人鼻咽癌细胞株和组织中Kappa样蛋白的检测
作者：胡维新 何莉芳
单位：湖南医科大学分子生物学研究中心 长沙 410078
关键词：人鼻咽癌(NPC)；免疫球蛋白Kappa(IgK)基因；Western免疫印迹；免疫组化
中国现代医学杂志000412目的：为进一步研究免疫球蛋白Kappa基因在鼻咽癌(NPC)细胞中的表达，对NPC细胞株CNE2、NPC活检标本及石蜡切片中的Kappa样蛋白进行了检测。方法：从NPC细胞株、NPC活检标本得到蛋白抽提物，用Western免疫印迹法进行分析，信号通过生物素-抗生物素蛋白与生物素-辣根过氧物酶系统放大，然后再用ECL化学发光试剂盒进行检测，NPC石蜡切片用免疫组化进行检测。结果：NPC细胞株CNE2中检测到一31 Kd的Kappa样蛋白，使用兔抗人Kappa轻链抗体在NPC活检标本中得到一个特别信号，而使用兔抗人Lambda轻链抗体在同样样品中未见信号，在NPC石蜡切片中使用抗Kappa抗体时，有大约10%的细胞为阳性，而使用抗Lambda抗体没有细胞呈阳性信号。结论：一个与Ig Kappa C区基因有关的蛋白质存在于NPC细胞株和NPC活检标本中，Ig Kappa在NPC中基因的表达是特异的，并且可能与NPC致癌有关。
, 百拇医药
分类号 R739.63
DETECTION OF KAPPA-LIKE PROTEIN IN HUMAN
NPC CELL LINE AND NPC BIOPSIES
Hu Weixin He Lifang
(Molecular Biology Research Center and Department of Biology,Hunan Medical University, Changsha, Hunan 410078)
Objective: In order to further understand Ig kappa gene expression in NPC cells, the Ig kappa-like protein in NPC cell line CNE2, NPC biopsies and NPC paraffin sections were detected. Methods: Protein extracts from NPC cell line CNE2 and NPC biopsies were detected by Western blot analysis. The signals were amplified by biotin-avidin/biotin-HRP system and detected by Amersham ECL chemiluminescent kit. NPC paraffin sections were detected by immunohistochemistry techniques. Results: A 31kd of kappa-like protein was detectd in NPC cell line CNE2 and a specific signal was detected in NPC biopsies by rabbit anti-human kappa light chain. No signal was detected by rabbit ’anti-human lambda light chain in the same samples. About 10% of cells in NPC paraffin sections were positive when using rabbit ’anti-human kappa light chain. No cells in NPC paraffin sections were positive with rabbit ’anti-human lambda light chain. Conclusions: A protein related to Ig kappa constant region gene exist in NPC cell line and NPC biopsies. Ig kappa gene expression in NPC is specific and may related to NPC carcinogenesis.
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Key words: Human nasopharyngeal carcinoma (NPC); Immunoglobulin kappa (Ig K) gene; Western blot analysis; Imminohistochemistry
