人单核细胞趋化蛋白1基因的克隆及在大肠杆菌中的表达
作者：王汉涛 郭葆玉 屠岳 王元和 张淑英 孟荣贵
单位：
关键词：单核细胞趋化蛋白-1；基因克隆；融合表达
第二军医大学学报000406 【摘要】目的：克隆表达具有重要生物功能的人单核细胞趋化蛋白1(huMCP-1)。方法：从人外周血单核细胞(PBMC)中提取 poly (A)+ RNA，用RT-PCR法扩增出huMCP-1 cDNA。将huMCP-1 cDNA插入融合表达载体pGEXIN，1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后获得高效表达。结果：Western blot证明与huMCP-1单克隆抗体有明显交叉反应。结论：huMCP-1基因的克隆并表达成功为今后的实验室和临床研究提供了有用的材料。
【中图分类号】Q 785; Q 786 【文献标识码】A
, 百拇医药
【文章编号】0258-879X(2000)04-0318-04
Cloning of human monocyte chemoattractant protein-1 and fusion expression in E.coli
WANG Han-Tao,TU Yue,MENG Rong-Gui
(Department of General Surgery,Changhai Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)
GUO Bao-Yu
(Department of Biochemical Medicine,College of Pharmacy)
, 百拇医药
WANG Yuan-He
(Department of General Surgery,Changzheng Hospital)
ZHANG Shu-Ying
(Department of Health Toxicology,Department of Basic Medicine)
【ABSTRACT】Objective:To clone and express human monocyte chemoattractant protein-1 (huMCP-1) with important biologic functions.Methods:Poly (A)+ RNA was extracted from PBMC and huMCP-1 cDNA was obtained by RT-PCR.huMCP-1 cDNA was inserted into fusion expression vector pGEXIN site of BamHⅠ,QD and EcoRⅠ,and gained high expression induced by 1 mmol/L IPTG.Results:Western blotting analysis showed that the product had apparent cross reaction with huMCP-1 monoclonal antibody.Conclusion:Success on cloning and expression of huMCP-1 provide useful material for the laboratory and clinic research of MCP-1.
, http://www.100md.com
【KEY WORDS】monocyte chemoattractant protein-1; gene cloning; fusion expression
人单核细胞趋化蛋白1(human monocyte chemoattractant protein-1，huMCP-1)是一种对单核细胞和T淋巴细胞具有趋化作用[1]，并介入粘附分子和细胞外基质相互作用[2]的趋化因子β-亚家族成员之一。研究证明MCP-1参与动脉粥样硬化、炎症性肠病等多种疾病的病理生理过程[3,4]，在体外可以通过活化培养的单核细胞抑制一些肿瘤细胞的生长，如A-375黑色素瘤细胞、MCF7乳腺癌细胞等。为进一步研究MCP-1的生物功能，我们克隆了huMCP-1 cDNA，将插入融合表达载体pGEXIN，并在大肠杆菌中表达。现报道如下。
1 材料和方法
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1.1 细胞和载体 人外周血单核细胞(PBMC)系由健康成年男性外周血获得，载体pGEXIN及宿主菌TG-1由本室保存。
1.2 酶类及主要生化试剂 RNAzol购自Cinn生物技术公司，Oligotex dT 30 购自JSR公司，反转录盒购自美国PE公司，各种限制性内切酶均购自华美公司，T4 DNA连接酶、IPTG等购自Promega公司，huMCP-1单克隆抗体系英国Pepro Tech公司产品。
1.3 寡核苷酸引物 根据huMCP-1 cDNA的核苷酸序列采用DNAsis软件辅助设计,由上海细胞所赛尔公司合成。上游引物为：5′-GCGGATCCAGCCAGATGCAATCAATGC-3′，5′端加一个BamHⅠ酶切位点。下游引物序列为5′-GCGAATTCTCAAGTCTTCGGAGTTTGGG-3′，在5′端加一个EcoRⅠ酶切位点。
