L-甲状腺素诱导心肌肥厚模型下电压依赖性K+通道mRNA的表达
作者：曹文 孙胜利 凌树森 王自正 戴德哉
单位：曹文(南京军区南京总医院临床药理科，江苏南京 210002)；孙胜利(第二军医大学实习生)；凌树森(南京军区南京总医院临床药理科，江苏南京 210002)；王自正(南京市第一人民医院放免中心)；戴德哉(中国药科大学药理研究室)
关键词：心肌肥厚；电压依赖性K+通道；RT-PCR
医学研究生学报000401摘要： 目的：探讨心肌肥厚易致心律失常的机制。 方法：用L-甲状腺素制备大鼠心肌肥厚模型，定量逆转录PCR方法(RT-PCR)测定肥厚心肌内电压依赖性K+通道mRNA含量。 结果：与正常对照组相比，肥厚心肌内电压依赖性K+通道mRNA的表达水平下降42%(P<0.05)。 结论：电压依赖性K+通道是心肌电活动的主要离子通道，心肌肥厚时电压依赖性K+通道转录水平下降，可能会导致动作电位复极化时间延长，进而易诱发心律失常。
, 百拇医药
中图分类号： R542.2 文献标识码： A
文章编号： 1008-8199(2000)04-0213-03
Voltage-gated K+ channels mRNA expression
in L-thyroxine-induced cardiomyocyte hypertrophy
CAO Wen LIN Shu-sen
(Department of Clinical Pharmacology, Jinling Hospital, Nanjing 210002,Jiangsu,China)
SUN Sheng-li
, 百拇医药
(Student of the Second Military Medical University)
WANG Zi-zheng
(Center of Radioimmunity of Nanjing First People's Hospital)
DA De-zai
(Department of Pharmacology Investigation, China Pharmaceutical University)
Abstract: Objectives: To understand the molecular mechanisms of electrophysiological alterations underlying cardiomyocyte hypertrophy. Methods: Expression of cardiac voltage-gated K+ channel genes was examined in ventricles of L-thyroxin-induced cardiac hypertrophy rats. This study quantified voltage-gated K+ channel mRNA by reverse transcription and polymerase chain reaction amplification. Results: Compared with control group, the expressions of voltage-gated K+ channels mRNA were significantly decreased by 42%(P<0.05). Conclusions:The electrophysiological alterations may be associated with transcriptional regulation of voltage-gated K+ channels. These findings provide, at least in part, the molecular basis for electrophysiological alterations under hypertrophy.
, 百拇医药
Key words: Hypertrophy； Voltage-gated K+channels； RT-PCR
0 引 言
电压依赖性K+通道在心肌动作电位复极化过程中起着很大作用，K+内流直接影响心肌复极化时间，复极化时间延长易导致心律失常。在高负荷、高钠、血管紧张素Ⅱ、肾上腺素等方法诱导的心肌肥厚模型中，电压依赖性K+电流减小[1]，K+通道表达下降[2,3]。而甲状腺素诱导的心肌肥厚模型K+通道变化国内尚未见报道。甲状腺功能亢进(简称甲亢)是临床较常见的疾病，其主要并发症是心血管系统疾病。因此，本研究拟用甲状腺素诱导的心肌肥厚模型进行电压依赖性K+通道mRNA的表达，以探讨甲亢状态下心律失常的机制。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 动物试验 16只雄性、2月龄SD大鼠，体重(235±30.5)g，由南京军区南京总医院动物实验中心提供。随机分成两组，试验组9只，对照组7只。每天早晨进食前试验组用羧甲基纤维素混悬的L-甲状腺素灌胃，剂量为1 mg/(kg.d)，每天给药前称体重，根据体重确定给药量。对照组根据体重给予相同体积的空白羧甲基纤维素混悬液，连续10天。处死前禁食12 h，眼眶取血2 ml，用放射免疫标记法测定T3、T4的含量(南京第一人民医院放射免疫中心测定)，然后断头处死，迅速取出心脏，蘸干血液后称重，取肥厚部分的心室肌放入液氮中，使其瞬间冷却，然后转入-70℃冰箱中冷冻待用。
1.2 总RNA的提取 取100 mg左右的心肌组织，加入RNA提取专用试剂TRIzol 1 ml，按试剂说明书操作，最后加入灭活RNA酶的去离子水10 μl重新溶解RNA，待用。
