正常人脑Glob-N的分离及其结构的初步分析
作者：张宗城 张积仁 张健 林永成 汪森明
单位：张宗城(第一军医大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州510282)；张积仁(第一军医大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州510282)；张健(第一军医大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州510282)；林永成(中山大学化学系天然有机研究室，广东 广州510275)；汪森明(第一军医大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州510282)
关键词：中性鞘糖脂；柱层析；分离；纯化；结构分析
第一军医大学学报000431 摘要：目的 探索一种新的脑胶质瘤生长抑制因子Glob-N的分离鉴定方法。方法 人脑中性鞘糖脂经过加压柱层析，梯度甲醇/氯仿溶液洗脱。对所得到的产物行1H-NMR和13C-NMR测定。结果 含甲醇60%的甲醇/氯仿溶液的洗脱物为纯化Glob-N，层析展开后呈单一清晰条带，Rf值0.45。初步结构分析表明人脑Glob-N含N-乙酰半乳糖，共3个糖基，其神经酰胺部分共有33个碳原子。结论 柱层析分离中性鞘糖脂单一组分效果好，纯度高；人脑Glob结构中含3个糖基。
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中图分类号：Q538; Q71 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)04-0382-03
Isolation and preliminary structural characterization of Glob-N from normal human brain
ZHANG Zong-cheng, ZHANG Ji-ren, ZHANG Jian, WANG Sen-ming
(Center of Oncology, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, China)
LIN Yong-cheng
, 百拇医药
(Department of Chemistry, Zhongshan University, Guangzhou 510275, China)Abstract: Objective To develop a new method for isolating and identifying a glioma growth factor inhibitor, Glob-N, from normal human brain. Methods Neutral glycosylsphingolipid was separated from normal human brain by column chromatography with methanol/chloroform solution for gradient elution, and the resultant underwent 1H-NMR and 13C-NMR analyses for identifying the structure of Glob-N. Results Glob-N was obtained by elution with 60% (V/V) methanol in methanol/chloroform solution, with the Rf value of 0.45. The structural analysis showed that Glob-N from human brain was a globotriaosylceramide, containing GalNAc with 33 carbon atom in its ceramide moiety. Conclusion Individual N-GSL can be well separated from total N-GSL by column chromatography with high output. Glob-N from human brain maybe a kind of globotriaosylceramide.
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Key words: neutral glycosphingolipid; column chromatography; purification; separation; structural characterization
脑胶质瘤是最常见的一种原发性颅内肿瘤，治疗效果不理想，患者的平均生存期仅为9～ 12个月。我们研究发现[1]，脑胶质瘤的发生与Globoside(命名为Glob-N)缺失有关。为了深入研究Glob-N在细胞生长、分化及恶性增殖中的调控作用，本实验采用一种新的分离方法对正常人脑Glob-N进行了分离纯化，并对其分子结构进行了初步分析。
1 材料与方法
1.1 材料
人脑组织1例(取自因意外事故死亡之尸体，死亡2 h后取标本)，健康人O型新鲜血液200 ml (购自广州市中心血站)，DEAE-Sephadex A25 (Pharmacia公司)，Florisil硅胶、Glob的标准品(Sigma公司)，硅胶G(德国E.Merck公司)，高效薄层层析板(德国E.Merck公司)，核磁共振仪(Inova500 MHz，美国Varian公司)。