1.4 总RNA及poly (A)+ RNA的提取 健康成年男性外周血经Ficoll Hypaque分层液分层后，收集PBMC，经LPS 10 μg/ml 37℃诱导4 h后,采用RNAzol法提取总RNA，寡聚胸苷乳胶法制备高纯度的poly (A)+ RNA 。
, 百拇医药
1.5 RT-PCR合成huMCP-1 cDNA 将poly (A)+ RNA和随机引物经70℃变性10 min后，加入10×PCR缓冲液、25 mmol/L MgCl2，10 mmol/L dNTPs和0.1 mol/L DTT混合后25℃温育5 min。加入Superscript Ⅱ反转录酶混匀，反应总体积20 μl，25℃ 10 min,42℃ 50 min，72℃ 15 min，加入RNA酶H，37℃ 20 min。PCR扩增用高保真酶Ex Taq，PCR反应按94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s共30个循环，在PE 9600型PCR扩增仪中进行。1%琼脂糖电泳检查特异条带。
1.6 融合表达质粒的构建与鉴定 240 bp大小的PCR产物经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切插入pGEXIN载体中同样的酶切位点，然后转化感受态细菌。筛选出阳性克隆以BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定后，在ABI 377型DNA自动序列分析仪上进行序列分析。
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1.7 huMCP-1基因的表达 pGEXIN/MCP-1阳性克隆接种于 LB/AP+培养液，37℃培养至对数生长期，加终浓度为1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。采用15%浓度分离胶行SDS-PAGE，0.25%考马斯亮蓝R-250染色。
1.8 Western blot分析 表达产物SDS-PAGE电泳后转移硝酸纤维素膜，然后用huMCP-1单抗结合1 h，洗涤后加入二抗，用碱性磷酸酶法显色。
2 结 果
2.1 huMCP-1 cDNA的克隆 以自行设计的引物对人poly (A)+ RNA进行RT-PCR，获得了240 bp大小的单一片段(图1)。将其克隆到pGEXIN，经酶切鉴定(图2)和核苷酸序列分析(图3)证实为huMCP-1 cDNA。
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图 1 RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig 1 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products
Lane 1:PCR marker; Lane 2:RT-PCR products
图 2 质粒MCP-1/pGEXIN的酶切
Fig 2 Enzyme digestion of MCP-1/pGEXIN plasmid
Lane 1:PCR marker; Lane 2:MCP-1/pGEXIN
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图3 huMCP-1 cDNA测序结果
Fig 3 Nucleotide sequence of huMCP-1 cDNA
2.2 pGEXIN/MCP-1重组质粒在大肠杆菌中的表达 1 mmol/L IPTG诱导5 h后的表达产物SDS-PAGE分析，在相对分子质量3.4×104处出现一条浓染的表达蛋白条带(图4)。
图 4 MCP-1的SDS-PAGE分析
Fig 4 SDS-PAGE analysis of MCP-1
Lane 1:Protein marker; Lane 2,3:pGEXIN induced or not;
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Lane 4,5:pGEXIN/MCP-1 induced or not
2.3 Western blot分析 硝酸纤维素膜用碱性磷酸酶法显色可见一清晰条带(图5)，而GST未见任何印迹。
图 5 MCP-1的Western blot分析
Fig 5 Western blotting analysis of MCP-1
Lane 1:GST-MCP-1 fusion protein; Lane 2:GST3 讨 论