几年来对人类鼻咽癌发病分子机理的研究，取得了很大的进展。发现癌细胞中c-H-ras和c-myc原癌基因活化[1]，p53基因过表达[2]及EB病毒癌基因EBNA-5，EZLF1的表达。这些基因的表达和鼻咽癌的发生又与某些化学致癌物和EB病毒的感染有关[3]。令人感兴趣的是，曹亚等从中国人鼻咽癌细胞株CNE2中克隆了一段有转化活性的DNA序列[4]，并将这段DNA序列称之为Tx基因。胡维新等对Tx基因进行了进一步的研究，包括对Tx基因的核苷酸序列分析，Tx基因与免疫球蛋白Kappa基因的同源性比较研究[5，6]。现已基本明确，先前在鼻咽癌细胞株中发现的Tx基因，实际上就是免疫球蛋白轻链Kappa基因。Northern印迹杂交及原位分子杂交分析证明，Kappa基因在几株鼻咽癌细胞株中均表达[6]。为进一步研究Kappa基因的表达状态，本文运用Westren免疫印迹、免疫组化方法，对CNE2、鼻咽癌活检标本及石蜡切片中Kappa基因和Lambda基因同时进行检测，得到了有意义的结果。
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1 材料与方法
1.1 材料
人鼻咽癌细胞株CNE2系Dr.Lee LM(美国 NCI)惠赠，39例鼻咽癌活检标本及石蜡切片来自湖南省肿瘤医院，病理检查均为低分化鳞癌。试剂：兔抗人Kappa轻链及Lambda轻链，HRP连接的猪抗兔IgG均购自DAKO(丹麦)，ECL Western免疫印迹试剂盒购自Amersham (英国)，硝酸纤维膜购自Millipore(美国)，低分子量蛋白质标志物购自Bio-Rad(美国)。
1.2 方法
1.2.1 Western免疫印迹 将新鲜活检组织约0.2 g，用PBS洗三次，加150 μl蛋白抽提液(含0.5% NP-40，0.1%SDS，10 μg/ml Leupeptin,1 mM PMSF,10 mM DTT)，剪碎组织，制成匀浆，再加150 μl样品缓冲液(100 mM Tris pH6.8,200 mM DTT，4% SDS，0.2%溴酚蓝，20%甘油)，超声处理，离心收集上清备用。细胞株CNE2生长到50%覆盖率时，去掉培养基，PBS洗三次，加入蛋白抽提液，用刮子刮下，再加样品缓冲液超声处理。加样前于100 ℃加热10 min，加30 μl样品于SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳，使用Tris-甘氨酸缓冲液，电压恒定在150 V。当溴酚蓝迁移到凝胶底部1 cm处时，停止电泳，把胶浸泡到转膜缓冲液中，轻轻摇动20 min，以除去电泳缓冲液中的盐及去污剂。然后用Bio-Rad的Trans-Blot SD半干型电泳转移槽，将蛋白质转移到硝酸纤维膜上，转移完成后，用考马斯亮兰R-250染色凝胶，以观察凝胶上是否有蛋白质残留。将膜浸泡于阻断液中(含4%去脂干奶粉和1%BSA)，轻轻摆动，室温过夜。信号检测按如下步骤进行：一抗(兔抗人Kappa或Lambda抗体)按1∶1 000稀释，加到膜上，室温2h，洗去一抗后加生物素标记的二抗(羊抗兔，1∶1 000稀释)，室温1 h，洗去二抗，加入Avidin(抗生物素蛋白)，生物素连接的HRP(辣根过氧化物酶)，室温30～60 min，使二抗、Avidin、生物素连接的HRP充分结合。洗去游离的HRP后，立即用ECL化学发光剂进行信号检测，X光片直接曝光。
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1.2.2 免疫组织化学 鼻咽癌石蜡切片经脱蜡、水化后，用含0.3%H2O2的甲醇处理30 min。水洗数次，PBS洗5 min。加1%猪血清，30 min后吸去猪血清，加1∶1 000的一抗(免抗人Kappa或Lambda)，4 ℃过夜。加HRP标记的猪抗免IgG于室温30 min，PBS洗二次，用DAB.H2O2显色5～30 min，自来水冲洗，然后衬染、脱水、透明、封片。
1.2.3 HE染色 按常规进行。
2 结果
2.1 人鼻咽癌细胞株
人鼻咽癌细胞株CNE2的蛋白提取物，分别加样10 μg，20 μg，30 μg于SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳，以生物素标记的SDS-PAGE蛋白质分子量标志物为标准共同电泳，进行Western免疫印迹分析，用抗Kappa抗体进行检测，在31 Kd处可见到一条特异的蛋白质带，而相同的样品，使用抗Lambda抗体，则未见到这一特异带型(图1)。
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图1 鼻咽癌细胞株CNE2中Kappa样蛋白的检测
1：10 μg；2：20 μg；3：30 μg
A：兔抗人Kappa抗体；B：兔抗人Lambda抗体
2.2 鼻咽癌活检标本
加样50 μg蛋白质于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，Western免疫印迹进行分析，用抗Kappa抗体检测时，在31 Kd处也检测到一条特异带，而用抗Lambda抗体，在相同标本中未检测到阳性信号(图2)。
图2 鼻咽癌活检标本中Kappa样蛋白的检测
1～7号为不同的鼻咽癌活检标本
