丁型肝炎病毒基因组核酶的反式剪切活性
作者：于乐成 顾长海 毛青 李奇芬 王宇明
单位：于乐成(第三军医大学附属西 南医院感染病科、全军传染病专科中心，重庆 400038)；顾长海(第三军医大学附属西 南医院感染病科、全军传染病专科中心，重庆 400038)；毛青(第三军医大学附属西 南医院感染病科、全军传染病专科中心，重庆 400038)；李奇芬(第三军医大学附属西 南医院感染病科、全军传染病专科中心，重庆 400038)；王宇明(第三军医大学附属西 南医院感染病科、全军传染病专科中心，重庆 400038)
关键词：丁型肝炎病毒核酶；反式剪切；基因组；体外转录
第三军医大学学报000401 提 要： 目的 观察丁型肝炎病毒2种 基因组核酶(HDV genomic ribozyme,g.Rz)是否存在反式剪切活性。方法 合成g.Rz74和g.R z55的cDNA，克隆入质粒pGEM-4Z，体外转录获取核酶RNA；同时从质粒pRz277B上转录出同 源性底物RNA，以α-32p-UTP标志；再将核酶与底物按比例混合，在一定条件下观察是否 出现剪切作用。结果 启动反应30 min后，可以观察到剪切产物，9 0 min后剪切反应更加明显。结论 g.Rz74和g.Rz55均具有反式 剪切活性。
, 百拇医药
中图法分类号：R373.21;R394.2 文献标识码：A
文章编号：1000-5404(2000)04-0305-02
Study of the trans-cleaving activity of hepatitis delta virus genomic ribozyme
YU Yue-cheng, GU Cheng-hai, MAO Qing, LI Qi-fen, WANG Yu-ming
(Clinical Center of Infectious Disease, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038,China)
Abstract：Objective To study the trans-cleaving activity of 2 genomic ribozymes (g.Rz) of hepatitis delta virus (HDV). M ethods The cDNA of g.Rz 74 and g.Rz 55 was synthesized and cloned into plasmid pGEM-4Z and g.Rz RNA was obtained through transcription in vit ro. Meanwhile, homogenous substrate RNA was transcribed from plasmid pRz277B and lab elled with α-32p-UTP. The ribozymes were mixed with the substrate in appropri ate proportion under certain conditions to observe whether there existed any tra ns-cleaving activity. Results The products of trans-cleavag e were obtained 30 minutes after the initiation of the reaction and the reaction was further intensified 90 minutes later. Conclusion Both g.Rz 74 AND g.Rz 55 possess trans-cleaving activity.
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Key wrods： HDV ribozyme; trans-cleavage; genome; transcrip tion in vitro▲
丁型肝炎病毒基因组RNA能于U688-G689之间自我催化剪切(Self-cleavage)，具有酶 性RNA即核酶活性，这是一种分子内剪切现象(Intramolecular cleavage)，又称顺式剪切 (Cis-cleavage)。体外研究显示，较短但具有较高自剪切活性的基因组核酶(Genomic ribo zyme, g.Rz)是g.Rz1/84(1和84分别为切点5'和3'端碱基数)，呈假结样二级结构[1] 。国外报道g.Rz也可对长8～13核苷酸(nt)的同源性底物进行分子间剪切(Inter-molecul ar cleavage)，又称反式剪切(Trans-cleavage)[2，3]。本研究旨在探讨g.Rz是 否能反式剪切更长的同源性底物RNA，并观察删除茎IV区部分序列后对其活性的影响。
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1 材料和方法
1.1 主要试剂
BamHⅠ、HindⅢ、pstⅠ、Sau96Ⅰ、质粒提取纯化盒购自Boehringe r Mannheim公司；T7转录盒购自Promega公司；T4连接酶为MBI产品；α-32p-UTP、X光片 分别为北京亚辉公司和Kodak公司产品。核酶cDNA由上海Sangon公司合成。
1.2 质粒
g.Rz74相当于g.Rz1/84之第11～84 nt序列，去除其茎Ⅳ区19nt(相当于g.Rz1/84之第4 8～56、60～69nt)，即得g.Rz55。将两者的cDNA克隆至pGEM-4Z的BamHⅠ 与HindⅢ 位点间，以获取重组质粒pGRz74、pGRz55。pRz277B由我室与军事医学科学院放射医学研究 所共同构建，含277 bp长的重庆地区丁型肝炎病毒核酶区cDNA[4]。
