抗肿瘤多药抗性核酶转录质粒的构建及其体外切割研究
作者：袁亚维 张积仁
单位：袁亚维(第一军医大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州 510282)；张积仁(第一军医大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州 510282)
关键词：mdr1基因；核酶；体外切割
第一军医大学学报000412 摘要：目的 探讨体外核酶对肿瘤多药抗性相关基因mdr1靶RNA分子的切割作用及其影响因素。方法 利用计算机软件设计能特异切割mdr1 mRNA的锤头状核酶(ribozyme)，并构建抗mdr1-ribozyme和靶分子的体外转录质粒，进行体外切割实验。结果 发现抗mdr1-ribozyme能较好地切割mdr1 mRNA。 结论 抗肿瘤多药抗性核酶的体外研究为其体内应用提供了参考，ribozyme有可能成为逆转肿瘤多药抗性的新药物。
中图分类号：Q527; R730.1 文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1000-2588(2000)04-0349-03
The construction of a plasmid transcribing anti-mdr1 ribozyme and its cleaving reaction in vitro
YUAN Ya-wei，ZHANG Ji-ren
(Department of Oncology, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, China)
Abstract: Objective To study the in vitro cleavage of mdr1 target RNA by ribozyme and its influencing factors. Methods By using the computer software we designed a specific hammerhead ribozyme possessing catalytic activity that cleaves the mdr1 mRNA. A RNA-trimming plasmid pRG5mR3 and a target RNA trascribing plasmid pSABl were constructed, and a specific ribozyme cleaving reaction to target RNA was analysed. Results It was found that anti-mdr1-ribozyme is able to cleave a transcribed mdr1 mRNA fragment under physiological conditions. Conclusion The ribozyme may be targeted to inhibit the expression of the mdr1 gene in vivo, and may potentially offer a help in the strategy of cancer treatment.
, 百拇医药
Key words：mdr1 gene; ribozyme; cleaving reaction
本实验以锤头结构为模型，利用计算机软件人工设计能特异地切割肿瘤多药抗性相关基因mdr1 mRNA的核酶分子，并分别构建其体外转录质粒和含240 bp的mdr1靶DNA分子的体外转录质粒，旨在探讨体外核酶对mdr1靶RNA分子的切割作用及其影响因素，为将核酶发展成为一种逆转肿瘤多药抗性的药物奠定基础。
1 材料与方法
1.1 质粒
pTZ18R、pTZ19R购自Pharmacia公司；pRG523由中国科学院上海生化所陆长德教授构建并惠赠；PI-4/HaeⅢ由德国T.Hoof教授惠赠；pBLUESCRIPT购自GIBCO公司。
1.2 试剂
, http://www.100md.com
各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、T4多核苷酸激酶、Klenow酶、T7 RNA聚合酶、Taq DNA聚合酶等均为Promega公司产品；同位素化合物[α-32 P]UTP(111 000 GBq/mmol)购自Amersham公司。
1.3 核酶的设计及其基因合成
采用计算机软件，根据
采用计算机软件，根据Symons[1]的锤头结构模型设计核酶，并在ABI公司391-EP型核酸合成仪上用亚磷酰胺三酯固相法合成相应基因。
1.4 扩增目的基因
根据Gottesmen等[2]测定的mdr1基因序列，设计两条引物，应用PCR方法扩增目的基因。
, 百拇医药
1.5 RNA的体外转录
转录质粒用合适的限制性内切酶酶切，使之线性化，在体外转录反应体系中[5x转录缓冲液4 μl；100 mmol/L DTT 2 μl； RNasin (20 U/μl) 0.5 μl；ATP、GTP、CTP(各2.5 mmol/L) 4 μl；500 μmol/L UTP 0～2 μl；模板DNA(0.2～1.0 μg/μl) 1μl； 〔α-32 P〕UTP(370 kBq/μl) 2 μl；T7 RNA聚合酶(40 U/μl) 0.5 μl；RNase-Free ddH2O至终体积20 μl]，37 ℃水浴60～90 min。