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A：兔抗人Kappa抗体；B：兔抗人Lambda抗体
2.3 鼻咽癌切片标本
免疫组化分析结果显示，在鼻咽癌石蜡切片中，低分化鳞癌组织中部分癌细胞抗Kappa抗体呈阳性，阳性信号定位清晰，呈棕色细颗粒状，约占癌细胞总数的10%，绝大多数细胞呈阴性。而使用抗Lambda抗体，所有细胞均呈阴性(图3)。
图3 鼻咽癌石蜡切片的免疫组化研究
A：兔抗人Kappa抗体；B：兔抗人Lambda抗体；C：阴性对照
3 讨论
通过对人鼻咽癌发病的分子机理研究，发现了一系列与鼻咽癌有关的基因表达异常，包括某些原癌基因与肿瘤抑制基因。曹亚等早先报道的从鼻咽癌细胞株CNE2中克隆的，与鼻咽癌有关的转化基因Tx，经过DNA序列分析，同源性比较，证实了Tx基因就是免疫球蛋白轻链Kappa基因。Northern印迹杂交分析，可以检测到一条1.3 Kb的mRNA杂交带。原位分子杂交在鼻咽癌细胞株中检测到阳性信号，而Hela细胞则没有阳性信号。为了检测鼻咽癌细胞株和鼻咽癌组织中是否存在Kappa蛋白，同时也是为了检测在上述组织、细胞中是否还有别的免疫球蛋白轻链基因(如Lambda基因)的表达，本文用抗Kappa蛋白和抗Lambda蛋白抗体，使用Western免疫印迹和免疫组化技术，分别对上述样品进行了检测。结果如图1、图2及图3所示。不管是Western免疫印迹还是免疫组化，这些样品中都只检测到Kappa蛋白的存在，而未见到Lambda蛋白阳性信号，表明在鼻咽癌细胞中并非所有的免疫球蛋白基因都异常表达。我们还检测到鼻咽癌细胞中Kappa蛋白的分子量为31 Kd。
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在多发性骨髓瘤中，常常见到免疫球蛋白基因的异常表达。在这类患者的血清及尿液中检测到的Bence-Jones蛋白，实际上就是免疫球蛋白轻链的表达产物，包括Kappa和Lambda两种轻链蛋白[7]。Bence-Jones蛋白的分子量为24Kd，而在鼻咽癌细胞株中检测到的Kappa样蛋白的分子量为31Kd，明显大于Bence-Jones蛋白，表明鼻咽癌细胞中的这种蛋白不是单纯的Kappa基因表达产物，而可能是Kappa基因C区与其它基因融合后的蛋白产物。由于所用抗体对免疫球蛋白的轻链C区是特异的，故用抗Kappa抗体能检测到特异的信号。
从鼻咽癌组织石蜡切片的免疫组化研究中，只检测到癌组织中约10%的细胞呈阳性反应，所检测的鼻咽癌切片标本均为低分化鳞癌。一种可能的解释是，Kappa基因的表达可能仅发生在这些癌细胞的细胞周期某一时相，故呈阳性反应，而大多数细胞仍处于其它时相，故呈阴性。现在很难断定哪一时相表达这种蛋白质。
致谢
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本工作得到Dr.Gazitt Y(University of Texas Health Science Center at San Antonio,Texas,USA)的大力支持与帮助，在此表示诚致的谢意。
参 考 文 献
1，Sun Y.Molecular oncology of human nasophanyngeal carcinoma.The cancer Journal,1995;8:325
2，谢 奕，姚开泰，胡维新.鼻咽癌、宫颈癌和肺癌中p53基因突变和表达的对比研究.中华病理学杂志，1997；26：229
3，Schmidt CW,Micko IS.The ecology and pathology of epstein Barr virus.Immol cell Biol,1995;73:489
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4，Cao Y,et al.Isolation and partial characterization of a transformation-associated sequence from human nasopharyngeal carcinoma.Mol Carcinogenesis,1991;4:297
5，胡维新，曹 亚，黎民敬，等.人类鼻咽癌细胞株CNE2的转化基因Tx的一个EcoRI片段的核苷酸序列分析.生物化学杂志，1993；9：331
6，胡维新，曹 亚，李晓艳，等.Tx基因Ig K基因的同源性研究及其在不同细胞株的表达.生物化学，生物物理学报，1995；27：215
7，Makoto Tsunenaga,et al.Unpolidng and refolidng of a type K immunoglobulin light chain and its variable and constant fragments.Biochemistry,1987;26:6044
收稿1999-09-11, http://www.100md.com