趋化因子是一类结构高度同源、功能相近的相对分子质量(0.8～1.8)×104的小分子蛋白。趋化因子都含有保守的半胱氨酸，根据其氨基末端半胱氨酸的数目及位置的不同，分为C-X-C，C-C和C亚家族[5]。MCP-1是C-C亚家族的成员之一。趋化因子的氨基酸和核苷酸序列之间具有高度的同源性，C-X-C亚家族成员之间氨基酸序列同源性为30%～59%，C-C亚家族成员之间为28%～55%，三个亚家族之间则为20%～40%[6]。序列的高度同源性，提示趋化因子超家族可能来自一个共同的祖先。 研究发现，MCP-2和MCP-3经常伴随着MCP-1的产生而产生，三者之间完全相同的氨基酸高达42个[7]，增加了克隆MCP-1 cDNA的难度。为特异性地扩增所需的MCP-1目的片段，我们采用poly(A)+ RNA而不是总RNA作为模板，并将退火温度提高到60℃，经过30个循环，成功地获得了约240 bp的单一扩增产物。将克隆入载体pGEXIN中经酶切鉴定和DNA序列分析，证明所获得的片段即huMCP-1 cDNA。 为获得表达的重组huMCP-1蛋白，我们将huMCP-1基因片段插入融合蛋白表达载体pGEXIN中，经1 mmol/L IPTG诱导后在相对分子质量3.4×104处获得了高表达的融合蛋白，此蛋白的相对分子质量与理论推算的相符。经Western blot分析鉴定具有与huMCP-1单克隆抗体结合的能力，证明表达产物就是MCP-1。
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1991年Rollins等[8]将小鼠MCP-1 cDNA转染入中华仓鼠卵巢(CHO)细胞，表达MCP-1基因的CHO细胞在裸鼠中形成肿瘤的能力丧失，将能表达MCP-1的CHO细胞与不能表达MCP-1的CHO细胞或Hela细胞混合接种裸鼠，能阻止肿瘤的形成。1994年Huang等[9]将MCP-1基因 cDNA转染入不表达内源性MCP-1的高转移性鼠结肠癌细胞CT-26中，并将其接种于同种的BALB/c小鼠皮下，其肿瘤形成能力下降。在BALB/c小鼠和裸鼠的实验性肺转移模型中，CT-26/MCP-1细胞的肺转移能力明显下降。提示MCP-1在恶性肿瘤的治疗方面具有一定的应用前景。我们通过基因工程技术，成功地克隆表达了huMCP-1，为进一步研究其生物学活性及其抗肿瘤作用机制奠定了基础。
【参考文献】
[1]Carr MW,Roth SJ,Luther E,et al.Monocyte chemoattractant protein-1 acts as a T-lymphocyte chemoattractant[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994,91(9):3652-3656.
, http://www.100md.com
[2]Vaddi K,Newton RC.Regulation of monocyte integrin expression by beta-family chemokines[J].J Immunol,1994,153(10):4721-4732.
[3]Wang GP,Deng ZD,Ni J,et al.Oxidized low density lipoprotein and very low density lipoprotein enhance expression of monocyte chemoattractant protein-1 in rabbit peritoneal exudate macrophages[J].Atherosclerosis,1997,133(1):31-36.
[4]Reinecker HC,Loh EY,Ringler DJ,et al.Monocyte chemoattractant protein-1 gene expression in intestinal epithe -lial cells and inflammatory bowel disease mucosa[J].Gastroenterology,1995,108(1):40-50.
, 百拇医药
[5]Furie MB,Randolph GJ.Chemokines and tissue injury[J].Am J Pathol,1995,146(6):1287-1301.
[6]Strieter RM,Koch AE,Antony VB,et al.The immunopathology of chemotactic cytokines:the role of interleukin-8 and monocyte chemoattractant protein-1[J].J Lab Clin Med,1994,123(2):183-197.
[7]Taub DD,Proost P,Murphy WJ,et al.Monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1),-2 and -3 are chemotactic for human T lymphocytes[J].J Clin Invest,1995,95(3):1370-1376.
, 百拇医药
[8]Rollins BJ,Sunday ME.Suppression of tumor formation in vivo by expression of the JE gene in malignant cells[J].Mol Cell Biol,1991，11(6):3125-3131.
[9]Huang S,Singh RK,Xie K,et al.Expression of the JE/MCP-1 gene suppresses metastatic potential in murine colon carcinoma cells[J].Cancer Immunol Immunother,1994,39(4):231-238.