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1.2 方法
1.2.1红细胞膜的纯化 取人脑额叶、颞叶、顶叶、小脑、桥脑组织各2 g，顶叶脑灰质、白质各2 g和各部位混合人脑组织200 g，以PBS液清洗，去除血污，吹干后用匀浆器匀浆，置–20 ℃冰箱中备用。健康人O型血200 ml，置于等量淋巴细胞分离液中4℃静止1 h，取下层富含红细胞部分用0.01 mol/L(pH7.2)的PBS液洗2次。低速离心10 min，沉淀置于密度1.090 的Ficoll-Pague 液体中，2 000 g离心10 min，下层细胞成分即为纯化红细胞。PBS液洗2次，加入一定量蒸馏水使之充分破膜。然后在低温超速离心机中20 000 g离心1 h，所得沉淀即为纯化的红细胞膜，–20 ℃冷冻备用。
1.2.2中性鞘糖脂的提取 按改良Hakomori的方法[2]进行。
1.2.2.1总脂的提取 匀浆后的人脑及红细胞膜分别以2:1、1:2、1:1的氯仿/甲醇(V/V)溶液提取总脂，氯仿/甲醇溶液总体积为组织的20倍，所得提取液在4 ℃下过夜。滤纸过滤、收集并合并3次滤液，(39±3)℃下减压蒸馏，所得淡黄色油状物即为总脂，以1:1氯仿/甲醇溶液(V/V)溶解，–20℃保存备用。
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1.2.2.2 DEAE-Sephadex-A25柱层析粗提中性鞘糖脂 称取2.2 g DEAE-Sephadex A-25 置一广口瓶中，加入30 ml 新配B液(体积比为60: 30: 8的氯仿、甲醇、0.8mol/L醋酸钠混合液)，振摇30 min，静置，去上清，如此重复3次，最后一次让树脂在B液中4 ℃下过夜。次日用30 ml A液(体积比为60: 30: 8的氯仿: 甲醇: 水混合液)洗树脂3～ 4次并悬浮于10 ml A液中，再倒入事先加入少许A液、外径为14 mm的层析柱中让树脂自然沉降，待溶剂流出后用60～ 80 ml A液洗涤去除全部醋酸钠。各种组织的总脂置入A液中缓慢上柱，速度为0.5 ml/min，过夜，使树脂与总脂充分交换。次日再以A液80 ml洗脱，速度为2 ml/min，收集洗脱液，(39±3)℃下减压蒸馏，即为中性鞘糖脂粗提物。
1.2.2.3 Florisil 柱层析纯化中性鞘糖脂 Florisil硅胶经用A液处理后上柱，再将中性鞘糖脂粗提物悬于80 ml A液中，按0.5 ml/min速度上样。洗脱液经减压蒸发后即得纯化中性鞘糖脂，溶于1:1 氯仿/甲醇溶液中，-20 ℃保存备用。
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1.2.3人脑组织不同部位中性鞘糖脂高效液相薄层层析(HPTLC)分析 以红细胞膜的中性鞘糖脂为标准品，将提取的不同部位正常人脑中性鞘糖脂标本按5 μl/条的量点样于HPTLC板上，吹干。然后置于已用新配展开剂 (氯仿:甲醇:水=60:35:8， V/V/V)平衡2 h的层析缸中上行展开，至板上沿约1 cm时停止。展开完成后冷风吹干，碘显色，比较人脑不同部位中性鞘糖脂的组成。
1.2.4 Glob-N的分离 纯化中性鞘糖脂以1:1氯仿/甲醇溶液(V/V)溶解，拌硅胶H(10～40 U)加压柱层析，用含甲醇30%、40%、50%、60%、70%的甲醇/氯仿溶液梯度洗脱，分管收集，每管于自制TLC板上点样检测，60: 35: 8的氯仿/甲醇/水混合液展开，碘显色。经与人O型血红细胞膜中性鞘糖脂比较，发现60%甲醇/氯仿的洗脱液为纯化Glob-N，呈一个斑点，Rf值0.45，合并收集，减压蒸干得到白色固体。
1.2.5人脑Glob-N的结构分析 将纯化Glob-N行1H-NMR、13C-NMR分析，鉴定结构。
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2 结果
2.1 HPTLC结果
碘显色法显示中性鞘糖脂呈棕黄色，各组分间距适当，条带清晰。与标准品(健康人O型血红细胞膜中性鞘糖脂)相比，正常人脑中性鞘糖脂由单己糖神经鞘氨醇(CMH)、二己糖神经鞘氨醇(CDH)、三己糖神经鞘氨醇(CTH)、红细胞糖苷脂(Glob-N)组成，从人脑不同部位提取的中性鞘糖脂各组分没有明显差别。Glob经柱层析分离后展开呈单一清晰条带，达到了层析纯，Rf值约0.45(展开剂为60:35:8氯仿/甲醇/水，V/V/V)。
2.2 人脑Glob结构分析 1H-NMR谱在δ2.794有一宽峰，表明分子中羟基的位置。糖基吸收峰累计9.6，说明结构中含有3个糖基，推测其饱和长链烷基中相似CH2数量为25个。正常人脑Glob结构中含有酰胺基，羰基碳在δ174.152；含有一个双键：δ134.072(CH)和129.720(CH)。
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3 讨论
国内外对鞘糖脂的研究集中于神经节苷脂，对中性鞘糖脂的研究较少，其原因一是后者含量少，二是纯化困难。目前分离纯化组织中中性鞘糖脂的方法有三种：(1)采用高压液相色谱(HPLC)[3]，分为分析型和制备型两种。其中制备型HPLC具有很好的分离效果，也是国外较常用的手段，所需成本高，对仪器损耗大，难以广泛开展；(2)采用高效薄层层析法。该方法比较简单，但制备的成品量少，不适合大量提取。1996年Muthing[4]采取可逆性亲脂荧光色素分离中性鞘糖脂，经过复杂的分离步骤，可得到较为纯净的单一组分；(3)薄层层析印迹法(TLC blotting)。1994年Taki[5]报道了一种新的糖脂和磷脂提取方法，命名为“TLC Blotting”。其方法是先将展开后的HPTLC板浸入印迹液(由40:20:7的异丙醇、甲醇、0.2%CaCl2组成)20秒，然后铺上PVDF膜和玻璃纤维滤纸，用高温熨斗180 ℃下印迹30秒，样品即由层析板转移到PVDF膜上。用小刀刮取所需成分，以甲醇/氯仿溶液溶解离心，蒸干溶剂，即可得到中性鞘糖脂单一组分。与在紫外光下直接从HPTLC板上刮取分离相比，该方法提取率高，且对鞘糖脂的结构没有影响。但由于PVDF膜很薄，所以该方法仍不适合大量制备鞘糖脂。