单位：湖南医科大学分子生物学研究中心 长沙 410078
关键词：人鼻咽癌(NPC)；免疫球蛋白Kappa(IgK)基因；Western免疫印迹；免疫组化
中国现代医学杂志000412目的：为进一步研究免疫球蛋白Kappa基因在鼻咽癌(NPC)细胞中的表达，对NPC细胞株CNE2、NPC活检标本及石蜡切片中的Kappa样蛋白进行了检测。方法：从NPC细胞株、NPC活检标本得到蛋白抽提物，用Western免疫印迹法进行分析，信号通过生物素-抗生物素蛋白与生物素-辣根过氧物酶系统放大，然后再用ECL化学发光试剂盒进行检测，NPC石蜡切片用免疫组化进行检测。结果：NPC细胞株CNE2中检测到一31 Kd的Kappa样蛋白，使用兔抗人Kappa轻链抗体在NPC活检标本中得到一个特别信号，而使用兔抗人Lambda轻链抗体在同样样品中未见信号，在NPC石蜡切片中使用抗Kappa抗体时，有大约10%的细胞为阳性，而使用抗Lambda抗体没有细胞呈阳性信号。结论：一个与Ig Kappa C区基因有关的蛋白质存在于NPC细胞株和NPC活检标本中，Ig Kappa在NPC中基因的表达是特异的，并且可能与NPC致癌有关。
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分类号 R739.63
DETECTION OF KAPPA-LIKE PROTEIN IN HUMAN
NPC CELL LINE AND NPC BIOPSIES
Hu Weixin He Lifang
(Molecular Biology Research Center and Department of Biology,Hunan Medical University, Changsha, Hunan 410078)
Objective: In order to further understand Ig kappa gene expression in NPC cells, the Ig kappa-like protein in NPC cell line CNE2, NPC biopsies and NPC paraffin sections were detected. Methods: Protein extracts from NPC cell line CNE2 and NPC biopsies were detected by Western blot analysis. The signals were amplified by biotin-avidin/biotin-HRP system and detected by Amersham ECL chemiluminescent kit. NPC paraffin sections were detected by immunohistochemistry techniques. Results: A 31kd of kappa-like protein was detectd in NPC cell line CNE2 and a specific signal was detected in NPC biopsies by rabbit anti-human kappa light chain. No signal was detected by rabbit ’anti-human lambda light chain in the same samples. About 10% of cells in NPC paraffin sections were positive when using rabbit ’anti-human kappa light chain. No cells in NPC paraffin sections were positive with rabbit ’anti-human lambda light chain. Conclusions: A protein related to Ig kappa constant region gene exist in NPC cell line and NPC biopsies. Ig kappa gene expression in NPC is specific and may related to NPC carcinogenesis.
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Key words: Human nasopharyngeal carcinoma (NPC); Immunoglobulin kappa (Ig K) gene; Western blot analysis; Imminohistochemistry