【收稿日期】1999-11-19
【修回日期】2000-02-21, 百拇医药
单位：
关键词：单核细胞趋化蛋白-1；基因克隆；融合表达
第二军医大学学报000406 【摘要】目的：克隆表达具有重要生物功能的人单核细胞趋化蛋白1(huMCP-1)。方法：从人外周血单核细胞(PBMC)中提取 poly (A)+ RNA，用RT-PCR法扩增出huMCP-1 cDNA。将huMCP-1 cDNA插入融合表达载体pGEXIN，1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后获得高效表达。结果：Western blot证明与huMCP-1单克隆抗体有明显交叉反应。结论：huMCP-1基因的克隆并表达成功为今后的实验室和临床研究提供了有用的材料。
【中图分类号】Q 785; Q 786 【文献标识码】A
, 百拇医药
【文章编号】0258-879X(2000)04-0318-04
Cloning of human monocyte chemoattractant protein-1 and fusion expression in E.coli
WANG Han-Tao,TU Yue,MENG Rong-Gui
(Department of General Surgery,Changhai Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)
GUO Bao-Yu
(Department of Biochemical Medicine,College of Pharmacy)
, 百拇医药
WANG Yuan-He
(Department of General Surgery,Changzheng Hospital)
ZHANG Shu-Ying
(Department of Health Toxicology,Department of Basic Medicine)
【ABSTRACT】Objective:To clone and express human monocyte chemoattractant protein-1 (huMCP-1) with important biologic functions.Methods:Poly (A)+ RNA was extracted from PBMC and huMCP-1 cDNA was obtained by RT-PCR.huMCP-1 cDNA was inserted into fusion expression vector pGEXIN site of BamHⅠ,QD and EcoRⅠ,and gained high expression induced by 1 mmol/L IPTG.Results:Western blotting analysis showed that the product had apparent cross reaction with huMCP-1 monoclonal antibody.Conclusion:Success on cloning and expression of huMCP-1 provide useful material for the laboratory and clinic research of MCP-1.
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【KEY WORDS】monocyte chemoattractant protein-1; gene cloning; fusion expression
人单核细胞趋化蛋白1(human monocyte chemoattractant protein-1，huMCP-1)是一种对单核细胞和T淋巴细胞具有趋化作用[1]，并介入粘附分子和细胞外基质相互作用[2]的趋化因子β-亚家族成员之一。研究证明MCP-1参与动脉粥样硬化、炎症性肠病等多种疾病的病理生理过程[3,4]，在体外可以通过活化培养的单核细胞抑制一些肿瘤细胞的生长，如A-375黑色素瘤细胞、MCF7乳腺癌细胞等。为进一步研究MCP-1的生物功能，我们克隆了huMCP-1 cDNA，将插入融合表达载体pGEXIN，并在大肠杆菌中表达。现报道如下。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 细胞和载体 人外周血单核细胞(PBMC)系由健康成年男性外周血获得，载体pGEXIN及宿主菌TG-1由本室保存。
1.2 酶类及主要生化试剂 RNAzol购自Cinn生物技术公司，Oligotex dT 30 购自JSR公司，反转录盒购自美国PE公司，各种限制性内切酶均购自华美公司，T4 DNA连接酶、IPTG等购自Promega公司，huMCP-1单克隆抗体系英国Pepro Tech公司产品。
1.3 寡核苷酸引物 根据huMCP-1 cDNA的核苷酸序列采用DNAsis软件辅助设计,由上海细胞所赛尔公司合成。上游引物为：5′-GCGGATCCAGCCAGATGCAATCAATGC-3′，5′端加一个BamHⅠ酶切位点。下游引物序列为5′-GCGAATTCTCAAGTCTTCGGAGTTTGGG-3′，在5′端加一个EcoRⅠ酶切位点。
1.4 总RNA及poly (A)+ RNA的提取 健康成年男性外周血经Ficoll Hypaque分层液分层后，收集PBMC，经LPS 10 μg/ml 37℃诱导4 h后,采用RNAzol法提取总RNA，寡聚胸苷乳胶法制备高纯度的poly (A)+ RNA 。