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我们根据TLC的原理，将化学分析中常用的柱层析方法引入中性鞘糖脂单一组分的纯化分离之中。TLC分离法的原理是利用不同分子量的物质在一定极性的展开条件下在硅胶中迁移程度(以Rf值表示)不同而达到分离目的，一般分子量小的物质层析Rf值大；相反，分子量大的物质Rf值小，展开后位于TLC板的底端。一种物质的层析迁移率还受到展开液极性的影响，在极性大的展开液中展开，Rf值就大；相反，物质在极性小的展开液中展开，层析位置就更靠近TLC板的底端。由于CMH、CDH、CTH、Glob-N在结构上只是糖基数量不同，所以可利用柱层析来分离纯化。
为了提取纯化牛脑Glob，首先必须确定其在TLC中的迁移行为，为此我们采用了不同极性的展开液作预实验将中性鞘糖脂展开，发现随着展开液极性的增大，Glob的Rf值也逐渐增大。因此我们在从中性鞘糖脂中分离Glob时采用了甲醇/氯仿溶液梯度洗脱，平均每种浓度2个柱体积，逐个将单糖基、双糖基、三糖基神经酰胺洗脱下来，分离纯化后经TLC板检测证实达到了层析纯。说明柱层析是一种有效的中性鞘糖脂分离手段。柱层析分离中性鞘糖脂单一组分的优点在于：简单、实用，易掌握，纯化效果好，产率大，纯度高，避开了既往各种分离方法中耗时费力的纯化过程，适合于大量分离中性鞘糖脂单一组分。鞘糖脂的结构分析方法包括[6～8]甲基化分析、内外切酶分析、质谱、飞行时间质谱以及糖基组成分析、选择素鉴定末端糖结构、去除末端糖基后功能实验等。但最常用的是1H-NMR分析。1H-NMR可确定化合物中H的数目，对碳水化合物来说，明确H的数目后，C的数目也就大致清楚了。
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现有的研究表明[9～12]，globo系鞘糖脂的结构包括Gb3、Gb4、isoGb4、Gb5、GL7、Glob-H等，其中Gb3(又称CD77)的结构为Gal(α1-4)Gal(β1-4)Glc-Cer；Gb4为GalNAc(β1-3) Gal(α1-4)Gal(β1-4)Glc-Cer；isoGb4为GalNAc(β1-3)Gal (α1-4)Gal(β1-3)Glc-Cer；Gb5为Gal(β1-3)GalNAc(β1-3)Gal(α1-4)Gal(β1-4)Glc-Cer或GalNAc(α1-3)GalNAc(β1-3)Gal(α1-4)Gal(β1-4)Glc-Cer；GL7为sialyl Gal(β1-3) GalNAc(β1-3)Gal(α1-4)Gal(β1-4)Glc-Cer；Glob-H为Fuc (α1-2)Gal(β1-3)GalNAc(β1-3)Gal(α1-4)Gal(β1-4)Glc-Cer。以上结构的来源包括正常人红细胞、骨骼肌、心肌、牛动脉内皮细胞、猪主动脉、猪小肠、猪绦虫等，尚未见从正常人脑组织中提取中性鞘糖脂单一组分的报道。
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我们对人脑Glob进行了1H-NMR、13C-NMR分析，推测它含有GalNAc，为三糖基神经酰胺。Cer中含有33个C原子。鞘糖脂结构中的糖基部分含有较多的羟基，这些活泼羟基对NMR结果有轻微影响，所以本研究所进行的结构分析只是一个初步的结果。深入分析Glob结构的手段有甲基化分析、碱水解等，因此本研究有待继续进行。
本实验分离和初步鉴定了人脑Glob-N的结构，目的是为了在以后的实验中分析Glob-N作用于胶质瘤细胞的分子机制，以及比较不同来源Glob-N的生物学活性与结构的关系，为寻找动物组织来源的Glob类似物及人工合成作准备。
基金项目：国家自然科学基金资助课题(39700143)
作者简介：张宗城(1969-)，男，湖北荆州人，1998年毕业于第一军医大学，硕士，电话：85143478，E-mail: zhangzongcheng@163.net
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参考文献：
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[4] Muthing J, Kemminer SE. Nondestructive detection of neutral glyco-sphingolipids with lipophilic anionic fluorochromes and their employ-ment for preparative high-performance thin-layer chromato- graphy[J]. Anal Biochem, 1996, 238(2):195-202.
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[9] Puri A, Hug P, Jernigan K, et al. The neutral glycosphingolipid globotriaosylceramide promotes fusion mediated by a CD4-dependent CXCR4-utilizing HIV type 1 envelope glycoprotein[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95(24):14435-40.