几年来对人类鼻咽癌发病分子机理的研究，取得了很大的进展。发现癌细胞中c-H-ras和c-myc原癌基因活化[1]，p53基因过表达[2]及EB病毒癌基因EBNA-5，EZLF1的表达。这些基因的表达和鼻咽癌的发生又与某些化学致癌物和EB病毒的感染有关[3]。令人感兴趣的是，曹亚等从中国人鼻咽癌细胞株CNE2中克隆了一段有转化活性的DNA序列[4]，并将这段DNA序列称之为Tx基因。胡维新等对Tx基因进行了进一步的研究，包括对Tx基因的核苷酸序列分析，Tx基因与免疫球蛋白Kappa基因的同源性比较研究[5，6]。现已基本明确，先前在鼻咽癌细胞株中发现的Tx基因，实际上就是免疫球蛋白轻链Kappa基因。Northern印迹杂交及原位分子杂交分析证明，Kappa基因在几株鼻咽癌细胞株中均表达[6]。为进一步研究Kappa基因的表达状态，本文运用Westren免疫印迹、免疫组化方法，对CNE2、鼻咽癌活检标本及石蜡切片中Kappa基因和Lambda基因同时进行检测，得到了有意义的结果。
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1 材料与方法
1.1 材料
人鼻咽癌细胞株CNE2系Dr.Lee LM(美国 NCI)惠赠，39例鼻咽癌活检标本及石蜡切片来自湖南省肿瘤医院，病理检查均为低分化鳞癌。试剂：兔抗人Kappa轻链及Lambda轻链，HRP连接的猪抗兔IgG均购自DAKO(丹麦)，ECL Western免疫印迹试剂盒购自Amersham (英国)，硝酸纤维膜购自Millipore(美国)，低分子量蛋白质标志物购自Bio-Rad(美国)。
1.2 方法
1.2.1 Western免疫印迹 将新鲜活检组织约0.2 g，用PBS洗三次，加150 μl蛋白抽提液(含0.5% NP-40，0.1%SDS，10 μg/ml Leupeptin,1 mM PMSF,10 mM DTT)，剪碎组织，制成匀浆，再加150 μl样品缓冲液(100 mM Tris pH6.8,200 mM DTT，4% SDS，0.2%溴酚蓝，20%甘油)，超声处理，离心收集上清备用。细胞株CNE2生长到50%覆盖率时，去掉培养基，PBS洗三次，加入蛋白抽提液，用刮子刮下，再加样品缓冲液超声处理。加样前于100 ℃加热10 min，加30 μl样品于SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳，使用Tris-甘氨酸缓冲液，电压恒定在150 V。当溴酚蓝迁移到凝胶底部1 cm处时，停止电泳，把胶浸泡到转膜缓冲液中，轻轻摇动20 min，以除去电泳缓冲液中的盐及去污剂。然后用Bio-Rad的Trans-Blot SD半干型电泳转移槽，将蛋白质转移到硝酸纤维膜上，转移完成后，用考马斯亮兰R-250染色凝胶，以观察凝胶上是否有蛋白质残留。将膜浸泡于阻断液中(含4%去脂干奶粉和1%BSA)，轻轻摆动，室温过夜。信号检测按如下步骤进行：一抗(兔抗人Kappa或Lambda抗体)按1∶1 000稀释，加到膜上，室温2h，洗去一抗后加生物素标记的二抗(羊抗兔，1∶1 000稀释)，室温1 h，洗去二抗，加入Avidin(抗生物素蛋白)，生物素连接的HRP(辣根过氧化物酶)，室温30～60 min，使二抗、Avidin、生物素连接的HRP充分结合。洗去游离的HRP后，立即用ECL化学发光剂进行信号检测，X光片直接曝光。
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1.2.2 免疫组织化学 鼻咽癌石蜡切片经脱蜡、水化后，用含0.3%H2O2的甲醇处理30 min。水洗数次，PBS洗5 min。加1%猪血清，30 min后吸去猪血清，加1∶1 000的一抗(免抗人Kappa或Lambda)，4 ℃过夜。加HRP标记的猪抗免IgG于室温30 min，PBS洗二次，用DAB.H2O2显色5～30 min，自来水冲洗，然后衬染、脱水、透明、封片。
1.2.3 HE染色 按常规进行。
2 结果
2.1 人鼻咽癌细胞株
人鼻咽癌细胞株CNE2的蛋白提取物，分别加样10 μg，20 μg，30 μg于SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳，以生物素标记的SDS-PAGE蛋白质分子量标志物为标准共同电泳，进行Western免疫印迹分析，用抗Kappa抗体进行检测，在31 Kd处可见到一条特异的蛋白质带，而相同的样品，使用抗Lambda抗体，则未见到这一特异带型(图1)。
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图1 鼻咽癌细胞株CNE2中Kappa样蛋白的检测
1：10 μg；2：20 μg；3：30 μg
A：兔抗人Kappa抗体；B：兔抗人Lambda抗体
2.2 鼻咽癌活检标本
加样50 μg蛋白质于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，Western免疫印迹进行分析，用抗Kappa抗体检测时，在31 Kd处也检测到一条特异带，而用抗Lambda抗体，在相同标本中未检测到阳性信号(图2)。
图2 鼻咽癌活检标本中Kappa样蛋白的检测