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1.3 体外转录
pGRz74、pGRz55经BamHⅠ线性化，用T7噬菌体RNA聚合酶转录获得核 酶RNA。pRz2 77B用Sau96Ⅰ线性化，以α-32p-UTP标志，转录获取同源性底物RN A，纯化后测含量。操作按试剂盒说明书进行。
1.4 剪切反应
将核酶与底物按量浓度100∶1混合，反应体系15 μl, 在Tris.HCl 50 mmol/L(pH 7.5 )条件下，依次经95℃ 3 min、冰浴10 min、37℃水浴10 min，再加入MgCl2至20 mmol/L ，37℃水浴，于5、30、90 min各取出5 μl终止反应，最后12%变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳(含7 mol/L尿素)和放射自显影。
2 结果
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2.1 质粒构建
质粒pGRz74、pGRz55中BamHⅠ、HindⅢ位点重建， pstⅠ位点被切去，故 能被BamHⅠ、Hind Ⅲ切开，而不能被pstⅠ切开，提示重组质粒构建成功；送上海基康生物公司测序证实插入序列正确。
2.2 核酶对底物的反式剪切作用
底物RNA长87 nt，其5'端53 nt系载体序列，3'端24 nt为HDV基因组RNA第665～698 nt ，其中U688-G689为预计剪切位点，相当于g.Rz1/84的自剪切位点。理论上底物应能被g.Rz 74或g.Rz55切成77 nt和10 nt 2个片段，实际结果与此相符，其中10 nt因较短，电泳出胶 ；30 min时可以观察到剪切产物，90 min时剪切效果更明显，见图1。
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图1 核酶g.Rz74和g.Rz55对同源性底物的反式剪切
A1：不加核酶底物RNA；A2：不加核酶底物RNA在反应体系中；B1～B3：g.Rz74在5、30、90 min时点的剪切效果；C1～C3：g.Rz55在5、30、90 min时点的剪切效果
Fig 1 g.Rz74 and g.Rz55 trans-cleave their homogenous substrate
Lane A1: Substrate (without ribozyme);Lane A2: Substrate in the reaction system without ribozyme; Lane B1～B3: Trans-cleaving activity of g.Rz74 at 5、30 and 9 0 min points respectively; Lane C1～C3: Trans-cleaving activity of g.Rz55 at 5、30 and 90 min points respectively
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3 讨论
研究表明，自剪切HDV核酶g.Rz1/84的假结样结构包括4个双链区(茎Ⅰ～Ⅳ)、2个环状 区(L3、L4)和3个连接区(J1/4、J2/4、J1/2)，其中茎Ⅲ、L3、J 1/4、J2/4区可能共 同构成活性中心，而茎Ⅱ、茎IV主要起稳定核酶结构的作用；茎I区的G.U摆动配对(Wobble pair)对核酶活性至关重要，不可更替，其余6 bp的序列可以变动但必须保持Wastson-Cri ck配对。1996年Kawakami等[2]将具有自剪切活性的g.Rz分割为茎I区3'侧和5'侧2 个部分，在适宜Mg2+浓度及pH等条件下将两者重先混合后可出现“核酶”(即茎Ⅰ区 3'侧序列)对“底物”( 茎Ⅰ区5'侧序列，长13 nt)的反式剪切；1997年Fauzi等[3]进一步将此核酶的茎Ⅳ区减至5 bp，发现也能反式剪切长13 nt的同源性底物。我们的 研究表明：①g.Rz可以反式剪切更长的同源性底物RNA；②茎Ⅳ区去除了19 nt，只保留根部 4 bp的g.Rz55也具有反式剪切活性。
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另一方面，由于g.Rz底物结合区(茎Ⅰ区)的6个Wastson-Crick碱基配对序列可以有 一定程度的变动，故通过改变此区序列以与不同的底物结合、在不同的位点剪切底物就成为 可能。而且，丁型肝炎病毒核酶是目前发现的唯一可于自然状态下存在于哺乳动物细胞内的 核酶，其在哺乳动物细胞内的定位及活性发挥可能优于锤头状或发夹状核酶，因此，它有可 能发展成为一种新型有效的核酸工具酶，以用来剪切其他肝炎病毒RNA等异源性RNA分子 [5，6]。由于g.Rz55长度较短，可作为下一步研究工作的基础。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600 031)
作者简介：于乐成(1970-)，男，江苏省姜堰市人，硕士，主 治医师，主要从事病毒性肝炎发病机制及基因治疗方面的研究，发表论文10余篇。电话：(0 23)68754000-73116
参考文献：
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[1] Been M D, Wickham G S. Self-cleaving ribozymes of hepatiti s delta virus RNA[J]. Eur J Biochem,1997,247(3):741-753.
