play an important role in the course of IRI.Four kinds of myocardial protection methods used in this study can not prevent the occurrence of IRI completely.Administration of warm blood cardioplegia continuously offers the best cardioprotection.
, 百拇医药
【KEY WORDS】cardioplegia; membrane-proteins; cardioprotection
本研究通过复制体外循环动物模型,研究4种心肌保护方法对其细胞质膜蛋白结构和功能等方面的影响,以评价保护效果并 筛选最佳心肌保护方法。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组 健康家猫102只,雌雄不拘,体质量2.5～3.5kg,随机分为6组(Ⅰ组 n=15,Ⅱ～Ⅵ组 n=27):Ⅰ组为正常对照组,仅作心肺转流(cardiopulmnary bypass,CPB)不阻断升主动脉; Ⅱ组为缺血再灌注损伤组,即升主动脉阻断期间(aortic cross-clamping,ACC)不给予停搏液保护心肌; Ⅲ～Ⅵ组ACC期间分别行4℃低钾晶体停搏液间断、4℃高钾晶体停搏液间断、4℃高钾含血停搏液持续和37℃低钾含血停搏液持续顺行灌注保护心肌。Ⅲ～Ⅵ组实验条件及CPB动物模型建立参见文献[1]。各组CPB总转流时间均为180 min,其中Ⅱ～Ⅵ组ACC 60 min,体外循环120 min; 动态观测时间点为:ACC期间设15和60 min,以及升主动脉开放后体外循环设15,30,90和120 min时间点。
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1.2 实验方法 分别采用Reinila和Sulakhe法测定心肌细胞质膜Na+,K+-ATPase及Ca2+,Mg2+-ATPase活性;单位面积(每μm2)心肌细胞质膜蛋白颗粒数及其等效直径采用冷冻复型技术进行研究(Balzers BAF-400D冷冻蚀刻仪),并将图像输入图像分析仪(Leitz MPV-Tasplus multifunction image analyser,Germany)量化结果; 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)研究心肌细胞质膜蛋白电泳谱型变化; 采用拉曼光谱技术(Spex1403 Raman spectrometer with DM-1A,USA)研究心肌细胞膜总蛋白二级结构变化。
1.3 统计学处理 用线性拟合统计软件SPLM2.3先行方差分析,若P<0.05则行两两间比较(SNK法); 率的比较用χ2检验。
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2 结 果
2.1 心肌细胞质膜Na+,K+-ATPase及Ca2+,Mg2+-ATPase活性 正常猫心肌细胞质膜Na+,K+-ATPase及Ca2+,Mg2+-ATPase活性,分别为(10.71±0.85)μmol /mg.h-1和(21.91±0.99)μmol /mg.h-1。各组心肌细胞质膜Na+,K+-ATPase及Ca2+,Mg2+-ATPase活性见表1,2。
表 1 各组心肌细胞质膜Na+,K+-ATPase活性
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Tab 1 Values of Na+,K+-ATPase activities in all groups
〔(z/m)/μmol.mg-1.h-1〕 Group
CPB (t/min)
15
60
75
90
150
180
Ⅰ
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10.65±0.73
10.81±0.91
9.79±0.53
9.82±0.46
Ⅱ
9.51±0.45
7.59±0.36**
6.72±0.12
5.62±0.25
5.26±0.18
5.06±0.35□
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Ⅲ
9.99±0.58
8.14±0.20**△
7.19±0.12
6.27±0.07
6.67±0.08
7.24±0.26□△△
Ⅳ
9.76±0.09
8.69±0.17**△△
7.45±0.10
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6.67±0.11
7.12±0.09
7.17±0.13□△△
Ⅴ
9.77±0.15
9.05±0.10**△△▲
8.18±0.18
7.25±0.16
7.50±0.11
7.75±0.14□△△
Ⅵ
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9.72±0.17
9.24±0.07**△△▲▲
8.44±0.19
8.26±0.12
8.53±0.08
8.83±0.18□△△▲▲
** P<0.01 vs CPB 15 min; △ P<0.05,△△ P<0.01 vs GroupⅡ; ▲ P<0.05,▲▲ P<0.01 vs GroupⅢ; □ P<0.05 vs CPB 90 min表 2 各组心肌细胞膜Ca2+,Mg2+-ATPase活性
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Tab 2 Values of Ca2+,Mg2+-ATPase activities in all group