2 结果
2.1 核酶基因片断和引物
分别合成了两条核酶基因片断，为了便于克隆组装，一条基因片断中引入了SalⅠ和HindⅢ切点；另一条基因片断中引入了XbaⅠ和AatⅡ切点(如下)。
, 百拇医药
Rz1：5’TCGACGTGCTTGTCCACTGAGAGTCCGTGAGGACGAAACAACATTTTA 3’
SalⅠ
Rz1’：5’AGCTTAAAATGTTGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGTGGACAAGCACG 3’
HindⅢ
Rz2：5’CTAGGTGCTTGTCCACTGATGAGTCCGTGGGGACGAAACAACATTTTGACGT 3’
XbaⅠ AatⅡ
Rz2’：5’ CAAAATGTTGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGTGGACAAGCAC 3’
, http://www.100md.com 为提高目的基因的克隆效率及方便组装，在引物的5’端设计了一些限制性酶切位点，其核苷酸序列如下：
引物(P1)：5’GAAGAATTCGCAATTGTACCCATCATTGC 3’
EcoRⅠ
引物(P2)：5’ GAAGGATCCCCTGCAAACTCTGAGCAT 3’
BamHⅠ
Ribozyme的二级结构如图1。
图 1 核酶二级结构
, http://www.100md.com
Fig.1 Secondary structure of ribozyme
2.2 抗mdr1核酶自剪切质粒pRG523/mR和底物基因片段转录质粒pSAB I的构建
体外合成的两单链DNA Rz2和Rz2’末端磷酸化后，经变性、复性后，克隆到带5’和3’自身修剪功能的质粒pRG523[3]的XbaⅠ、AatⅡ限制性酶切的大片段上。阳性克隆命名为pRG523/mR，不能被XbaⅠ、XhoⅠ和KpnⅠ酶切。
以质粒PI-4/HaeⅢ DNA为模板，合成的寡核苷酸片段P1、P2为引物，用PCR方法扩增底物基因片段。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，其长度为200 bp。样品用酚/氯仿抽提，取水相乙醇沉淀，DNA溶于20 μl TE中。将mdr1片段用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后，再克隆到转录质粒pBLUESCRIPTⅡ上。阳性质粒命名为pSAB I，以EcoRⅠ、BamHⅠ双酶可切出200 bp左右的片段。
, http://www.100md.com
2.3 核酶和底物片段RNA的体外转录
将pRG523/mR经EcoRⅠ线性化、pSAB I经BamHⅠ线性化后，在T7RNA pol和[α-32P]UTR参与下离体转录，通过聚丙烯酰胺凝胶(含7 mol/L尿素)、割胶、浸泡、沉淀，得到60 nt的ribozyme和240 nt的靶RNA(图2)，测定它们的放射性计数。
图2 pRG523/mR和 pSAB I体外转录结果
Fig.2 Transcription of pRG523/mR and pSABI in vitro
1.pRG523/mR; 2.pSAB I
63 nt:5’-cis-Rz；50 nt:3’-cis-Rz；60 nt:Trans-Rz；
, 百拇医药
240 nt: Target RNA；Rz: Ribozyme
2.4 抗mdr1核酶的体外切割作用
取制备的核酶0.8 pmol和靶RNA 0.2 pmol，在不同温度下(10～60 ℃)水浴保温90 min或37 ℃保温不同的时间。结果(图3～5)表明，体外转录制备的核酶具有特异的催化切割mdr1RNA活性。在0～40 ℃时，核酶的活性随着反应温度的提高而提高；在40 ℃以上，其活性则逐渐降低。核酶的反应活性随着时间的增加而增加，但时间达到100 min 时，其活性则增加不明显。
图3 抗mdr1核酶体外切割
Fig.3 Cleavage of mdr1 mRNA by ribozyme
, 百拇医药
240 nt:mdr1 target RNA nucleotide; 137 nt、103 nt:Fragments cleaved by Rz;
63 nt:5’-cis-Rz; 50 nt:3’-cis-Rz; 60 nt:trans-Rz
图4 温度对核酶活性的影响
Fig.4 Effect of temperature on ribozyme activity
图5 反应时间对核酶活性的影响
Fig.5 Effect of reaction time on ribozyme activity
, 百拇医药
3 讨论
多药抗药性(Multi-drug resistance，MDR)是指肿瘤细胞接触了一种药物以后，不仅对该药产生耐药性，而且对其它结构和作用机制不同的药物也产生耐药性。逆转多药抗性是临床急待解决的问题。已发现一些药物如钙拮抗剂、三氟拉嗪、环孢菌素A、异博定、吩噻嗪等在体外能有效地逆转MDR，其中异博定和环孢菌素A已被应用于临床。不过这些药物有较大的毒副作用，从而限制了它们的临床应用[4、5]。随着分子生物学技术的发展，已证实人mdr1基因是肿瘤多药抗性的相关基因，它的表达产物可将亲脂类药物排出细胞外，从而导致耐药表型产生[6]，因此人工调控mdr1基因表达是逆转MDR的重要策略。