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[11]Olie RA, Fenderson B, Daley K, et al. Glycolipids of human primary testicular germ cell tumours[J]. Br J Cancer, 1996, 74(1):133-40.
[12]Kudryashov V, Ragupathi G, Kim I, et al. Characterization of a mouse monoclonal IgG3 antibody to the tumor-associated globo H structure produced by immunization with a synthetic glycoconjugate[J]. Glycoconj J, 1998, 15(3):243-9.
收稿日期：1999-10-25, 百拇医药
单位：张宗城(第一军医大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州510282)；张积仁(第一军医大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州510282)；张健(第一军医大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州510282)；林永成(中山大学化学系天然有机研究室，广东 广州510275)；汪森明(第一军医大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州510282)
关键词：中性鞘糖脂；柱层析；分离；纯化；结构分析
第一军医大学学报000431 摘要：目的 探索一种新的脑胶质瘤生长抑制因子Glob-N的分离鉴定方法。方法 人脑中性鞘糖脂经过加压柱层析，梯度甲醇/氯仿溶液洗脱。对所得到的产物行1H-NMR和13C-NMR测定。结果 含甲醇60%的甲醇/氯仿溶液的洗脱物为纯化Glob-N，层析展开后呈单一清晰条带，Rf值0.45。初步结构分析表明人脑Glob-N含N-乙酰半乳糖，共3个糖基，其神经酰胺部分共有33个碳原子。结论 柱层析分离中性鞘糖脂单一组分效果好，纯度高；人脑Glob结构中含3个糖基。
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中图分类号：Q538; Q71 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)04-0382-03
Isolation and preliminary structural characterization of Glob-N from normal human brain
ZHANG Zong-cheng, ZHANG Ji-ren, ZHANG Jian, WANG Sen-ming
(Center of Oncology, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, China)
LIN Yong-cheng
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(Department of Chemistry, Zhongshan University, Guangzhou 510275, China)Abstract: Objective To develop a new method for isolating and identifying a glioma growth factor inhibitor, Glob-N, from normal human brain. Methods Neutral glycosylsphingolipid was separated from normal human brain by column chromatography with methanol/chloroform solution for gradient elution, and the resultant underwent 1H-NMR and 13C-NMR analyses for identifying the structure of Glob-N. Results Glob-N was obtained by elution with 60% (V/V) methanol in methanol/chloroform solution, with the Rf value of 0.45. The structural analysis showed that Glob-N from human brain was a globotriaosylceramide, containing GalNAc with 33 carbon atom in its ceramide moiety. Conclusion Individual N-GSL can be well separated from total N-GSL by column chromatography with high output. Glob-N from human brain maybe a kind of globotriaosylceramide.