〔(z/m)/μmol.mg-1.h-1〕 Group
CPB (t/min)
15
60
75
90
150
180
Ⅰ
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21.87±0.71
22.52±1.82
20.85±2.10
21.34±2.02
Ⅱ
20.50±0.03
16.61±1.16*
15.23±0.49
15.14±0.31
13.71±1.09
13.15±0.45
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Ⅲ
20.11±1.37
16.98±0.67*
16.14±0.92
15.77±0.15
16.22±0.64
17.19±0.91△△
Ⅳ
20.40±0.67
17.99±0.32*
17.04±0.89
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16.37±0.20
16.72±1.22
17.29±1.47△△
Ⅴ
20.41±0.53
17.71±0.59*
16.93±0.72
16.10±0.34
16.90±0.63
17.44±0.94△△
Ⅵ
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20.68±0.79
19.43±0.98△▲
17.81±0.51
17.12±0.52
18.80±0.66
20.10±0.73△△▲□□
* P<0.05 vs CPB 15 min; △ P<0.05,△△ P<0.01 vs GroupⅡ;▲ P<0.05 vs GroupⅢ ; □□ P<0.01 vs CPB 90 min; 2.2 心肌细胞质膜蛋白颗粒数及其等效直径 心肌细胞质膜冷冻断裂面两侧颗粒分布不对称，凸面(亦称P面)多于凹面(亦称E面)，且各组凹面颗粒数无显著差别，本研究中显示的颗粒数均为P面颗粒计数。 根据图像分析仪设定参数及电子显微镜放大倍数，质膜蛋白颗粒数实际值=0.09×测定值(个/μm2),质膜蛋白颗粒等效直径实际值=3.33×测定值(nm)。从心肌细胞质膜冷冻断裂面上可观察到等效直径为3～11 nm的半球形质膜蛋白颗粒。各组各时间点质膜蛋白颗粒等效直径差异不显著(P>0.05)。Ⅰ组各时间点单位面积质膜蛋白颗粒数无差异(P>0.05)，均数为(7.48±0.91)个/μm2。Ⅰ～Ⅵ组各时间点单位面积质膜蛋白颗粒数见表3。
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表 3 Ⅰ～Ⅵ组各时间点心肌细胞质膜蛋白颗粒数
Tab 3 The numbers of myocardial membrane-proteins particles of GroupⅠ-Ⅵ on different time points
(
±s，个/μm2) GroupCPB (t/min)
15
60
75
90
, http://www.100md.com 150
180
Ⅰ
7.56±1.04
7.40±1.64
7.51±1.03
7.39±0.46
Ⅱ
5.51±0.27
4.11±0.18**
3.99±0.12
3.92±0.33
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3.76±0.39
3.72±0.12▲
Ⅲ
5.76±0.43
4.77±0.40*
4.53±0.55
3.58±0.48
4.16±0.50
4.21±0.26
Ⅳ
5.49±0.54
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4.61±0.65
4.19±0.19
4.25±0.41
4.39±0.34△
Ⅴ
5.93±0.64
4.87±0.42△
4.65±0.60
4.26±0.49
4.51±0.19
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4.97±0.40△
Ⅵ
6.47±0.35
5.83±0.34△△
4.94±0.39
4.76±0.57
5.79±0.44
5.82±0.31△△▲▲
* P<0.05,** P<0.01 vs CPB 15 min; △ P<0.05,△△ P<0.01 vs GroupⅡ; ▲P<0.05,▲▲ P<0.01 vs CPB 90 min2.3 拉曼光谱法分析心肌细胞质膜总蛋白二级结构 正常猫心肌细胞质膜总蛋白α-螺旋、β-片层和无规则卷曲(random coil)分别为24.34%,74.10%和1.56%。Ⅰ～Ⅵ组各时间点心肌细胞质膜总蛋白二级结构无统计学差异(P>0.05),见表4。
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表 4 Ⅰ～Ⅵ组各时间点心肌细胞质膜蛋白二级结构的类型
Tab 4 Type of secondary structures of GroupⅠ-Ⅵ myocardial membrane-proteins on different time points
(%) Group
Type of Ⅱ structure
CPB (t/min)
15
60
75
90
150
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180