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1.3 设计引物 为了得到扩增产物是总的电压依赖性K+通道，把引物设计在电压依赖性K+通道高度保留区的S4和H5链上[5]，其上游引物序列为5-TTTCAAGTTGTCCAGACACTC-3，下游引物序列为5-TGTCTCCATAGCCTACAGTTG-3，扩增片段长度为230 bp。
1.4 内标的选择 根据文献报道核糖体蛋白S16与待检测K+通道mRNA具有相同的扩增动力学和相重合的指数扩增期[4,5]，其引物序列为5引物5-AGGAGCGATTTGCTGGTGTGGA-3，3引物5-GCTACCAGGCCTTGAGATGGA-3扩增的片段长度为102 bp。
1.5 定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 逆转录 取总RNA1～2 μg，加入MgCl2 5 mmol、buffer 1×、 dNTP 1 mmol、rRNasin ribonuclease inhibitor 0.5 U、AMV reverse transcriptase (H.C.) 15 U、oligo(dT16) primer 0.5 μg，总体积20 μl。逆转录条件为45 ℃ 60 min，99℃ 5 min和4℃ 5 min。 PCR 各成分浓度为dNTP 1 mmol/L、MgCl2 1 mmol/L、Taq酶2 U、引物各加2 μl， 总体积为50 μl。循环条件为：94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸45 s，循环30圈(PE 2400)。反应完毕，每管中加入溴酚蓝指示剂1 μl后上样，电泳完毕后，用即刻成像系统(GEL DOC 1000 BIO RAD)留取照片，并进行密度扫描，将K+通道的扩增产物密度值与内标的密度值相比，以比值计量。
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1.6 统计学方法 试验结果用均数±标准差(
±s)表示，以单侧方差分析(ANOVA)检验组间差异，P<0.05有显著意义。
2 结 果
2.1 给药组与空白组大鼠体重变化 无明显差异(P>0.05)(图1)。
图1 大鼠口服L-甲状腺素后体重变化
Figure 1 Body weight of rats after oral administration of L-thyroxin
2.2 给药组与对照组心脏体重比(cardiac index) 明显高于对照组(P<0.05)，血清T3浓度两组没有显著性差异，T4浓度试验组明显高于对照组(P<0.01)(图2)。
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图2 实验组与对照组口服L-甲状腺素后心脏指数及血浆T3，T4浓度(nmol/L)
Figure 2 The cardiac index and the plasma concentrations of T3,T4 after oral administration L-thyroxin (nmol/L)2.3 扩增循环数 为选定一个合适的扩增循环数，进行了不同循环次数实验(图3)。
图3 PCR 产物量与PCR循环次数的关系
Figure 3 PCR signals as a function of amount of total RNA and number of PCR cycles
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在36个循环以前，循环数与产物量(密度值)成正比，本实验选择循环数为30，确保产物量不受循环数影响，只与模板量相关。
2.4 PCR扩增产物条带 在上述条件下，PCR扩增产物条带清晰，无杂带干扰(图4)。
图4 RT-PCR法扩增大鼠心室肌钾通道及S16核糖体蛋白
Figure 4 RT-PCR products of K+ Channel and S16 from rat ventricle
2.5 K+通道mRNA表达改变 K+通道mRNA表达水平明显下降，试验组比对照组降低了42%(P<0.05)(图5)。
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3 讨 论
mRNA的测定是在分子水平上研究基因表达的常用方法，RT-PCR则以其灵敏度高(比杂交法高1 000～10 000倍)、专一性好、快速简单的特点，作为mRNA检定的方法日益得到认可[4]。用RT-PCR进行mRNA定量需解决两个关键问题：即引物与模板的结合效率和不同管扩增引起的“管效应”。用扩增动力学曲线寻找合适的扩增循环次数，可有效地避免因结合效率不同而引起的误差。内标与待检测物在同一管中扩增，可以克服“管效应”，以及随后样品处理所带来的误差，保证了方法的准确性。
图5 L-甲状腺素诱导心肌肥厚组与对照组心室中电压依从性钾通道mRNA表达
Figure 5 Representative comparison of cardiac K+ channel gene expression in ventricles of L-thyroxin-induced cardiac hypertrophy rats and in control rats
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L-甲状腺素能提高人体的基础代谢率，增强交感神经的活动，增加心率与心脏的负荷，由图1与图2结果可知，L-甲状腺素以1 mg/(kg.d)灌胃，可致大鼠心肌肥厚。 心肌肥厚易诱发心律失常，K+通道在心肌电生理中起着关键作用。本实验的结论认为：甲状腺素诱导的心肌肥厚模型K+通道mRNA表达降低，细胞膜上K+通道数量减少，导致钾电流减小。钾电流减小，使心肌细胞复极化时间延长，易致心律失常。
曹文(1963-),女,安徽桐城人,医学博士研究生,从事心血管药理研究.