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Key words: neutral glycosphingolipid; column chromatography; purification; separation; structural characterization
脑胶质瘤是最常见的一种原发性颅内肿瘤，治疗效果不理想，患者的平均生存期仅为9～ 12个月。我们研究发现[1]，脑胶质瘤的发生与Globoside(命名为Glob-N)缺失有关。为了深入研究Glob-N在细胞生长、分化及恶性增殖中的调控作用，本实验采用一种新的分离方法对正常人脑Glob-N进行了分离纯化，并对其分子结构进行了初步分析。
1 材料与方法
1.1 材料
人脑组织1例(取自因意外事故死亡之尸体，死亡2 h后取标本)，健康人O型新鲜血液200 ml (购自广州市中心血站)，DEAE-Sephadex A25 (Pharmacia公司)，Florisil硅胶、Glob的标准品(Sigma公司)，硅胶G(德国E.Merck公司)，高效薄层层析板(德国E.Merck公司)，核磁共振仪(Inova500 MHz，美国Varian公司)。
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1.2 方法
1.2.1红细胞膜的纯化 取人脑额叶、颞叶、顶叶、小脑、桥脑组织各2 g，顶叶脑灰质、白质各2 g和各部位混合人脑组织200 g，以PBS液清洗，去除血污，吹干后用匀浆器匀浆，置–20 ℃冰箱中备用。健康人O型血200 ml，置于等量淋巴细胞分离液中4℃静止1 h，取下层富含红细胞部分用0.01 mol/L(pH7.2)的PBS液洗2次。低速离心10 min，沉淀置于密度1.090 的Ficoll-Pague 液体中，2 000 g离心10 min，下层细胞成分即为纯化红细胞。PBS液洗2次，加入一定量蒸馏水使之充分破膜。然后在低温超速离心机中20 000 g离心1 h，所得沉淀即为纯化的红细胞膜，–20 ℃冷冻备用。
1.2.2中性鞘糖脂的提取 按改良Hakomori的方法[2]进行。
1.2.2.1总脂的提取 匀浆后的人脑及红细胞膜分别以2:1、1:2、1:1的氯仿/甲醇(V/V)溶液提取总脂，氯仿/甲醇溶液总体积为组织的20倍，所得提取液在4 ℃下过夜。滤纸过滤、收集并合并3次滤液，(39±3)℃下减压蒸馏，所得淡黄色油状物即为总脂，以1:1氯仿/甲醇溶液(V/V)溶解，–20℃保存备用。
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1.2.2.2 DEAE-Sephadex-A25柱层析粗提中性鞘糖脂 称取2.2 g DEAE-Sephadex A-25 置一广口瓶中，加入30 ml 新配B液(体积比为60: 30: 8的氯仿、甲醇、0.8mol/L醋酸钠混合液)，振摇30 min，静置，去上清，如此重复3次，最后一次让树脂在B液中4 ℃下过夜。次日用30 ml A液(体积比为60: 30: 8的氯仿: 甲醇: 水混合液)洗树脂3～ 4次并悬浮于10 ml A液中，再倒入事先加入少许A液、外径为14 mm的层析柱中让树脂自然沉降，待溶剂流出后用60～ 80 ml A液洗涤去除全部醋酸钠。各种组织的总脂置入A液中缓慢上柱，速度为0.5 ml/min，过夜，使树脂与总脂充分交换。次日再以A液80 ml洗脱，速度为2 ml/min，收集洗脱液，(39±3)℃下减压蒸馏，即为中性鞘糖脂粗提物。
1.2.2.3 Florisil 柱层析纯化中性鞘糖脂 Florisil硅胶经用A液处理后上柱，再将中性鞘糖脂粗提物悬于80 ml A液中，按0.5 ml/min速度上样。洗脱液经减压蒸发后即得纯化中性鞘糖脂，溶于1:1 氯仿/甲醇溶液中，-20 ℃保存备用。