Ⅰ
α-helix
50.74
34.70
63.58
56.47
β-sheet
42.16
64.40
26.34
33.23
Random coil
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7.10
0.90
10.08
10.30
Ⅱ
α-helix
44.94
37.74
35.50
24.60
83.66
26.20
β-sheet
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0
62.26
64.50
75.40
16.34
73.80
Random coil
55.06
0
0
0
0
0
, 百拇医药
Ⅲ
α-helix
42.03
2.02
4.64
0
59.38
49.53
β-sheet
0
97.98
69.67
72.65
, 百拇医药
0
0
Random coil
57.97
0
25.69
27.35
40.62
50.47
Ⅳ
α-helix
91.77
25.44
, 百拇医药
0
49.53
43.45
30.30
β-sheet
8.23
5.44
96.60
50.47
0
0
Random coil
0
, 百拇医药
69.12
3.4
0
56.55
69.70
Ⅴ
α-helix
40.24
35.92
68.34
0
3.82
45.05
, 百拇医药
β-sheet
59.76
0
9.39
90.81
56.12
0
Random coil
0
64.08
22.27
9.19
40.06
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54.95
Ⅵ
α-helix
57.73
61.73
54.33
53.40
34.06
32.53
β-sheet
28.07
38.27
0
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0
13.52
67.47
Random coil
14.20
0
45.67
46.60
52.40
0
2.4 心肌细胞质膜蛋白电泳谱型定性研究 图1显示Ⅰ组心肌细胞质膜蛋白SDS-PAGE电泳谱型。结果表明，单纯体外循环因素没有改变心肌细胞质膜蛋白电泳谱型。取正常猫、单纯体外循环90 min、Ⅱ组ACC 60 min复灌30 min以及ACC期间采用4种心肌保护方法ACC 60 min复灌30 min时间点的电泳谱型进行比较(图2)。结果显示，Ⅱ组ACC 60 min复灌30 min者与Ⅲ组ACC 60 min复灌30 min的电泳谱型相似，表现为相对分子质量在1.8万以下蛋白条带的缺失。但Ⅲ组复灌30 min后1.8万以下蛋白条带有恢复趋势。Ⅴ、Ⅵ组心肌细胞质膜蛋白谱型与正常组相似。
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图 1 Ⅰ组心肌细胞膜蛋白SDS-PAGE谱型
Fig 1 SDS-PAGE patterns of myocardial
membrane-proteins in Group Ⅰ
Lane 1:Marker;Lane 2:myocardial membrane-proteins of normal
feline;Lane 3-7:Myocardial membrane-proteins of felines on the
time point of CPB 60,90,120,150 min,respectively
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图 2 各组CPB 90 min时间点心肌细胞膜
蛋白SDS-PAGE谱型
Fig 2 SDS-PAGE patterns of myocardial
membrane-proteins of normal feline
Lane 3-8:Myocardial membrane-proteins of Group Ⅰ to Ⅵ
on the time point of CPB 90 min,respectively
3 讨 论
3.1 心肌细胞质膜ATP酶活性变化 (1) 缺血期间，各组心肌细胞质膜Na+,K+-ATP酶活性均有显著下降。温血停搏液持续顺行灌注心肌保护组与其他各保护组相比较似乎有一定保护作用。但该组也存在明显的Na+,K+-ATP酶损伤。恢复灌注早期，各组均表现为损伤进一步加重，并在复灌30 min总(CPB 90 min)后达到最严重。并且复灌120 min (总CPB 180 min)后仍不能恢复至正常水平。表明：4种心肌保护措施均不能给心肌细胞质膜Na+,K+-ATP酶提供充分的保护。(2) Ca2+,Mg2+-ATP酶与Na+,K+-ATP酶活性的动态变化较相似。但在缺血期间，温血停搏液持续顺行灌注心肌保护组Ca2+,Mg2+-ATP酶活性下降缓慢，而且复灌120 min后恢复良好并接近正常水平。表明温血停搏液持续顺行灌注心肌保护方法无论是在缺血期间还是在恢复灌注后，对心肌细胞质膜Ca2+,Mg2+-ATP酶活性都有良好的保护作用。而Ca2+,Mg2+-ATP酶功能的良好保护从一定程度上减轻了缺血心肌细胞内钙超载——心肌缺血再灌注损伤的一个重要机制，从而起到心肌保护作用。另外有研究表明，温血停搏液还可防止心肌细胞内代谢底物紊乱，稳定心肌细胞内ATP及氨基酸水平，使温血停搏液心肌保护方法有较好的保护效果[2，3]。