核酶是具有催化功能的RNA分子，它可以有效地、序列特异地切割RNA分子。自从1981年Cech[7]第一次发现RNA这种特性以来，相继发现了多种能催化分子间反应的核酶，如锤头结构(Hammerhead structure)、发卡结构(Hairpin structure)、丁型肝炎病毒的斧头结构(Axehead structure)和链孢霉线粒体VSRNA核酶。其中锤头结构核酶是Symons等[8]比较了一些病毒、拟病毒和卫星病毒RNA自我剪切规律后提出的二级结构模型，它由13个保守核苷酸残基和三个螺旋区构成。它的自我剪切活性依赖于结构和构象的完整性。由于锤头结构是上述各种已知核酶中最小的核酶，易于按照需要设计和合成，通过序列特异性地切割靶RNA，达到阻断基因表达，因而近年来得到广泛的利用[9、10]。
, 百拇医药
本实验以锤头结构为模型，利用计算机人工设计能特异地切割mdr1 mRNA的核酶分子，在体外切割实验中证实了它具有较高的切割效益。结果还表明，适合核酶切割反应的最佳条件与体内环境基本一致，这为核酶成为逆转肿瘤细胞MDR的新型而有效的工具提供了有力依据，但核酶的体内应用还有许多问题并没有解决，有待于进一步深入研究。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39300159)
作者简介：袁亚维(1966-)，女，湖南邵阳人，1997年毕业于第一军医大学，博士, 副主任医师，副教授，电话：85142868
参考文献：
[1] Jeffries AC, Symons RH. Actalytic 13-mer ribozyme[J]. Nucleic Acid Res, 1989, 17(4):137-7.
, 百拇医药
[2] Akiyama SI, FojoA A, Gottesman MM. Isolation and genetic characterization of human KB cell lines resistant to multiple drugs[J]. Somat Cell Genet, 1985, 11(4):117-26.
[3] He YK, Lu CD, Qi GR. In vitro cleavage of HPV16E6 and E7 RNA fragment by synthetic ribozymes and transcribed ribozymes from RNA-trimming plasmids[J]. FEBS, 1993, 322(1):21-4.
[4] Hegewish-Becker S. Mdr1 reversal: criteria for clinical trials designed to overcome the multidrug resistance phenotype[J]. Leukemia, 1996, 10(Suppl 3):s32-8.
, http://www.100md.com
[5] Eckhardt S. Present research trends in cancer chemotherapy[J]. Acta Med Hung, 1994, 50(3-4):133-40.
[6] Gottesman MM. Genetic analysis of the multidrug transporter[J]. Annu Res Genet, 1995, 29(2):607-12.
[7] Cech TR, Zang AJ, Grabowski PJ. In vitro splicing of the rebosomal RNA precursor of tetrahymena: involvement of a guanosine nucleotide in the excision of the intervening sequence cell[J]. Cell, 1981, 27(3):487-96.
, 百拇医药
[8] Symons RH. Self-cleavage of RNA in the replication of small pathogens of plants and animals[J]. TIBS, 1989, 14(11):445-50.
[9] Dropulic B, Elkins DA, Rossi JJ, et al. Ribozyme: use as anti-HIV therapeutic molecules[J]. Antisense Res Dev, 1993, 3(1):87-94.
[10]Efrat S, Leiser M, Wu YJ. Ribozyme-mediated attenuation of pancreatic beta-cell glucokinase expression in transgenic mice results in impaired glucose-induced insulin secretion[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91(6):2051-5.