[2] Kawakami J, Yuda K, Suh A, et al. Constructing an efficie nt trans-acting genomic HDV ribozyme[J].FEBS Lett,1996,394(2):132-136.
[3] Fauzi H, Kawakami J, Nishikawa F, et al.Analysis of the clea -vage reaction of a trans-acting human hepatitis delta virus ribozyme[J ].Nuclei A cids Res,1997,25( 15):3 124-3 130.
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[4] 毛 青，王升启，李奇芬，等.重庆地区丁型肝炎病毒基因组中核酶活性区的 克隆及系列分析[J].中华微生物和免疫学杂志,1995，15 (4)：247-250.
[5] Roy G, Anavoranich S, Pereault J P. Delta ribozyme has the ability to cleave in trans an mRNA[J].Nulei Acids Res, 1999,27(4):924-948.
[6] 于乐成，顾长海，李奇芬.核酶抗肝炎病毒研究现状[J].中华肝脏病杂志， 1999，7(增刊)：66-67.
收稿日期：1999-10-18；修回日期：1999-12-22, 百拇医药
单位：于乐成(第三军医大学附属西 南医院感染病科、全军传染病专科中心，重庆 400038)；顾长海(第三军医大学附属西 南医院感染病科、全军传染病专科中心，重庆 400038)；毛青(第三军医大学附属西 南医院感染病科、全军传染病专科中心，重庆 400038)；李奇芬(第三军医大学附属西 南医院感染病科、全军传染病专科中心，重庆 400038)；王宇明(第三军医大学附属西 南医院感染病科、全军传染病专科中心，重庆 400038)
关键词：丁型肝炎病毒核酶；反式剪切；基因组；体外转录
第三军医大学学报000401 提 要： 目的 观察丁型肝炎病毒2种 基因组核酶(HDV genomic ribozyme,g.Rz)是否存在反式剪切活性。方法 合成g.Rz74和g.R z55的cDNA，克隆入质粒pGEM-4Z，体外转录获取核酶RNA；同时从质粒pRz277B上转录出同 源性底物RNA，以α-32p-UTP标志；再将核酶与底物按比例混合，在一定条件下观察是否 出现剪切作用。结果 启动反应30 min后，可以观察到剪切产物，9 0 min后剪切反应更加明显。结论 g.Rz74和g.Rz55均具有反式 剪切活性。
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中图法分类号：R373.21;R394.2 文献标识码：A
文章编号：1000-5404(2000)04-0305-02
Study of the trans-cleaving activity of hepatitis delta virus genomic ribozyme
YU Yue-cheng, GU Cheng-hai, MAO Qing, LI Qi-fen, WANG Yu-ming
(Clinical Center of Infectious Disease, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038,China)
Abstract：Objective To study the trans-cleaving activity of 2 genomic ribozymes (g.Rz) of hepatitis delta virus (HDV). M ethods The cDNA of g.Rz 74 and g.Rz 55 was synthesized and cloned into plasmid pGEM-4Z and g.Rz RNA was obtained through transcription in vit ro. Meanwhile, homogenous substrate RNA was transcribed from plasmid pRz277B and lab elled with α-32p-UTP. The ribozymes were mixed with the substrate in appropri ate proportion under certain conditions to observe whether there existed any tra ns-cleaving activity. Results The products of trans-cleavag e were obtained 30 minutes after the initiation of the reaction and the reaction was further intensified 90 minutes later. Conclusion Both g.Rz 74 AND g.Rz 55 possess trans-cleaving activity.