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3.2 心肌缺血再灌注损伤对心肌细胞质膜蛋白电泳谱型的影响 90年代初，Parinandi等[4]设计并实施了自由基对心肌细胞质膜蛋白影响的实验。在实验中用Sulakhe方法(与本研究相同)制备了鼠心肌细胞质膜悬液，并将该悬液分别用不同的自由基生成体系处理。然后将悬液进行SDS-PAGE分析其电泳谱型的变化。结果发现，心肌细胞质膜蛋白表现为肽链的缺失和高分子蛋白条带的深染的改变，而且蛋白质条带的缺失程度与处理强度成正比。同时还提出相对分子质量约2.8万的多肽是最敏感的蛋白，并将此现象归结为“2.8万 reaction”。本研究发现，单纯体外循环180 min对心肌细胞质膜蛋白SDS-PAGE谱型无明显影响；主动脉阻断期间，心肌细胞质膜蛋白SDS-PAGE谱型也均无明显的异常。恢复灌注后，Ⅱ～Ⅵ组心肌细胞质膜蛋白电泳最突出的变化是低于1.8 万的蛋白条带不同程度减少至消失，但是，2.8万条带并无特征性改变，同时也没有观察到高分子蛋白条带深染的改变。这种差异可能是由于实验的材料与方法不同所致。在本研究中所用的动物是猫，而Parinandi用的是鼠，是否由于动物种属的差异会引起质膜蛋白电泳谱型的不同呢？另外，本研究是体内研究，不同于Parinandi的体外制备正常心肌细胞质膜后施以自由基处理。缺血再灌注损伤的过程是一个极为复杂的过程，以往推测在这个过程中质膜蛋白的减少是由于质膜蛋白发生了聚合。我们认为，坏死组织释放蛋白酶以及缺氧损伤细胞内蛋白酶的激活可能在缺血再灌注损伤质膜蛋白改变中起着重要的作用。因为当1.8万以下的蛋白条带减少的同时，并没有出现典型的高分子量蛋白条带的增多现象。而且，冷冻复型的研究结果从另一个侧面支持这种解释。
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3.3 心肌缺血再灌注损伤对心肌细胞质膜蛋白形态的影响 温血停搏液持续顺灌保护组在缺血及再灌注期间，心肌细胞质膜蛋白均得到了较好的保护，并在复灌120 min(总 CPB 180 min)后单位面积质膜蛋白颗粒数恢复最佳,但仍比正常组差。这可能是本研究仅采用了单一顺行灌注心脏停搏液灌注保护方式，心肌保护不充分。最近的研究表明，无论顺行还是逆行灌注心脏保护液都不能对整个心脏提供充分的保护，即使是温血停搏液保护其心肌，无氧酵解代谢程度依然较高[5,6]。提示采用顺行加逆行灌注方式可能会对整个心脏提供更充分的保护作用。另外，在研究中发现，温血停搏液保护组在主动脉阻断期间，心肌时有蠕动，这在一定程度上削弱了心肌保护效果。
3.4 心肌缺血再灌注损伤对心肌细胞质膜蛋白二级结构的影响 本研究中，心肌细胞质膜蛋白质二级结构的变化与缺血及再灌注损伤之间并无明确的相关性。原因可能是,我们是对质膜总蛋白进行拉曼光谱分析,而不是某种专一蛋白质,所以检测值为质膜总蛋白二级结构的变化趋势。由于不同蛋白质对同一特定的作用因素，其二级结构的变化不尽相同，因此，最终测得的质膜蛋白二级结构也只是各种蛋白质变化后综合的最终结果。另外，为了不影响质膜蛋白的生理状态，在实验中没有用去垢剂将蛋白从质膜脂质中溶出。因此，膜脂也对测定结果存在很大影响。基于这些原因，本研究并未将该结果作为评价心肌保护效果的指标。
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【参考文献】
[1]陈晓东,王志农,张宝仁,等.体外循环中心肌细胞膜蛋白变化的冷冻复型研究[J ].中华实验外科杂志,1998,15(6):563.
[2]Caputo M,Dihmis WC,Bryan AJ,et al.Warm blood hyperkalaemic reperfusion (hot shot) prevent myocardial substrates derangement in patients undergoing coronary artery bypass surgery[J].Eur J Cardiothorac Surg,1998,13(5):559-564.
[3]Bel A,Aznag H,Faris B,et al.Warm blood cardioplegia in high risk patients[J].Eur J Cardiothorac Surg,1997,11(6):1118-1123.
, 百拇医药
[4]Parinandi NL,Zwizinski CW,Schmid HH.Free radical-induced alteration of myocardial membrane proteins[J].Arch Biochem Biophy,1991,289(1):118-123.
[5]Jayawant AM,Stephenson ER Jr,Baumgarten CM,et al.Prevention of cell swelling with low chloride St.Thomas′ Hospital solution improves postischemic myocardial recovery[J].J Thorac Cardiovasc Surg,1998,115(5):1196-1203.
[6]Fiore AC,Swartz MT,Nevett R,et al.Intermittent antegrade tepid versus cold blood cardioplegia in elective myocardial revascularization[J].Ann Thorac Surg,1998,65(6):1559-1564.
【收稿日期】1999-11-04
【修回日期】2000-02-25, 百拇医药