收稿日期：1999-10-21, 百拇医药
单位：袁亚维(第一军医大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州 510282)；张积仁(第一军医大学珠江医院肿瘤中心，广东 广州 510282)
关键词：mdr1基因；核酶；体外切割
第一军医大学学报000412 摘要：目的 探讨体外核酶对肿瘤多药抗性相关基因mdr1靶RNA分子的切割作用及其影响因素。方法 利用计算机软件设计能特异切割mdr1 mRNA的锤头状核酶(ribozyme)，并构建抗mdr1-ribozyme和靶分子的体外转录质粒，进行体外切割实验。结果 发现抗mdr1-ribozyme能较好地切割mdr1 mRNA。 结论 抗肿瘤多药抗性核酶的体外研究为其体内应用提供了参考，ribozyme有可能成为逆转肿瘤多药抗性的新药物。
中图分类号：Q527; R730.1 文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1000-2588(2000)04-0349-03
The construction of a plasmid transcribing anti-mdr1 ribozyme and its cleaving reaction in vitro
YUAN Ya-wei，ZHANG Ji-ren
(Department of Oncology, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282, China)
Abstract: Objective To study the in vitro cleavage of mdr1 target RNA by ribozyme and its influencing factors. Methods By using the computer software we designed a specific hammerhead ribozyme possessing catalytic activity that cleaves the mdr1 mRNA. A RNA-trimming plasmid pRG5mR3 and a target RNA trascribing plasmid pSABl were constructed, and a specific ribozyme cleaving reaction to target RNA was analysed. Results It was found that anti-mdr1-ribozyme is able to cleave a transcribed mdr1 mRNA fragment under physiological conditions. Conclusion The ribozyme may be targeted to inhibit the expression of the mdr1 gene in vivo, and may potentially offer a help in the strategy of cancer treatment.
, 百拇医药
Key words：mdr1 gene; ribozyme; cleaving reaction
本实验以锤头结构为模型，利用计算机软件人工设计能特异地切割肿瘤多药抗性相关基因mdr1 mRNA的核酶分子，并分别构建其体外转录质粒和含240 bp的mdr1靶DNA分子的体外转录质粒，旨在探讨体外核酶对mdr1靶RNA分子的切割作用及其影响因素，为将核酶发展成为一种逆转肿瘤多药抗性的药物奠定基础。
1 材料与方法
1.1 质粒
pTZ18R、pTZ19R购自Pharmacia公司；pRG523由中国科学院上海生化所陆长德教授构建并惠赠；PI-4/HaeⅢ由德国T.Hoof教授惠赠；pBLUESCRIPT购自GIBCO公司。
1.2 试剂
, http://www.100md.com
各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、T4多核苷酸激酶、Klenow酶、T7 RNA聚合酶、Taq DNA聚合酶等均为Promega公司产品；同位素化合物[α-32 P]UTP(111 000 GBq/mmol)购自Amersham公司。
1.3 核酶的设计及其基因合成
采用计算机软件，根据
采用计算机软件，根据Symons[1]的锤头结构模型设计核酶，并在ABI公司391-EP型核酸合成仪上用亚磷酰胺三酯固相法合成相应基因。
1.4 扩增目的基因
根据Gottesmen等[2]测定的mdr1基因序列，设计两条引物，应用PCR方法扩增目的基因。
, 百拇医药
1.5 RNA的体外转录
转录质粒用合适的限制性内切酶酶切，使之线性化，在体外转录反应体系中[5x转录缓冲液4 μl；100 mmol/L DTT 2 μl； RNasin (20 U/μl) 0.5 μl；ATP、GTP、CTP(各2.5 mmol/L) 4 μl；500 μmol/L UTP 0～2 μl；模板DNA(0.2～1.0 μg/μl) 1μl； 〔α-32 P〕UTP(370 kBq/μl) 2 μl；T7 RNA聚合酶(40 U/μl) 0.5 μl；RNase-Free ddH2O至终体积20 μl]，37 ℃水浴60～90 min。
2 结果
2.1 核酶基因片断和引物