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Key wrods： HDV ribozyme; trans-cleavage; genome; transcrip tion in vitro▲
丁型肝炎病毒基因组RNA能于U688-G689之间自我催化剪切(Self-cleavage)，具有酶 性RNA即核酶活性，这是一种分子内剪切现象(Intramolecular cleavage)，又称顺式剪切 (Cis-cleavage)。体外研究显示，较短但具有较高自剪切活性的基因组核酶(Genomic ribo zyme, g.Rz)是g.Rz1/84(1和84分别为切点5'和3'端碱基数)，呈假结样二级结构[1] 。国外报道g.Rz也可对长8～13核苷酸(nt)的同源性底物进行分子间剪切(Inter-molecul ar cleavage)，又称反式剪切(Trans-cleavage)[2，3]。本研究旨在探讨g.Rz是 否能反式剪切更长的同源性底物RNA，并观察删除茎IV区部分序列后对其活性的影响。
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1 材料和方法
1.1 主要试剂
BamHⅠ、HindⅢ、pstⅠ、Sau96Ⅰ、质粒提取纯化盒购自Boehringe r Mannheim公司；T7转录盒购自Promega公司；T4连接酶为MBI产品；α-32p-UTP、X光片 分别为北京亚辉公司和Kodak公司产品。核酶cDNA由上海Sangon公司合成。
1.2 质粒
g.Rz74相当于g.Rz1/84之第11～84 nt序列，去除其茎Ⅳ区19nt(相当于g.Rz1/84之第4 8～56、60～69nt)，即得g.Rz55。将两者的cDNA克隆至pGEM-4Z的BamHⅠ 与HindⅢ 位点间，以获取重组质粒pGRz74、pGRz55。pRz277B由我室与军事医学科学院放射医学研究 所共同构建，含277 bp长的重庆地区丁型肝炎病毒核酶区cDNA[4]。
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1.3 体外转录
pGRz74、pGRz55经BamHⅠ线性化，用T7噬菌体RNA聚合酶转录获得核 酶RNA。pRz2 77B用Sau96Ⅰ线性化，以α-32p-UTP标志，转录获取同源性底物RN A，纯化后测含量。操作按试剂盒说明书进行。
1.4 剪切反应
将核酶与底物按量浓度100∶1混合，反应体系15 μl, 在Tris.HCl 50 mmol/L(pH 7.5 )条件下，依次经95℃ 3 min、冰浴10 min、37℃水浴10 min，再加入MgCl2至20 mmol/L ，37℃水浴，于5、30、90 min各取出5 μl终止反应，最后12%变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳(含7 mol/L尿素)和放射自显影。
2 结果
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2.1 质粒构建
质粒pGRz74、pGRz55中BamHⅠ、HindⅢ位点重建， pstⅠ位点被切去，故 能被BamHⅠ、Hind Ⅲ切开，而不能被pstⅠ切开，提示重组质粒构建成功；送上海基康生物公司测序证实插入序列正确。
2.2 核酶对底物的反式剪切作用
底物RNA长87 nt，其5'端53 nt系载体序列，3'端24 nt为HDV基因组RNA第665～698 nt ，其中U688-G689为预计剪切位点，相当于g.Rz1/84的自剪切位点。理论上底物应能被g.Rz 74或g.Rz55切成77 nt和10 nt 2个片段，实际结果与此相符，其中10 nt因较短，电泳出胶 ；30 min时可以观察到剪切产物，90 min时剪切效果更明显，见图1。
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图1 核酶g.Rz74和g.Rz55对同源性底物的反式剪切
A1：不加核酶底物RNA；A2：不加核酶底物RNA在反应体系中；B1～B3：g.Rz74在5、30、90 min时点的剪切效果；C1～C3：g.Rz55在5、30、90 min时点的剪切效果
Fig 1 g.Rz74 and g.Rz55 trans-cleave their homogenous substrate