参考文献：
[1] Rozanski G J, Xu Z, Zhang K, et al. Altered K+ current of ventricular myocytes in rats with chronic myocardial infarction[J]. Am J Physiol, 1998,274(Heart Circ. Physio.43):H259-H265.
, http://www.100md.com
[2] Takimoto K, Li DQ，Hershman KH,et al. Decreased expression of Kv4.2 and novel Kv4.3 K+ channel subunit mRNAs in ventricles of renovascular hypertensive rats[J]. Circ Res, 1997,181(4):533-539.
[3] MadhaviGidh-Jain, Boyu Huang, Praveer Jain,et al.Differential expression of voltage-gated K+ channel genes in left ventricular remodeled myocardium after experimental myocardial infarction[J]. Circ Res, 1996,79(4),669-675.
, 百拇医药
[4] Foley KP, Leonard MW, Engel JD. Quantitation of RNA using the polymerase chain reaction[J]. Trends Genet, 1993,9(11),380-385.
[5] Zahradka P, Harris KD, Triggs-Raine B,et al. PCR-based analysis of voltage-gated K+channels in vascular smooth muscle[J]. Mol Cell Biol, 1995,145,39-44.
收稿日期：1999-11-09, http://www.100md.com
单位：曹文(南京军区南京总医院临床药理科，江苏南京 210002)；孙胜利(第二军医大学实习生)；凌树森(南京军区南京总医院临床药理科，江苏南京 210002)；王自正(南京市第一人民医院放免中心)；戴德哉(中国药科大学药理研究室)
关键词：心肌肥厚；电压依赖性K+通道；RT-PCR
医学研究生学报000401摘要： 目的：探讨心肌肥厚易致心律失常的机制。 方法：用L-甲状腺素制备大鼠心肌肥厚模型，定量逆转录PCR方法(RT-PCR)测定肥厚心肌内电压依赖性K+通道mRNA含量。 结果：与正常对照组相比，肥厚心肌内电压依赖性K+通道mRNA的表达水平下降42%(P<0.05)。 结论：电压依赖性K+通道是心肌电活动的主要离子通道，心肌肥厚时电压依赖性K+通道转录水平下降，可能会导致动作电位复极化时间延长，进而易诱发心律失常。
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中图分类号： R542.2 文献标识码： A
文章编号： 1008-8199(2000)04-0213-03
Voltage-gated K+ channels mRNA expression
in L-thyroxine-induced cardiomyocyte hypertrophy
CAO Wen LIN Shu-sen
(Department of Clinical Pharmacology, Jinling Hospital, Nanjing 210002,Jiangsu,China)
SUN Sheng-li
, 百拇医药
(Student of the Second Military Medical University)
WANG Zi-zheng
(Center of Radioimmunity of Nanjing First People's Hospital)
DA De-zai
(Department of Pharmacology Investigation, China Pharmaceutical University)
Abstract: Objectives: To understand the molecular mechanisms of electrophysiological alterations underlying cardiomyocyte hypertrophy. Methods: Expression of cardiac voltage-gated K+ channel genes was examined in ventricles of L-thyroxin-induced cardiac hypertrophy rats. This study quantified voltage-gated K+ channel mRNA by reverse transcription and polymerase chain reaction amplification. Results: Compared with control group, the expressions of voltage-gated K+ channels mRNA were significantly decreased by 42%(P<0.05). Conclusions:The electrophysiological alterations may be associated with transcriptional regulation of voltage-gated K+ channels. These findings provide, at least in part, the molecular basis for electrophysiological alterations under hypertrophy.