分别合成了两条核酶基因片断，为了便于克隆组装，一条基因片断中引入了SalⅠ和HindⅢ切点；另一条基因片断中引入了XbaⅠ和AatⅡ切点(如下)。
, 百拇医药
Rz1：5’TCGACGTGCTTGTCCACTGAGAGTCCGTGAGGACGAAACAACATTTTA 3’
SalⅠ
Rz1’：5’AGCTTAAAATGTTGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGTGGACAAGCACG 3’
HindⅢ
Rz2：5’CTAGGTGCTTGTCCACTGATGAGTCCGTGGGGACGAAACAACATTTTGACGT 3’
XbaⅠ AatⅡ
Rz2’：5’ CAAAATGTTGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGTGGACAAGCAC 3’
, http://www.100md.com 为提高目的基因的克隆效率及方便组装，在引物的5’端设计了一些限制性酶切位点，其核苷酸序列如下：
引物(P1)：5’GAAGAATTCGCAATTGTACCCATCATTGC 3’
EcoRⅠ
引物(P2)：5’ GAAGGATCCCCTGCAAACTCTGAGCAT 3’
BamHⅠ
Ribozyme的二级结构如图1。
图 1 核酶二级结构
, http://www.100md.com
Fig.1 Secondary structure of ribozyme
2.2 抗mdr1核酶自剪切质粒pRG523/mR和底物基因片段转录质粒pSAB I的构建
体外合成的两单链DNA Rz2和Rz2’末端磷酸化后，经变性、复性后，克隆到带5’和3’自身修剪功能的质粒pRG523[3]的XbaⅠ、AatⅡ限制性酶切的大片段上。阳性克隆命名为pRG523/mR，不能被XbaⅠ、XhoⅠ和KpnⅠ酶切。
以质粒PI-4/HaeⅢ DNA为模板，合成的寡核苷酸片段P1、P2为引物，用PCR方法扩增底物基因片段。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，其长度为200 bp。样品用酚/氯仿抽提，取水相乙醇沉淀，DNA溶于20 μl TE中。将mdr1片段用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后，再克隆到转录质粒pBLUESCRIPTⅡ上。阳性质粒命名为pSAB I，以EcoRⅠ、BamHⅠ双酶可切出200 bp左右的片段。
, http://www.100md.com
2.3 核酶和底物片段RNA的体外转录
将pRG523/mR经EcoRⅠ线性化、pSAB I经BamHⅠ线性化后，在T7RNA pol和[α-32P]UTR参与下离体转录，通过聚丙烯酰胺凝胶(含7 mol/L尿素)、割胶、浸泡、沉淀，得到60 nt的ribozyme和240 nt的靶RNA(图2)，测定它们的放射性计数。
图2 pRG523/mR和 pSAB I体外转录结果
Fig.2 Transcription of pRG523/mR and pSABI in vitro
1.pRG523/mR; 2.pSAB I
63 nt:5’-cis-Rz；50 nt:3’-cis-Rz；60 nt:Trans-Rz；
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240 nt: Target RNA；Rz: Ribozyme
2.4 抗mdr1核酶的体外切割作用
取制备的核酶0.8 pmol和靶RNA 0.2 pmol，在不同温度下(10～60 ℃)水浴保温90 min或37 ℃保温不同的时间。结果(图3～5)表明，体外转录制备的核酶具有特异的催化切割mdr1RNA活性。在0～40 ℃时，核酶的活性随着反应温度的提高而提高；在40 ℃以上，其活性则逐渐降低。核酶的反应活性随着时间的增加而增加，但时间达到100 min 时，其活性则增加不明显。
图3 抗mdr1核酶体外切割
Fig.3 Cleavage of mdr1 mRNA by ribozyme
, 百拇医药
240 nt:mdr1 target RNA nucleotide; 137 nt、103 nt:Fragments cleaved by Rz;
63 nt:5’-cis-Rz; 50 nt:3’-cis-Rz; 60 nt:trans-Rz
图4 温度对核酶活性的影响
Fig.4 Effect of temperature on ribozyme activity
图5 反应时间对核酶活性的影响
Fig.5 Effect of reaction time on ribozyme activity
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3 讨论
多药抗药性(Multi-drug resistance，MDR)是指肿瘤细胞接触了一种药物以后，不仅对该药产生耐药性，而且对其它结构和作用机制不同的药物也产生耐药性。逆转多药抗性是临床急待解决的问题。已发现一些药物如钙拮抗剂、三氟拉嗪、环孢菌素A、异博定、吩噻嗪等在体外能有效地逆转MDR，其中异博定和环孢菌素A已被应用于临床。不过这些药物有较大的毒副作用，从而限制了它们的临床应用[4、5]。随着分子生物学技术的发展，已证实人mdr1基因是肿瘤多药抗性的相关基因，它的表达产物可将亲脂类药物排出细胞外，从而导致耐药表型产生[6]，因此人工调控mdr1基因表达是逆转MDR的重要策略。