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1.2.3人脑组织不同部位中性鞘糖脂高效液相薄层层析(HPTLC)分析 以红细胞膜的中性鞘糖脂为标准品，将提取的不同部位正常人脑中性鞘糖脂标本按5 μl/条的量点样于HPTLC板上，吹干。然后置于已用新配展开剂 (氯仿:甲醇:水=60:35:8， V/V/V)平衡2 h的层析缸中上行展开，至板上沿约1 cm时停止。展开完成后冷风吹干，碘显色，比较人脑不同部位中性鞘糖脂的组成。
1.2.4 Glob-N的分离 纯化中性鞘糖脂以1:1氯仿/甲醇溶液(V/V)溶解，拌硅胶H(10～40 U)加压柱层析，用含甲醇30%、40%、50%、60%、70%的甲醇/氯仿溶液梯度洗脱，分管收集，每管于自制TLC板上点样检测，60: 35: 8的氯仿/甲醇/水混合液展开，碘显色。经与人O型血红细胞膜中性鞘糖脂比较，发现60%甲醇/氯仿的洗脱液为纯化Glob-N，呈一个斑点，Rf值0.45，合并收集，减压蒸干得到白色固体。
1.2.5人脑Glob-N的结构分析 将纯化Glob-N行1H-NMR、13C-NMR分析，鉴定结构。
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2 结果
2.1 HPTLC结果
碘显色法显示中性鞘糖脂呈棕黄色，各组分间距适当，条带清晰。与标准品(健康人O型血红细胞膜中性鞘糖脂)相比，正常人脑中性鞘糖脂由单己糖神经鞘氨醇(CMH)、二己糖神经鞘氨醇(CDH)、三己糖神经鞘氨醇(CTH)、红细胞糖苷脂(Glob-N)组成，从人脑不同部位提取的中性鞘糖脂各组分没有明显差别。Glob经柱层析分离后展开呈单一清晰条带，达到了层析纯，Rf值约0.45(展开剂为60:35:8氯仿/甲醇/水，V/V/V)。
2.2 人脑Glob结构分析 1H-NMR谱在δ2.794有一宽峰，表明分子中羟基的位置。糖基吸收峰累计9.6，说明结构中含有3个糖基，推测其饱和长链烷基中相似CH2数量为25个。正常人脑Glob结构中含有酰胺基，羰基碳在δ174.152；含有一个双键：δ134.072(CH)和129.720(CH)。
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3 讨论
国内外对鞘糖脂的研究集中于神经节苷脂，对中性鞘糖脂的研究较少，其原因一是后者含量少，二是纯化困难。目前分离纯化组织中中性鞘糖脂的方法有三种：(1)采用高压液相色谱(HPLC)[3]，分为分析型和制备型两种。其中制备型HPLC具有很好的分离效果，也是国外较常用的手段，所需成本高，对仪器损耗大，难以广泛开展；(2)采用高效薄层层析法。该方法比较简单，但制备的成品量少，不适合大量提取。1996年Muthing[4]采取可逆性亲脂荧光色素分离中性鞘糖脂，经过复杂的分离步骤，可得到较为纯净的单一组分；(3)薄层层析印迹法(TLC blotting)。1994年Taki[5]报道了一种新的糖脂和磷脂提取方法，命名为“TLC Blotting”。其方法是先将展开后的HPTLC板浸入印迹液(由40:20:7的异丙醇、甲醇、0.2%CaCl2组成)20秒，然后铺上PVDF膜和玻璃纤维滤纸，用高温熨斗180 ℃下印迹30秒，样品即由层析板转移到PVDF膜上。用小刀刮取所需成分，以甲醇/氯仿溶液溶解离心，蒸干溶剂，即可得到中性鞘糖脂单一组分。与在紫外光下直接从HPTLC板上刮取分离相比，该方法提取率高，且对鞘糖脂的结构没有影响。但由于PVDF膜很薄，所以该方法仍不适合大量制备鞘糖脂。