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1.5 RT-PCR合成huMCP-1 cDNA 将poly (A)+ RNA和随机引物经70℃变性10 min后，加入10×PCR缓冲液、25 mmol/L MgCl2，10 mmol/L dNTPs和0.1 mol/L DTT混合后25℃温育5 min。加入Superscript Ⅱ反转录酶混匀，反应总体积20 μl，25℃ 10 min,42℃ 50 min，72℃ 15 min，加入RNA酶H，37℃ 20 min。PCR扩增用高保真酶Ex Taq，PCR反应按94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s共30个循环，在PE 9600型PCR扩增仪中进行。1%琼脂糖电泳检查特异条带。
1.6 融合表达质粒的构建与鉴定 240 bp大小的PCR产物经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切插入pGEXIN载体中同样的酶切位点，然后转化感受态细菌。筛选出阳性克隆以BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定后，在ABI 377型DNA自动序列分析仪上进行序列分析。
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1.7 huMCP-1基因的表达 pGEXIN/MCP-1阳性克隆接种于 LB/AP+培养液，37℃培养至对数生长期，加终浓度为1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。采用15%浓度分离胶行SDS-PAGE，0.25%考马斯亮蓝R-250染色。
1.8 Western blot分析 表达产物SDS-PAGE电泳后转移硝酸纤维素膜，然后用huMCP-1单抗结合1 h，洗涤后加入二抗，用碱性磷酸酶法显色。
2 结 果
2.1 huMCP-1 cDNA的克隆 以自行设计的引物对人poly (A)+ RNA进行RT-PCR，获得了240 bp大小的单一片段(图1)。将其克隆到pGEXIN，经酶切鉴定(图2)和核苷酸序列分析(图3)证实为huMCP-1 cDNA。
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图 1 RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig 1 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products
Lane 1:PCR marker; Lane 2:RT-PCR products
图 2 质粒MCP-1/pGEXIN的酶切
Fig 2 Enzyme digestion of MCP-1/pGEXIN plasmid
Lane 1:PCR marker; Lane 2:MCP-1/pGEXIN
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图3 huMCP-1 cDNA测序结果
Fig 3 Nucleotide sequence of huMCP-1 cDNA
2.2 pGEXIN/MCP-1重组质粒在大肠杆菌中的表达 1 mmol/L IPTG诱导5 h后的表达产物SDS-PAGE分析，在相对分子质量3.4×104处出现一条浓染的表达蛋白条带(图4)。
图 4 MCP-1的SDS-PAGE分析
Fig 4 SDS-PAGE analysis of MCP-1
Lane 1:Protein marker; Lane 2,3:pGEXIN induced or not;
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Lane 4,5:pGEXIN/MCP-1 induced or not
2.3 Western blot分析 硝酸纤维素膜用碱性磷酸酶法显色可见一清晰条带(图5)，而GST未见任何印迹。
图 5 MCP-1的Western blot分析
Fig 5 Western blotting analysis of MCP-1
Lane 1:GST-MCP-1 fusion protein; Lane 2:GST3 讨 论
趋化因子是一类结构高度同源、功能相近的相对分子质量(0.8～1.8)×104的小分子蛋白。趋化因子都含有保守的半胱氨酸，根据其氨基末端半胱氨酸的数目及位置的不同，分为C-X-C，C-C和C亚家族[5]。MCP-1是C-C亚家族的成员之一。趋化因子的氨基酸和核苷酸序列之间具有高度的同源性，C-X-C亚家族成员之间氨基酸序列同源性为30%～59%，C-C亚家族成员之间为28%～55%，三个亚家族之间则为20%～40%[6]。序列的高度同源性，提示趋化因子超家族可能来自一个共同的祖先。 研究发现，MCP-2和MCP-3经常伴随着MCP-1的产生而产生，三者之间完全相同的氨基酸高达42个[7]，增加了克隆MCP-1 cDNA的难度。为特异性地扩增所需的MCP-1目的片段，我们采用poly(A)+ RNA而不是总RNA作为模板，并将退火温度提高到60℃，经过30个循环，成功地获得了约240 bp的单一扩增产物。将克隆入载体pGEXIN中经酶切鉴定和DNA序列分析，证明所获得的片段即huMCP-1 cDNA。 为获得表达的重组huMCP-1蛋白，我们将huMCP-1基因片段插入融合蛋白表达载体pGEXIN中，经1 mmol/L IPTG诱导后在相对分子质量3.4×104处获得了高表达的融合蛋白，此蛋白的相对分子质量与理论推算的相符。经Western blot分析鉴定具有与huMCP-1单克隆抗体结合的能力，证明表达产物就是MCP-1。