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Key words: Hypertrophy； Voltage-gated K+channels； RT-PCR
0 引 言
电压依赖性K+通道在心肌动作电位复极化过程中起着很大作用，K+内流直接影响心肌复极化时间，复极化时间延长易导致心律失常。在高负荷、高钠、血管紧张素Ⅱ、肾上腺素等方法诱导的心肌肥厚模型中，电压依赖性K+电流减小[1]，K+通道表达下降[2,3]。而甲状腺素诱导的心肌肥厚模型K+通道变化国内尚未见报道。甲状腺功能亢进(简称甲亢)是临床较常见的疾病，其主要并发症是心血管系统疾病。因此，本研究拟用甲状腺素诱导的心肌肥厚模型进行电压依赖性K+通道mRNA的表达，以探讨甲亢状态下心律失常的机制。
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1 材料与方法
1.1 动物试验 16只雄性、2月龄SD大鼠，体重(235±30.5)g，由南京军区南京总医院动物实验中心提供。随机分成两组，试验组9只，对照组7只。每天早晨进食前试验组用羧甲基纤维素混悬的L-甲状腺素灌胃，剂量为1 mg/(kg.d)，每天给药前称体重，根据体重确定给药量。对照组根据体重给予相同体积的空白羧甲基纤维素混悬液，连续10天。处死前禁食12 h，眼眶取血2 ml，用放射免疫标记法测定T3、T4的含量(南京第一人民医院放射免疫中心测定)，然后断头处死，迅速取出心脏，蘸干血液后称重，取肥厚部分的心室肌放入液氮中，使其瞬间冷却，然后转入-70℃冰箱中冷冻待用。
1.2 总RNA的提取 取100 mg左右的心肌组织，加入RNA提取专用试剂TRIzol 1 ml，按试剂说明书操作，最后加入灭活RNA酶的去离子水10 μl重新溶解RNA，待用。
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1.3 设计引物 为了得到扩增产物是总的电压依赖性K+通道，把引物设计在电压依赖性K+通道高度保留区的S4和H5链上[5]，其上游引物序列为5-TTTCAAGTTGTCCAGACACTC-3，下游引物序列为5-TGTCTCCATAGCCTACAGTTG-3，扩增片段长度为230 bp。
1.4 内标的选择 根据文献报道核糖体蛋白S16与待检测K+通道mRNA具有相同的扩增动力学和相重合的指数扩增期[4,5]，其引物序列为5引物5-AGGAGCGATTTGCTGGTGTGGA-3，3引物5-GCTACCAGGCCTTGAGATGGA-3扩增的片段长度为102 bp。
1.5 定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 逆转录 取总RNA1～2 μg，加入MgCl2 5 mmol、buffer 1×、 dNTP 1 mmol、rRNasin ribonuclease inhibitor 0.5 U、AMV reverse transcriptase (H.C.) 15 U、oligo(dT16) primer 0.5 μg，总体积20 μl。逆转录条件为45 ℃ 60 min，99℃ 5 min和4℃ 5 min。 PCR 各成分浓度为dNTP 1 mmol/L、MgCl2 1 mmol/L、Taq酶2 U、引物各加2 μl， 总体积为50 μl。循环条件为：94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸45 s，循环30圈(PE 2400)。反应完毕，每管中加入溴酚蓝指示剂1 μl后上样，电泳完毕后，用即刻成像系统(GEL DOC 1000 BIO RAD)留取照片，并进行密度扫描，将K+通道的扩增产物密度值与内标的密度值相比，以比值计量。
, http://www.100md.com
1.6 统计学方法 试验结果用均数±标准差(
±s)表示，以单侧方差分析(ANOVA)检验组间差异，P<0.05有显著意义。2 结 果
2.1 给药组与空白组大鼠体重变化 无明显差异(P>0.05)(图1)。
图1 大鼠口服L-甲状腺素后体重变化
Figure 1 Body weight of rats after oral administration of L-thyroxin
2.2 给药组与对照组心脏体重比(cardiac index) 明显高于对照组(P<0.05)，血清T3浓度两组没有显著性差异，T4浓度试验组明显高于对照组(P<0.01)(图2)。
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图2 实验组与对照组口服L-甲状腺素后心脏指数及血浆T3，T4浓度(nmol/L)
Figure 2 The cardiac index and the plasma concentrations of T3,T4 after oral administration L-thyroxin (nmol/L)2.3 扩增循环数 为选定一个合适的扩增循环数，进行了不同循环次数实验(图3)。
图3 PCR 产物量与PCR循环次数的关系