核酶是具有催化功能的RNA分子，它可以有效地、序列特异地切割RNA分子。自从1981年Cech[7]第一次发现RNA这种特性以来，相继发现了多种能催化分子间反应的核酶，如锤头结构(Hammerhead structure)、发卡结构(Hairpin structure)、丁型肝炎病毒的斧头结构(Axehead structure)和链孢霉线粒体VSRNA核酶。其中锤头结构核酶是Symons等[8]比较了一些病毒、拟病毒和卫星病毒RNA自我剪切规律后提出的二级结构模型，它由13个保守核苷酸残基和三个螺旋区构成。它的自我剪切活性依赖于结构和构象的完整性。由于锤头结构是上述各种已知核酶中最小的核酶，易于按照需要设计和合成，通过序列特异性地切割靶RNA，达到阻断基因表达，因而近年来得到广泛的利用[9、10]。
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本实验以锤头结构为模型，利用计算机人工设计能特异地切割mdr1 mRNA的核酶分子，在体外切割实验中证实了它具有较高的切割效益。结果还表明，适合核酶切割反应的最佳条件与体内环境基本一致，这为核酶成为逆转肿瘤细胞MDR的新型而有效的工具提供了有力依据，但核酶的体内应用还有许多问题并没有解决，有待于进一步深入研究。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39300159)
作者简介：袁亚维(1966-)，女，湖南邵阳人，1997年毕业于第一军医大学，博士, 副主任医师，副教授，电话：85142868
参考文献：
[1] Jeffries AC, Symons RH. Actalytic 13-mer ribozyme[J]. Nucleic Acid Res, 1989, 17(4):137-7.
, 百拇医药
[2] Akiyama SI, FojoA A, Gottesman MM. Isolation and genetic characterization of human KB cell lines resistant to multiple drugs[J]. Somat Cell Genet, 1985, 11(4):117-26.
[3] He YK, Lu CD, Qi GR. In vitro cleavage of HPV16E6 and E7 RNA fragment by synthetic ribozymes and transcribed ribozymes from RNA-trimming plasmids[J]. FEBS, 1993, 322(1):21-4.
[4] Hegewish-Becker S. Mdr1 reversal: criteria for clinical trials designed to overcome the multidrug resistance phenotype[J]. Leukemia, 1996, 10(Suppl 3):s32-8.
, http://www.100md.com
[5] Eckhardt S. Present research trends in cancer chemotherapy[J]. Acta Med Hung, 1994, 50(3-4):133-40.
[6] Gottesman MM. Genetic analysis of the multidrug transporter[J]. Annu Res Genet, 1995, 29(2):607-12.
[7] Cech TR, Zang AJ, Grabowski PJ. In vitro splicing of the rebosomal RNA precursor of tetrahymena: involvement of a guanosine nucleotide in the excision of the intervening sequence cell[J]. Cell, 1981, 27(3):487-96.
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[8] Symons RH. Self-cleavage of RNA in the replication of small pathogens of plants and animals[J]. TIBS, 1989, 14(11):445-50.
[9] Dropulic B, Elkins DA, Rossi JJ, et al. Ribozyme: use as anti-HIV therapeutic molecules[J]. Antisense Res Dev, 1993, 3(1):87-94.
[10]Efrat S, Leiser M, Wu YJ. Ribozyme-mediated attenuation of pancreatic beta-cell glucokinase expression in transgenic mice results in impaired glucose-induced insulin secretion[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91(6):2051-5.
收稿日期：1999-10-21, 百拇医药