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我们根据TLC的原理，将化学分析中常用的柱层析方法引入中性鞘糖脂单一组分的纯化分离之中。TLC分离法的原理是利用不同分子量的物质在一定极性的展开条件下在硅胶中迁移程度(以Rf值表示)不同而达到分离目的，一般分子量小的物质层析Rf值大；相反，分子量大的物质Rf值小，展开后位于TLC板的底端。一种物质的层析迁移率还受到展开液极性的影响，在极性大的展开液中展开，Rf值就大；相反，物质在极性小的展开液中展开，层析位置就更靠近TLC板的底端。由于CMH、CDH、CTH、Glob-N在结构上只是糖基数量不同，所以可利用柱层析来分离纯化。
为了提取纯化牛脑Glob，首先必须确定其在TLC中的迁移行为，为此我们采用了不同极性的展开液作预实验将中性鞘糖脂展开，发现随着展开液极性的增大，Glob的Rf值也逐渐增大。因此我们在从中性鞘糖脂中分离Glob时采用了甲醇/氯仿溶液梯度洗脱，平均每种浓度2个柱体积，逐个将单糖基、双糖基、三糖基神经酰胺洗脱下来，分离纯化后经TLC板检测证实达到了层析纯。说明柱层析是一种有效的中性鞘糖脂分离手段。柱层析分离中性鞘糖脂单一组分的优点在于：简单、实用，易掌握，纯化效果好，产率大，纯度高，避开了既往各种分离方法中耗时费力的纯化过程，适合于大量分离中性鞘糖脂单一组分。鞘糖脂的结构分析方法包括[6～8]甲基化分析、内外切酶分析、质谱、飞行时间质谱以及糖基组成分析、选择素鉴定末端糖结构、去除末端糖基后功能实验等。但最常用的是1H-NMR分析。1H-NMR可确定化合物中H的数目，对碳水化合物来说，明确H的数目后，C的数目也就大致清楚了。
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现有的研究表明[9～12]，globo系鞘糖脂的结构包括Gb3、Gb4、isoGb4、Gb5、GL7、Glob-H等，其中Gb3(又称CD77)的结构为Gal(α1-4)Gal(β1-4)Glc-Cer；Gb4为GalNAc(β1-3) Gal(α1-4)Gal(β1-4)Glc-Cer；isoGb4为GalNAc(β1-3)Gal (α1-4)Gal(β1-3)Glc-Cer；Gb5为Gal(β1-3)GalNAc(β1-3)Gal(α1-4)Gal(β1-4)Glc-Cer或GalNAc(α1-3)GalNAc(β1-3)Gal(α1-4)Gal(β1-4)Glc-Cer；GL7为sialyl Gal(β1-3) GalNAc(β1-3)Gal(α1-4)Gal(β1-4)Glc-Cer；Glob-H为Fuc (α1-2)Gal(β1-3)GalNAc(β1-3)Gal(α1-4)Gal(β1-4)Glc-Cer。以上结构的来源包括正常人红细胞、骨骼肌、心肌、牛动脉内皮细胞、猪主动脉、猪小肠、猪绦虫等，尚未见从正常人脑组织中提取中性鞘糖脂单一组分的报道。
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我们对人脑Glob进行了1H-NMR、13C-NMR分析，推测它含有GalNAc，为三糖基神经酰胺。Cer中含有33个C原子。鞘糖脂结构中的糖基部分含有较多的羟基，这些活泼羟基对NMR结果有轻微影响，所以本研究所进行的结构分析只是一个初步的结果。深入分析Glob结构的手段有甲基化分析、碱水解等，因此本研究有待继续进行。
本实验分离和初步鉴定了人脑Glob-N的结构，目的是为了在以后的实验中分析Glob-N作用于胶质瘤细胞的分子机制，以及比较不同来源Glob-N的生物学活性与结构的关系，为寻找动物组织来源的Glob类似物及人工合成作准备。
基金项目：国家自然科学基金资助课题(39700143)
作者简介：张宗城(1969-)，男，湖北荆州人，1998年毕业于第一军医大学，硕士，电话：85143478，E-mail: zhangzongcheng@163.net
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收稿日期：1999-10-25, 百拇医药