Figure 3 PCR signals as a function of amount of total RNA and number of PCR cycles
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在36个循环以前，循环数与产物量(密度值)成正比，本实验选择循环数为30，确保产物量不受循环数影响，只与模板量相关。
2.4 PCR扩增产物条带 在上述条件下，PCR扩增产物条带清晰，无杂带干扰(图4)。
图4 RT-PCR法扩增大鼠心室肌钾通道及S16核糖体蛋白
Figure 4 RT-PCR products of K+ Channel and S16 from rat ventricle
2.5 K+通道mRNA表达改变 K+通道mRNA表达水平明显下降，试验组比对照组降低了42%(P<0.05)(图5)。
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3 讨 论
mRNA的测定是在分子水平上研究基因表达的常用方法，RT-PCR则以其灵敏度高(比杂交法高1 000～10 000倍)、专一性好、快速简单的特点，作为mRNA检定的方法日益得到认可[4]。用RT-PCR进行mRNA定量需解决两个关键问题：即引物与模板的结合效率和不同管扩增引起的“管效应”。用扩增动力学曲线寻找合适的扩增循环次数，可有效地避免因结合效率不同而引起的误差。内标与待检测物在同一管中扩增，可以克服“管效应”，以及随后样品处理所带来的误差，保证了方法的准确性。
图5 L-甲状腺素诱导心肌肥厚组与对照组心室中电压依从性钾通道mRNA表达
Figure 5 Representative comparison of cardiac K+ channel gene expression in ventricles of L-thyroxin-induced cardiac hypertrophy rats and in control rats
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L-甲状腺素能提高人体的基础代谢率，增强交感神经的活动，增加心率与心脏的负荷，由图1与图2结果可知，L-甲状腺素以1 mg/(kg.d)灌胃，可致大鼠心肌肥厚。 心肌肥厚易诱发心律失常，K+通道在心肌电生理中起着关键作用。本实验的结论认为：甲状腺素诱导的心肌肥厚模型K+通道mRNA表达降低，细胞膜上K+通道数量减少，导致钾电流减小。钾电流减小，使心肌细胞复极化时间延长，易致心律失常。
曹文(1963-),女,安徽桐城人,医学博士研究生,从事心血管药理研究.
参考文献：
[1] Rozanski G J, Xu Z, Zhang K, et al. Altered K+ current of ventricular myocytes in rats with chronic myocardial infarction[J]. Am J Physiol, 1998,274(Heart Circ. Physio.43):H259-H265.
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[2] Takimoto K, Li DQ，Hershman KH,et al. Decreased expression of Kv4.2 and novel Kv4.3 K+ channel subunit mRNAs in ventricles of renovascular hypertensive rats[J]. Circ Res, 1997,181(4):533-539.
[3] MadhaviGidh-Jain, Boyu Huang, Praveer Jain,et al.Differential expression of voltage-gated K+ channel genes in left ventricular remodeled myocardium after experimental myocardial infarction[J]. Circ Res, 1996,79(4),669-675.
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[4] Foley KP, Leonard MW, Engel JD. Quantitation of RNA using the polymerase chain reaction[J]. Trends Genet, 1993,9(11),380-385.
[5] Zahradka P, Harris KD, Triggs-Raine B,et al. PCR-based analysis of voltage-gated K+channels in vascular smooth muscle[J]. Mol Cell Biol, 1995,145,39-44.
收稿日期：1999-11-09, http://www.100md.com