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1991年Rollins等[8]将小鼠MCP-1 cDNA转染入中华仓鼠卵巢(CHO)细胞，表达MCP-1基因的CHO细胞在裸鼠中形成肿瘤的能力丧失，将能表达MCP-1的CHO细胞与不能表达MCP-1的CHO细胞或Hela细胞混合接种裸鼠，能阻止肿瘤的形成。1994年Huang等[9]将MCP-1基因 cDNA转染入不表达内源性MCP-1的高转移性鼠结肠癌细胞CT-26中，并将其接种于同种的BALB/c小鼠皮下，其肿瘤形成能力下降。在BALB/c小鼠和裸鼠的实验性肺转移模型中，CT-26/MCP-1细胞的肺转移能力明显下降。提示MCP-1在恶性肿瘤的治疗方面具有一定的应用前景。我们通过基因工程技术，成功地克隆表达了huMCP-1，为进一步研究其生物学活性及其抗肿瘤作用机制奠定了基础。
【参考文献】
[1]Carr MW,Roth SJ,Luther E,et al.Monocyte chemoattractant protein-1 acts as a T-lymphocyte chemoattractant[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994,91(9):3652-3656.
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[2]Vaddi K,Newton RC.Regulation of monocyte integrin expression by beta-family chemokines[J].J Immunol,1994,153(10):4721-4732.
[3]Wang GP,Deng ZD,Ni J,et al.Oxidized low density lipoprotein and very low density lipoprotein enhance expression of monocyte chemoattractant protein-1 in rabbit peritoneal exudate macrophages[J].Atherosclerosis,1997,133(1):31-36.
[4]Reinecker HC,Loh EY,Ringler DJ,et al.Monocyte chemoattractant protein-1 gene expression in intestinal epithe -lial cells and inflammatory bowel disease mucosa[J].Gastroenterology,1995,108(1):40-50.
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[5]Furie MB,Randolph GJ.Chemokines and tissue injury[J].Am J Pathol,1995,146(6):1287-1301.
[6]Strieter RM,Koch AE,Antony VB,et al.The immunopathology of chemotactic cytokines:the role of interleukin-8 and monocyte chemoattractant protein-1[J].J Lab Clin Med,1994,123(2):183-197.
[7]Taub DD,Proost P,Murphy WJ,et al.Monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1),-2 and -3 are chemotactic for human T lymphocytes[J].J Clin Invest,1995,95(3):1370-1376.
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[8]Rollins BJ,Sunday ME.Suppression of tumor formation in vivo by expression of the JE gene in malignant cells[J].Mol Cell Biol,1991，11(6):3125-3131.
[9]Huang S,Singh RK,Xie K,et al.Expression of the JE/MCP-1 gene suppresses metastatic potential in murine colon carcinoma cells[J].Cancer Immunol Immunother,1994,39(4):231-238.
【收稿日期】1999-11-19
【修回日期】2000-02-21, 百拇医药