Lane A1: Substrate (without ribozyme);Lane A2: Substrate in the reaction system without ribozyme; Lane B1～B3: Trans-cleaving activity of g.Rz74 at 5、30 and 9 0 min points respectively; Lane C1～C3: Trans-cleaving activity of g.Rz55 at 5、30 and 90 min points respectively
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3 讨论
研究表明，自剪切HDV核酶g.Rz1/84的假结样结构包括4个双链区(茎Ⅰ～Ⅳ)、2个环状 区(L3、L4)和3个连接区(J1/4、J2/4、J1/2)，其中茎Ⅲ、L3、J 1/4、J2/4区可能共 同构成活性中心，而茎Ⅱ、茎IV主要起稳定核酶结构的作用；茎I区的G.U摆动配对(Wobble pair)对核酶活性至关重要，不可更替，其余6 bp的序列可以变动但必须保持Wastson-Cri ck配对。1996年Kawakami等[2]将具有自剪切活性的g.Rz分割为茎I区3'侧和5'侧2 个部分，在适宜Mg2+浓度及pH等条件下将两者重先混合后可出现“核酶”(即茎Ⅰ区 3'侧序列)对“底物”( 茎Ⅰ区5'侧序列，长13 nt)的反式剪切；1997年Fauzi等[3]进一步将此核酶的茎Ⅳ区减至5 bp，发现也能反式剪切长13 nt的同源性底物。我们的 研究表明：①g.Rz可以反式剪切更长的同源性底物RNA；②茎Ⅳ区去除了19 nt，只保留根部 4 bp的g.Rz55也具有反式剪切活性。
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另一方面，由于g.Rz底物结合区(茎Ⅰ区)的6个Wastson-Crick碱基配对序列可以有 一定程度的变动，故通过改变此区序列以与不同的底物结合、在不同的位点剪切底物就成为 可能。而且，丁型肝炎病毒核酶是目前发现的唯一可于自然状态下存在于哺乳动物细胞内的 核酶，其在哺乳动物细胞内的定位及活性发挥可能优于锤头状或发夹状核酶，因此，它有可 能发展成为一种新型有效的核酸工具酶，以用来剪切其他肝炎病毒RNA等异源性RNA分子 [5，6]。由于g.Rz55长度较短，可作为下一步研究工作的基础。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600 031)
作者简介：于乐成(1970-)，男，江苏省姜堰市人，硕士，主 治医师，主要从事病毒性肝炎发病机制及基因治疗方面的研究，发表论文10余篇。电话：(0 23)68754000-73116
参考文献：
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[1] Been M D, Wickham G S. Self-cleaving ribozymes of hepatiti s delta virus RNA[J]. Eur J Biochem,1997,247(3):741-753.
[2] Kawakami J, Yuda K, Suh A, et al. Constructing an efficie nt trans-acting genomic HDV ribozyme[J].FEBS Lett,1996,394(2):132-136.
[3] Fauzi H, Kawakami J, Nishikawa F, et al.Analysis of the clea -vage reaction of a trans-acting human hepatitis delta virus ribozyme[J ].Nuclei A cids Res,1997,25( 15):3 124-3 130.
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[4] 毛 青，王升启，李奇芬，等.重庆地区丁型肝炎病毒基因组中核酶活性区的 克隆及系列分析[J].中华微生物和免疫学杂志,1995，15 (4)：247-250.
[5] Roy G, Anavoranich S, Pereault J P. Delta ribozyme has the ability to cleave in trans an mRNA[J].Nulei Acids Res, 1999,27(4):924-948.
[6] 于乐成，顾长海，李奇芬.核酶抗肝炎病毒研究现状[J].中华肝脏病杂志， 1999，7(增刊)：66-67.
收稿日期：1999-10-18；修回日期：1999-12-22, 百拇医药