1～7号为不同的鼻咽癌活检标本
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A：兔抗人Kappa抗体；B：兔抗人Lambda抗体
2.3 鼻咽癌切片标本
免疫组化分析结果显示，在鼻咽癌石蜡切片中，低分化鳞癌组织中部分癌细胞抗Kappa抗体呈阳性，阳性信号定位清晰，呈棕色细颗粒状，约占癌细胞总数的10%，绝大多数细胞呈阴性。而使用抗Lambda抗体，所有细胞均呈阴性(图3)。
图3 鼻咽癌石蜡切片的免疫组化研究
A：兔抗人Kappa抗体；B：兔抗人Lambda抗体；C：阴性对照
3 讨论
通过对人鼻咽癌发病的分子机理研究，发现了一系列与鼻咽癌有关的基因表达异常，包括某些原癌基因与肿瘤抑制基因。曹亚等早先报道的从鼻咽癌细胞株CNE2中克隆的，与鼻咽癌有关的转化基因Tx，经过DNA序列分析，同源性比较，证实了Tx基因就是免疫球蛋白轻链Kappa基因。Northern印迹杂交分析，可以检测到一条1.3 Kb的mRNA杂交带。原位分子杂交在鼻咽癌细胞株中检测到阳性信号，而Hela细胞则没有阳性信号。为了检测鼻咽癌细胞株和鼻咽癌组织中是否存在Kappa蛋白，同时也是为了检测在上述组织、细胞中是否还有别的免疫球蛋白轻链基因(如Lambda基因)的表达，本文用抗Kappa蛋白和抗Lambda蛋白抗体，使用Western免疫印迹和免疫组化技术，分别对上述样品进行了检测。结果如图1、图2及图3所示。不管是Western免疫印迹还是免疫组化，这些样品中都只检测到Kappa蛋白的存在，而未见到Lambda蛋白阳性信号，表明在鼻咽癌细胞中并非所有的免疫球蛋白基因都异常表达。我们还检测到鼻咽癌细胞中Kappa蛋白的分子量为31 Kd。
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在多发性骨髓瘤中，常常见到免疫球蛋白基因的异常表达。在这类患者的血清及尿液中检测到的Bence-Jones蛋白，实际上就是免疫球蛋白轻链的表达产物，包括Kappa和Lambda两种轻链蛋白[7]。Bence-Jones蛋白的分子量为24Kd，而在鼻咽癌细胞株中检测到的Kappa样蛋白的分子量为31Kd，明显大于Bence-Jones蛋白，表明鼻咽癌细胞中的这种蛋白不是单纯的Kappa基因表达产物，而可能是Kappa基因C区与其它基因融合后的蛋白产物。由于所用抗体对免疫球蛋白的轻链C区是特异的，故用抗Kappa抗体能检测到特异的信号。
从鼻咽癌组织石蜡切片的免疫组化研究中，只检测到癌组织中约10%的细胞呈阳性反应，所检测的鼻咽癌切片标本均为低分化鳞癌。一种可能的解释是，Kappa基因的表达可能仅发生在这些癌细胞的细胞周期某一时相，故呈阳性反应，而大多数细胞仍处于其它时相，故呈阴性。现在很难断定哪一时相表达这种蛋白质。
致谢
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本工作得到Dr.Gazitt Y(University of Texas Health Science Center at San Antonio,Texas,USA)的大力支持与帮助，在此表示诚致的谢意。
参 考 文 献
1，Sun Y.Molecular oncology of human nasophanyngeal carcinoma.The cancer Journal,1995;8:325
2，谢 奕，姚开泰，胡维新.鼻咽癌、宫颈癌和肺癌中p53基因突变和表达的对比研究.中华病理学杂志，1997；26：229
3，Schmidt CW,Micko IS.The ecology and pathology of epstein Barr virus.Immol cell Biol,1995;73:489
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4，Cao Y,et al.Isolation and partial characterization of a transformation-associated sequence from human nasopharyngeal carcinoma.Mol Carcinogenesis,1991;4:297
5，胡维新，曹 亚，黎民敬，等.人类鼻咽癌细胞株CNE2的转化基因Tx的一个EcoRI片段的核苷酸序列分析.生物化学杂志，1993；9：331
6，胡维新，曹 亚，李晓艳，等.Tx基因Ig K基因的同源性研究及其在不同细胞株的表达.生物化学，生物物理学报，1995；27：215
7，Makoto Tsunenaga,et al.Unpolidng and refolidng of a type K immunoglobulin light chain and its variable and constant fragments.Biochemistry,1987;26:6044
收稿1999-09-11, http://www.100md.com